Caractérisation des modulateurs des récepteurs activés par la protéase à l’aide d’un test de mobilisation du calcium à l’aide d’un lecteur de plaques

Les récepteurs activés par la protéase (PAR)^1,2,3 sont une sous-famille de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A qui sont exprimés dans divers types de cellules, y compris les plaquettes et les cellules endothéliales ^4,5,6,7. Contrairement à la majorité des RCPG, les PAR ont un mode d’activation intramoléculaire unique. La plupart des RCPG sont activés par des ligands solubles interagissant avec une poche de liaison distincte, mais les PAR sont activés par le clivage protéolytique de l’extrémité N-terminale, ce qui se traduit par un nouveau ligand attaché qui peut interagir avec le domaine de la boucle extracellulaire 2 à la surface d’une cellule ^6,8,9. Cette interaction active le récepteur et peut initier plusieurs voies de signalisation, favorisant des effets tels que l’inflammation et l’activation plaquettaire 4,10,11,12. Différentes protéases peuvent activer les PAR par clivage à des sites uniques sur l’extrémité N-terminale, révélant différents ligands attachés (TL) qui stabilisent les conformations des récepteurs, qui initient différentes voies de signalisation ^9,13,14,15. Par exemple, chez le membre le mieux étudié de la sous-famille, PAR1, le clivage par la thrombine est utilisé pour soutenir de nombreux processus biologiques, y compris l’activation plaquettaire et le recrutement des leucocytes dans l’endothélium, mais peut entraîner des effets délétères lorsque le récepteur est surexprimé ou suractivé 4,16,17,18,19,20,21 . À l’inverse, le clivage par la protéine C activée (aPC) peut favoriser les effets anti-inflammatoires et le maintien des barrières endothéliales 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Les PAR peuvent également être activés par des analogues peptidiques des TL de manière intermoléculaire 13,30,31. Ces peptides sont couramment utilisés pour mesurer l’inhibition (modulation) de la PAR à la place des protéases ciblant la PAR, et ils sont utilisés dans ce protocole.

De nombreux troubles sont associés à la signalisation pathologique PAR1, notamment la septicémie^22,32, les maladies cardiovasculaires 33,34,35,36,37,38, les maladies rénales 39,40,41,42, la drépanocytose⁴³, la fibrose⁴⁴, l’ostéoporose et l’arthrose ^45,46, neurodégénérescence 47,48,49,50,51 et cancer 52,53,54,55,56,57,58,59 . Les antagonistes de PAR1 sont étudiés depuis les années 1990 en tant qu’agents antiplaquettaires pour les maladies cardiovasculaires, et la liste croissante de maladies associées au récepteur nécessite l’identification de nouveaux ligands à utiliser comme sondes biologiques (composés outils) ou comme traitements potentiels. À l’heure actuelle, il n’existe qu’un seul antagoniste de PAR1 approuvé par la FDA, le vorapaxar, qui est utilisé pour traiter les maladies coronariennes chez les patients à haut risque 34,36,37,60. Un antagoniste alternatif de PAR1, la pepducine PZ-128, a mené à bien une étude de phase II pour prévenir la thrombose chez les patients atteints de cathétérisme cardiaque³⁸. Le groupe Dockendorff s’est concentré sur la chimie médicinale et la pharmacologie d’une classe distincte de petites molécules, les ligands PAR1 connus sous le nom de parmodulines^61,62. Contrairement aux antagonistes de PAR1 tels que le vorapaxar, les parmodulines sont des modulateurs allostériques et biaisés de PAR1 qui bloquent sélectivement la voie G_αq tout en favorisant des effets cytoprotecteurs similaires à ceux de l’aPC. Contrairement aux antagonistes orthostériques puissants de PAR1 tels que le vorapaxar, les parmodulines publiées sont également réversibles 63,64,65.

