Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

I recettori attivati dalla proteasi (PAR)^1,2,3 sono una sottofamiglia di recettori accoppiati a proteine G di classe A (GPCR) espressi in una varietà di tipi di cellule, tra cui piastrine e cellule endoteliali ^4,5,6,7. A differenza della maggior parte dei GPCR, i PAR hanno una modalità di attivazione intramolecolare unica. La maggior parte dei GPCR sono attivati da ligandi solubili che interagiscono con una tasca di legame distinta, ma i PAR sono attivati dalla scissione proteolitica dell’N-terminale, che si traduce in un nuovo ligando legato che può interagire con il dominio extracellulare del loop 2 sulla superficie di una cellula ^6,8,9. Questa interazione attiva il recettore e può avviare diverse vie di segnalazione, promuovendo effetti come l’infiammazione e l’attivazione piastrinica 4,10,11,12. Diverse proteasi possono attivare le PAR attraverso la scissione in siti unici sull’N-terminale, rivelando diversi ligandi legati (TL) che stabilizzano le conformazioni dei recettori, che avviano diverse vie di segnalazione ^9,13,14,15. Ad esempio, nel membro più studiato della sottofamiglia, PAR1, la scissione da parte della trombina viene utilizzata per supportare numerosi processi biologici, tra cui l’attivazione piastrinica e il reclutamento dei leucociti nell’endotelio, ma può portare a effetti deleteri quando il recettore è sovraespresso o iperattivato 4,16,17,18,19,20,21 . Al contrario, la scissione da parte della proteina C attivata (aPC) può promuovere effetti antinfiammatori e il mantenimento delle barriere endoteliali 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Le PAR possono anche essere attivate da analoghi peptidici delle TL in modo intermolecolare 13,30,31. Questi peptidi sono abitualmente utilizzati per misurare l’inibizione (modulazione) della PAR al posto delle proteasi che hanno come bersaglio la PAR, e sono utilizzati in questo protocollo.

Numerosi disturbi sono associati alla segnalazione patologica di PAR1, tra cui sepsi^22,32, malattie cardiovascolari 33,34,35,36,37,38, malattie renali 39,40,41,42, anemia falciforme ⁴³, fibrosi⁴⁴, osteoporosi e osteoartrite^45,46, neurodegenerazione 47,48,49,50,51 e cancro 52,53,54,55,56,57,58,59. Gli antagonisti di PAR1 sono stati studiati a partire dagli anni ’90 come agenti antipiastrinici per le malattie cardiovascolari e la crescente lista di malattie associate al recettore richiede l’identificazione di nuovi ligandi da utilizzare come sonde biologiche (composti strumento) o come potenziali terapie. Attualmente, esiste un solo antagonista PAR1 approvato dalla FDA, vorapaxar, che viene utilizzato per trattare la malattia coronarica nei pazienti ad alto rischio 34,36,37,60. Un antagonista alternativo di PAR1, la pepducina PZ-128, ha completato con successo uno studio di fase II per prevenire la trombosi nei pazienti con cateterismo cardiaco³⁸. Il gruppo di Dockendorff si è concentrato sulla chimica farmaceutica e sulla farmacologia di una classe separata di piccole molecole, i ligandi PAR1 noti come parmoduline^61,62. A differenza degli antagonisti di PAR1 come vorapaxar, le parmoduline sono modulatori allosterici e distorti di PAR1 che bloccano selettivamente la via G_αq promuovendo effetti citoprotettivi simili all’aPC. A differenza dei potenti antagonisti ortosterici di PAR1 come il vorapaxar, anche le parmoduline pubblicate sono reversibili 63,64,65.

