JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

Published: May 24, 2024
doi:
10.3791/66507
,
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry,Marquette University, 3School of Medicine,Washington University

Summary

פותח פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן עם תאי אנדותל, המשמש לזיהוי ליגנדות של קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). הפרוטוקול החדש מקצר את זמן הבדיקה הכולל ב-90-120 דקות ומניב עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור.

Abstract

שינויים בריכוז הסידן בתאים מנוטרים במהירות בתפוקה גבוהה באמצעות שימוש בצבעים תוך-תאיים, פלואורסצנטיים, קושרי סידן ומכשירי הדמיה שיכולים למדוד פליטות פלואורסצנטיות מעד 1,536 בארות בו זמנית. עם זאת, מכשירים אלה יקרים בהרבה ויכולים להיות מאתגרים לתחזוקה ביחס לקוראי לוחות זמינים באופן נרחב שסורקים בארות בנפרד. מתואר כאן מבחן קורא לוחות ממוטב לשימוש עם קו תאי אנדותל (EA.hy926) למדידת הפעלה מונעת קולטן המופעל על ידי פרוטאז (PAR) של איתות Gαq וניוד סידן לאחר מכן באמצעות הצבע קושר הסידן Fluo-4. בדיקה זו שימשה לאפיון מגוון ליגנדות PAR, כולל ליגנדות “פרמודולין” אנטי-דלקתיות אלוסטריות המכוונות ל-PAR1 שזוהו במעבדת דוקנדורף. פרוטוקול זה מייתר את הצורך בטיפול אוטומטי בנוזלים ומאפשר סינון בתפוקה בינונית של ליגנדות PAR בלוחות 96 בארות ואמור להיות ישים לחקר קולטנים אחרים היוזמים ניוד סידן.

Introduction

קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs)1,2,3 הם תת-משפחה של קולטנים מצומדים לחלבון G מסוג A (GPCRs) המתבטאים במגוון סוגי תאים, כולל טסיות דם ותאי אנדותל 4,5,6,7. שלא כמו רוב GPCRs, PARs יש מצב ייחודי intramolecular של הפעלה. רוב GPCRs מופעלים על ידי ליגנדות מסיסות, אינטראקציה עם כיס קישור נפרד, אבל PARs מופעלים על ידי מחשוף פרוטאוליטי של N-terminus, אשר גורם ליגנד קשור חדש שיכול לתקשר עם תחום לולאה חוץ-תאית 2 על פני השטח של תא 6,8,9. אינטראקציה זו מפעילה את הקולטן ויכולה ליזום מספר מסלולי איתות, המקדמים השפעות כגון דלקת והפעלת טסיות 4,10,11,12. פרוטאזות שונות יכולות להפעיל PARs באמצעות מחשוף באתרים ייחודיים על N-terminus, ולחשוף ליגנדות קשורות שונות (TL) המייצבות קונפורמציות קולטן, אשר יוזמות מסלולי איתות שונים 9,13,14,15. לדוגמה, בחבר הנחקר ביותר בתת-המשפחה, PAR1, מחשוף על ידי טרומבין משמש לתמיכה בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל הפעלת טסיות דם וגיוס לויקוציטים לאנדותל, אך יכול להוביל להשפעות מזיקות כאשר הקולטן מתבטא יתר על המידה או מופעל יתר על המידה 4,16,17,18,19,20,21 . לעומת זאת, מחשוף על ידי חלבון פעיל C (aPC) יכול לקדם השפעות אנטי דלקתיות ושמירה על מחסומי אנדותל 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs יכולים להיות מופעלים גם על ידי אנלוגים פפטידים של TLs באופן בין-מולקולרי 13,30,31. פפטידים אלה משמשים באופן שגרתי למדידת עיכוב PAR (אפנון) במקום פרוטאזות ממוקדות PAR, והם משמשים בפרוטוקול זה.