Initialement, les parmodulines ont été identifiées par Flaumenhaft et ses collègues pour leur capacité à inhiber l’expression de la P-sélectine ou la sécrétion de granules dans les plaquettes^61,66. Cependant, une méthode alternative était nécessaire pour étudier les effets des parmodulines sur les cellules endothéliales. Une méthode courante pour surveiller la signalisation liée aux RCPG consiste à mesurer la mobilisation intracellulaire du Ca²⁺, un messager secondaire important qui peut être mesuré à l’aide d’un colorant de liaison au calcium intracellulaire approprié^67,68. Des preuves substantielles ont été fournies montrant que la mobilisation du calcium induite par PAR1 se fait par l’activation de G_αq^69,70. Une fois activé par son ligand attaché (ou un ligand exogène approprié), PAR1 subit un changement de conformation qui provoque le remplacement de la guanosine diphosphate (GDP) liée à la sous-unité G_αq par la guanosine triphosphate (GTP)⁶⁸. La sous-unité G_αq active ensuite la phospholipase Cβ (PLC-β), qui catalyse l’hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2), formant le 1,4,5-inositol triphosphate (IP₃) et le diacylglycérol (DAG). Enfin, l’IP₃ se lie aux canaux Ca²⁺ sensibles à l’IP₃ dans la membrane du réticulum endoplasmique, ce qui permet au Ca²⁺ d’être libéré dans le cytoplasme, où il peut se lier aux colorants fluorescents dépendants du Ca²⁺, tels que le Fluo-4, qui sont ajoutés aux cellules⁷¹. Ce processus se produit en quelques secondes et peut multiplier par 100 la concentration de Ca²⁺, ce qui entraîne un changement radical de la quantité de colorant lié au calcium et un signal de fluorescence robuste.

En 2018, le groupe Dockendorff a divulgué un test de mobilisation du Ca²⁺ à moyen débit qui pourrait être utilisé pour identifier les antagonistes de la voie G_αq de PAR1⁷². Le test a utilisé EA.hy926⁷³, une lignée cellulaire endothéliale humaine hybride, qui peut être utilisée pour plusieurs passages sans changement notable de l’expression de PAR1, et qui est établie pour les mesures in vitro des effets cytoprotecteurs.

Le protocole original utilisait des cellules EA.hy926 dans des plaques de 96 puits et chargées avec un colorant Fluo-4/AM, qui a été choisi en raison de sa fluorescence intense à 488 nm et de sa haute perméabilité cellulaire. Une fois le colorant chargé dans les cellules, de longues étapes de lavage ont été effectuées à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé à 8 canaux (les méthodes plus rapides de manipulation des liquides, telles qu’une laveuse à 96 canaux, étaient inaccessibles). La reproductibilité de ce test était supérieure à celle sans les changements de support robotisés minutieux et automatisés. Les antagonistes ont ensuite été incubés avec les cellules, PAR1 a été activé par l’ajout séquentiel d’un agoniste sélectif (16 puits à la fois), et les changements de fluorescence résultant de la mobilisation du calcium et de la liaison du colorant ont été mesurés pour déterminer l’activité.

Bien que ce protocole permette de mesurer la mobilisation du calcium médiée par PAR1, il est limité par le temps nécessaire pour analyser chaque plaque de 96 puits. Les longues durées d’expérience sont problématiques non seulement parce que le nombre de composés pouvant être criblés chaque jour est limité, mais aussi parce que l’efflux de colorant se produit au fil du temps, réduisant la fenêtre de test en augmentant la fluorescence basale. L’utilisation d’un manipulateur de liquide à 8 canaux pour le lavage des plaques, ce qui ajoute plus de 30 minutes à chaque expérience, contribue à la longue durée de l’expérience. Les pourboires requis sont également devenus difficiles à obtenir en raison de problèmes de chaîne d’approvisionnement. Ici, un protocole mis à jour pour le test de mobilisation du calcium médié par PAR, qui ne nécessite pas de manipulateur de liquides, et peut donc être exécuté à un débit plus élevé, est rapporté. Ce protocole devrait également convenir à la mesure de la signalisation avec d’autres RCPG qui conduisent à la mobilisation intracellulaire du calcium. Ce protocole de lecteur de plaques mis à jour est idéal pour les laboratoires universitaires et industriels qui ne disposent pas des ressources nécessaires pour des instruments d’imagerie cellulaire coûteux, mais qui ont besoin de cribler rapidement de nombreux composés. Pour un exemple d’essai de mobilisation du calcium à l’aide d’un imageur à plaque, voir Caers et ^al.74.