توصيف معدلات المستقبلات المنشطة بالبروتياز باستخدام مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام قارئ الألواح

المستقبلات المنشطة بالبروتياز (PARs)^1،2،3 هي فصيلة فرعية من مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين من الفئة A G (GPCRs) التي يتم التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الصفائح الدموية والخلايا البطانية^4،5،6،7. على عكس غالبية GPCRs ، فإن PARs لها طريقة تنشيط فريدة داخل الجزيئات. يتم تنشيط معظم GPCRs عن طريق الروابط القابلة للذوبان التي تتفاعل مع جيب ربط مميز ، ولكن يتم تنشيط PARs عن طريق الانقسام المحلل للبروتين في N-terminus ، مما ينتج عنه رابط مربوط جديد يمكن أن يتفاعل مع مجال الحلقة 2 خارج الخلية على سطح الخلية^6،8،9. ينشط هذا التفاعل المستقبل ويمكنه بدء العديد من مسارات الإشارات ، مما يعزز التأثيرات مثل الالتهاب وتنشيط الصفائح الدموية^{4،10،11،12}. يمكن للبروتياز المختلفة تنشيط PARs من خلال الانقسام في مواقع فريدة على N-terminus ، مما يكشف عن روابط مربوطة مختلفة (TL) تعمل على استقرار توافقات المستقبلات ، والتي تبدأ مسارات إشارات مختلفة^{9،13،14،15}. على سبيل المثال ، في العضو الأكثر دراسة جيدا في الفصيلة الفرعية ، PAR1 ، يتم استخدام الانقسام بواسطة الثرومبين لدعم العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تنشيط الصفائح الدموية وتجنيد الكريات البيض إلى البطانة ، ولكن يمكن أن يؤدي إلى آثار ضارة عندما يتم التعبير عن المستقبل بشكل مفرط أو مفرط^{النشاط 4،16،17،18،19،20،21}. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي الانقسام بواسطة البروتين المنشط C (aPC) إلى تعزيز التأثيرات المضادة للالتهابات والحفاظ على الحواجز البطانية^{15،22،23،24،25،26،27،28،29}. يمكن أيضا تنشيط PARs عن طريق نظائر الببتيد في TLs بطريقة بين الجزيئات^13،30،31. تستخدم هذه الببتيدات بشكل روتيني لقياس تثبيط (تعديل) PAR بدلا من البروتياز الذي يستهدف PAR ، ويتم استخدامها في هذا البروتوكول.

ترتبط العديد من الاضطرابات بإشارات PAR1 المرضية ، بما في ذلك الإنتان^22،32 ، وأمراض القلب والأوعية الدموية^{33،34،35،36،37،38} ، وأمراض الكلى^{39،40،41،42} ، ومرض فقر الدم المنجلي⁴³ ، والتليف⁴⁴ ، وهشاشة العظام وهشاشة العظام^{45، 46} ، التنكس العصبي^{47،48،49،50،51} ، والسرطان^{52،53،54،55،56،57،58،59}. تمت دراسة مضادات PAR1 منذ تسعينيات القرن العشرين كعوامل مضادة للصفيحات لأمراض القلب والأوعية الدموية ، والقائمة المتزايدة من الأمراض المرتبطة بالمستقبل تستلزم تحديد روابط جديدة لاستخدامها كتحقيقات بيولوجية (مركبات أداة) أو كعلاجات محتملة. حاليا ، لا يوجد سوى مضاد PAR1 واحد معتمد من إدارة الغذاء والدواء ، vorapaxar ، والذي يستخدم لعلاج مرض الشريان التاجي في المرضى المعرضين لمخاطر عالية^{34،36،37،60}. أكمل مضاد بديل ل PAR1 ، pepducin PZ-128 ، دراسة المرحلة الثانية الناجحة لمنع تجلط الدم في مرضى قسطرة القلب³⁸. ركزت مجموعة Dockendorff على الكيمياء الطبية وعلم الأدوية لفئة منفصلة من الجزيئات الصغيرة ، روابط PAR1 المعروفة باسم parmodulins^61,62. على عكس مضادات PAR1 المبلغ عنها مثل vorapaxar ، فإن البارمودولين عبارة عن معدلات متحيزة ومتحيزة ل PAR1 تمنع بشكل انتقائي مسار G_αq مع تعزيز التأثيرات الواقية للخلايا المشابهة ل aPC. على عكس مضادات PAR1 التقويمية القوية مثل vorapaxar ، فإن البارمودولين المنشور يمكن عكسه أيضا^63،64،65.