הפרעות רבות קשורות לאיתות PAR1 פתולוגי, כולל אלח דם22,32, מחלות לב וכלי דם 33,34,35,36,37,38, מחלת כליות 39,40,41,42, מחלת תאי מגל 43, פיברוזיס44, אוסטאופורוזיס ודלקת מפרקים ניוונית45,46, ניוון עצבי 47,48,49,50,51, וסרטן 52,53,54,55,56,57,58,59 . אנטגוניסטים של PAR1 נחקרו מאז 1990 כחומרים נוגדי טסיות למחלות לב וכלי דם, והרשימה ההולכת וגדלה של מחלות הקשורות לקולטן מחייבת זיהוי של ליגנדות חדשות לשימוש כבדיקות ביולוגיות (תרכובות כלים) או כטיפולים פוטנציאליים. נכון לעכשיו, יש רק אנטגוניסט PAR1 אחד שאושר על ידי ה- FDA, vorapaxar, המשמש לטיפול במחלת עורקים כליליים בחולים בסיכון גבוה 34,36,37,60. אנטגוניסט PAR1 חלופי, הפדוקין PZ-128, השלים מחקר פאזה II מוצלח למניעת פקקת בחולי צנתור לב38. קבוצת דוקנדורף התמקדה בכימיה רפואית ופרמקולוגיה של קבוצה נפרדת של מולקולות קטנות, ליגנדות PAR1 הידועות בשם פרמודולינים61,62. שלא כמו אנטגוניסטים מדווחים של PAR1 כגון vorapaxar, פרמודולינים הם מודולטורים אלוסטריים ומוטים של PAR1 החוסמים באופן סלקטיבי את מסלול Gαq תוך קידום השפעות ציטוטופרוטקטיביות בדומה ל-aPC. שלא כמו אנטגוניסטים אורתוסטריים חזקים PAR1 כגון vorapaxar, parmodulins שפורסמו הם גם הפיכים 63,64,65.

בתחילה, פרמודולינים זוהו על ידי Flaumenhaft ועמיתיו על יכולתם לעכב ביטוי P-selectin או הפרשת גרגירים בטסיות61,66. עם זאת, נדרשה שיטה חלופית כדי לחקור את ההשפעות של פרמודולינים על תאי אנדותל. שיטה נפוצה אחת לניטור איתות הקשור ל-GPCR היא מדידת ניוד Ca2+ תוך-תאי, שליח משני חשוב שניתן למדוד באמצעות צבע קושר סידן תוך-תאימתאים 67,68. ראיות משמעותיות הראו כי גיוס סידן המושרה על ידי PAR1 הוא באמצעות הפעלה של Gαq69,70. לאחר הפעלתו על ידי ליגנד קשור (או ליגנד אקסוגני מתאים), PAR1 עובר שינוי קונפורמטיבי הגורם לדיפוספט גואנוזין (GDP) הקשור לתת-היחידה Gαq להיות מוחלף בגואנוזין טריפוספט (GTP)68. תת-היחידה Gαq מפעילה פוספוליפאז Cβ (PLC-β), אשר מזרז את ההידרוליזה של פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט (PIP2), ויוצר טריפוספט 1,4,5-אינוסיטול (IP3) ודיאצילגליצרול (DAG). לבסוף, IP3 נקשר לתעלות Ca2+ רגישות ל-IP3 בממברנה של הרשתית האנדופלסמית, ומאפשר ל-Ca2+ להשתחרר לתוך הציטופלסמה, שם הוא יכול להיקשר לצבעים פלואורסצנטיים תלויי Ca2+, כגון Fluo-4, המתווספים לתאים71. תהליך זה מתרחש תוך שניות ויכול להעלות את הריכוז של Ca2+ פי 100, מה שמוביל לשינוי דרסטי בכמות הצבע הקשור לסידן ולאות פלואורסצנטי חזק.

בשנת 2018, קבוצת דוקנדורף חשפה בדיקת גיוס Ca2+ בתפוקה בינונית שניתן להשתמש בה כדי לזהות אנטגוניסטים של מסלול Gαq של PAR172. הבדיקה השתמשה ב- EA.hy92673, קו תאי אנדותל אנושי היברידי, שניתן להשתמש בו עבור מעברים מרובים ללא שינוי ניכר בביטוי PAR1, והוא נקבע למדידות חוץ גופיות של השפעות ציטוטופרוטקטיביות.