Inizialmente, le parmoduline sono state identificate da Flaumenhaft e collaboratori per la loro capacità di inibire l’espressione della P-selectina o la secrezione di granuli nelle piastrine^61,66. Tuttavia, era necessario un metodo alternativo per studiare gli effetti delle parmoduline sulle cellule endoteliali. Un metodo comune per monitorare la segnalazione correlata ai GPCR consiste nel misurare la mobilizzazione intracellulare del Ca²⁺, un importante messaggero secondario che può essere misurato utilizzando un colorante intracellulare adatto che lega il calcio^67,68. Sono state fornite prove sostanziali che dimostrano che la mobilizzazione del calcio indotta da PAR1 avviene attraverso l’attivazione di G_αq ^69,70. Una volta attivato dal suo ligando legato (o da un ligando esogeno adatto), PAR1 subisce un cambiamento conformazionale che fa sì che la guanosina difosfato (GDP) legata alla subunità G_αq venga sostituita dalla guanosina trifosfato (GTP)⁶⁸. La subunità G_αq attiva quindi la fosfolipasi Cβ (PLC-β), che catalizza l’idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato (PIP2), formando 1,4,5-inositolo trifosfato (IP₃) e diacilglicerolo (DAG). Infine, l’IP₃ si lega ai canali del Ca²⁺ sensibili all’IP₃ nella membrana del reticolo endoplasmatico, consentendo al Ca²⁺ di essere rilasciato nel citoplasma, dove può legarsi a coloranti fluorescenti dipendenti dal Ca²⁺, come il Fluo-4, che vengono aggiunti alle cellule⁷¹. Questo processo avviene in pochi secondi e può aumentare la concentrazione di Ca²⁺ di 100 volte, portando a un drastico cambiamento nella quantità di colorante legato al calcio e a un robusto segnale di fluorescenza.

Nel 2018, il gruppo di Dockendorff ha rivelato un test di mobilizzazione del Ca²⁺ a medio rendimento che potrebbe essere utilizzato per identificare gli antagonisti della via G_αq di PAR1⁷². Il test ha utilizzato EA.hy926⁷³, una linea cellulare endoteliale umana ibrida, che può essere utilizzata per passaggi multipli senza un cambiamento evidente nell’espressione di PAR1 ed è stabilita per misurazioni in vitro degli effetti citoprotettivi.

Il protocollo originale utilizzava celle EA.hy926 in piastre a 96 pozzetti e caricate con colorante Fluo-4/AM, che è stato scelto per la sua intensa fluorescenza a 488 nm e l’elevata permeabilità cellulare. Una volta che il colorante è stato caricato nelle celle, sono state eseguite lunghe fasi di lavaggio con un gestore di liquidi automatizzato a 8 canali (metodi più veloci di manipolazione dei liquidi, come una lavatrice a 96 canali, erano inaccessibili). La riproducibilità di questo test è stata superiore a quella senza le modifiche robotiche dei terreni attente e automatizzate. Gli antagonisti sono stati quindi incubati con le cellule, PAR1 è stato attivato attraverso l’aggiunta sequenziale di un agonista selettivo (16 pozzetti alla volta) e sono stati misurati i cambiamenti nella fluorescenza derivanti dalla mobilizzazione del calcio e dal legame con il colorante per determinare l’attività.

Sebbene questo protocollo consenta la misurazione della mobilizzazione del calcio mediata da PAR1, è limitato dal tempo necessario per analizzare ciascuna piastra a 96 pozzetti. I lunghi tempi di sperimentazione sono problematici non solo perché il numero di composti che possono essere sottoposti a screening ogni giorno è limitato, ma anche perché l’efflusso di colorante si verifica nel tempo, restringendo la finestra del saggio aumentando la fluorescenza basale. Un fattore che ha contribuito alla lunga durata dell’esperimento è l’uso di un gestore di liquidi a 8 canali per il lavaggio delle lastre, che aggiunge oltre 30 minuti a ciascun esperimento. Anche le mance richieste sono diventate difficili da ottenere a causa di problemi della catena di approvvigionamento. Qui viene riportato un protocollo aggiornato per il saggio di mobilizzazione del calcio mediato da PAR che non richiede un gestore di liquidi e quindi può essere eseguito in una produttività più elevata. Questo protocollo dovrebbe essere adatto anche per misurare la segnalazione con altri GPCR che portano alla mobilizzazione intracellulare del calcio. Questo protocollo di lettura di piastre aggiornato è ideale per i laboratori accademici e industriali di piccole dimensioni che non dispongono delle risorse per costosi strumenti di imaging cellulare, ma hanno la necessità di eseguire rapidamente lo screening di numerosi composti. Per un esempio di un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un imager su piastra, vedere Caers et ^al.74.