في البداية ، تم تحديد البارمودولين من قبل Flaumenhaft وزملائه في العمل لقدرتهم على تثبيط تعبير P-selectin أو إفراز الحبيبات في الصفائح الدموية^61,66. ومع ذلك ، كانت هناك حاجة إلى طريقة بديلة لدراسة آثار البارمودولين على الخلايا البطانية. تتمثل إحدى الطرق الشائعة لمراقبة الإشارات المتعلقة ب GPCR في قياس تعبئة Ca²⁺ داخل الخلايا ، وهو رسول ثانوي مهم يمكن قياسه باستخدام صبغة مناسبة ملزمة للكالسيوم داخل الخلايا^67,68. تم تقديم أدلة جوهرية تبين أن تعبئة الكالسيوم التي يسببها PAR1 تتم من خلال تنشيط G_αq^69,70. بمجرد تنشيطه بواسطة ليجند مربوط (أو ليجند خارجي مناسب) ، يخضع PAR1 لتغيير توافقي يؤدي إلى استبدال ثنائي فوسفات الجوانوزين (GDP) المرتبط بالوحدة الفرعية G_αq بثلاثي فوسفات جوانوزين (GTP)⁶⁸. تقوم الوحدة الفرعية G_αq بعد ذلك بتنشيط فوسفوليباز Cβ (PLC-β) ، والذي يحفز التحلل المائي للفوسفاتيديلينوسيتول 4,5 ثنائي الفوسفات (PIP2) ، مكونا 1,4,5-إينوسيتول ثلاثي الفوسفات (IP₃) ودياسيلجليسرول (DAG). أخيرا ، يرتبط IP₃ بقنوات Ca²⁺ الحساسة ل IP₃ في غشاء الشبكة الإندوبلازمية ، مما يسمح بإطلاق Ca²⁺ في السيتوبلازم ، حيث يمكن أن يرتبط بالأصباغ الفلورية المعتمدة على Ca²⁺ ، مثل Fluo-4 ، التي تضاف إلى الخلايا⁷¹. تحدث هذه العملية في غضون ثوان ويمكن أن تزيد من تركيز الكالسيوم²⁺ 100 ضعف ، مما يؤدي إلى تغيير جذري في كمية الصبغة المرتبطة بالكالسيوم وإشارة مضان قوية.

في عام 2018 ، كشفت مجموعة Dockendorff عن اختبار تعبئة Ca²⁺ متوسط الإنتاجية يمكن استخدامه لتحديد خصوم مسار G_αq ل PAR1⁷². استخدم الفحص EA.hy926⁷³ ، وهو خط خلية بطانية بشرية هجينة ، والذي يمكن استخدامه لمقاطع متعددة دون تغيير ملحوظ في تعبير PAR1 ، ويتم إنشاؤه للقياسات المختبرية للتأثيرات الواقية للخلايا.

استخدم البروتوكول الأصلي خلايا EA.hy926 في 96 لوحة بئر ومحملة بصبغة Fluo-4 / AM ، والتي تم اختيارها بسبب مضانها الشديد عند 488 نانومتر ونفاذية الخلايا العالية. بمجرد تحميل الصبغة في الخلايا ، تم إجراء خطوات غسيل طويلة باستخدام معالج سائل آلي من 8 قنوات (لم يكن من الممكن الوصول إلى طرق أسرع للتعامل مع السوائل ، مثل غسالة 96 قناة). كانت قابلية استنساخ هذا الفحص متفوقة على ذلك دون تغييرات الوسائط الروبوتية الآلية الدقيقة. ثم تم تحضين المضادات بالخلايا ، وتم تنشيط PAR1 من خلال الإضافة المتسلسلة لناهض انتقائي (16 بئرا في المرة الواحدة) ، وتم قياس التغيرات في التألق الناتجة عن تعبئة الكالسيوم وربط الصبغة لتحديد النشاط.

في حين أن هذا البروتوكول يسمح بقياس تعبئة الكالسيوم بوساطة PAR1 ، إلا أنه محدود بالوقت اللازم لفحص كل لوحة 96 بئرا. تعتبر أوقات التجربة الطويلة مشكلة ليس فقط لأن عدد المركبات التي يمكن فحصها كل يوم محدود ، ولكن أيضا لأن تدفق الصبغة يحدث بمرور الوقت ، مما يضيق نافذة الفحص عن طريق زيادة التألق القاعدي. أحد المساهمين في وقت التجربة الطويل هو استخدام معالج سائل من 8 قنوات لغسل الألواح ، مما يضيف أكثر من 30 دقيقة لكل تجربة. كما أصبح من الصعب الحصول على النصائح المطلوبة بسبب مشاكل سلسلة التوريد. هنا تم الإبلاغ عن بروتوكول محدث لمقايسة تعبئة الكالسيوم بوساطة PAR والتي لا تتطلب معالج سائل ، وبالتالي يمكن تشغيلها في إنتاجية أعلى. يجب أن يكون هذا البروتوكول مناسبا أيضا لقياس الإشارات مع GPCRs الأخرى التي تؤدي إلى تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا. يعد بروتوكول قارئ الألواح المحدث هذا مثاليا للمختبرات الأكاديمية والصناعية الصغيرة التي لا تملك الموارد اللازمة لأدوات تصوير الخلايا باهظة الثمن ولكنها تحتاج إلى فحص العديد من المركبات بسرعة. للحصول على مثال على مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام جهاز تصوير اللوحة ، انظر Caers et ^al.74.