הפרוטוקול המקורי השתמש בתאי EA.hy926 בלוחות של 96 בארות ועמוס בצבע Fluo-4/AM, שנבחר בשל הפלואורסצנטיות האינטנסיבית שלו ב-488 ננומטר וחדירות תאים גבוהה. לאחר שהצבע הועמס לתוך התאים, שלבי שטיפה ארוכים בוצעו עם מטפל אוטומטי בנוזלים בן 8 ערוצים (שיטות מהירות יותר לטיפול בנוזלים, כגון מכונת כביסה בת 96 ערוצים, לא היו נגישות). יכולת השחזור של בדיקה זו הייתה עדיפה על זו ללא שינויי המדיה הרובוטיים האוטומטיים והזהירים. לאחר מכן הודגרו אנטגוניסטים עם התאים, PAR1 הופעל באמצעות הוספה רציפה של אגוניסט סלקטיבי (16 בארות בכל פעם), ונמדדו שינויים בפלואורסצנטיות שנבעו מניוד סידן וקשירת צבע כדי לקבוע פעילות.

בעוד פרוטוקול זה מאפשר מדידה של ניוד סידן בתיווך PAR1, הוא מוגבל על ידי הזמן הדרוש כדי להעריך כל צלחת 96 בארות. זמני ניסוי ארוכים הם בעייתיים לא רק בגלל שמספר התרכובות שניתן לבדוק בכל יום מוגבל, אלא גם בגלל שטף הצבע מתרחש לאורך זמן, מצמצם את חלון הבדיקה על ידי הגדלת הפלואורסצנטיות הבסיסית. אחד התורמים לזמן הניסוי הארוך הוא השימוש במטפל בנוזלים בעל 8 ערוצים לשטיפת צלחות, המוסיף מעל 30 דקות לכל ניסוי. גם הטיפים הנדרשים הפכו קשים להשגה בשל בעיות בשרשרת האספקה. כאן מדווח פרוטוקול מעודכן לבדיקת ניוד סידן בתיווך PAR, שאינו דורש מטפל בנוזלים, ולכן ניתן להריץ אותו בתפוקה גבוהה יותר. פרוטוקול זה צריך להתאים גם למדידת איתות עם GPCRs אחרים המובילים לניוד סידן תוך תאי. פרוטוקול קורא לוחות מעודכן זה אידיאלי עבור מעבדות אקדמיות ותעשייתיות קטנות שאין להן את המשאבים למכשירי דימות תאים יקרים, אך יש להן צורך לסנן במהירות תרכובות רבות. לדוגמה של בדיקת גיוס סידן באמצעות מצלמת צלחת, ראו Caers et al.74.

Protocol

כל חילופי המדיה/התוספות המבוצעים בשלבים 1 ו-2 של הפרוטוקול הבא מבוצעים במכסה מנוע סטרילי. אלא אם כן צוין אחרת, כל כלי הפלסטיק המשמשים במכסה המנוע הסטרילי חייבים להיות נרכשים, מעוקרים ואטומים או מעוקרים כראוי באמצעות autoclave. 1. הפעלת קו תאים EA.hy926 <li…

Representative Results

מטרת בדיקה זו היא בדרך כלל לייצר עקומות ריכוז-תגובה (CRC) עבור שלושה עד ארבעה פרמודולינים חדשים. על כל צלחת בדיקה, CRC נוסף עבור תרכובת ידועה, כגון NRD-21, נוצר לעתים קרובות המשמש כבדיקת איכות עבור הניסוי בשל IC50 הידוע שלה. כדי ליצור CRCs, יש לתכנן מפת לוחות כמו זו המתוארת ?…

Discussion

בעוד פרוטוקול72 שדווח בעבר היה אמין בדרך כלל ואפשר לנו לזהות פרמודולין עופרת חדש, NRD-21,62 היה רצוי פרוטוקול יעיל יותר. הבדיקה נפגעה עוד יותר במהלך המחסור באספקה שנגרם על ידי מגפת הקורונה. השגת טיפים עבור המטפל האוטומטי בנוזלים הפכה לקשה, והניסיון ל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לאיירין הרננדז, טרודי הוליסט, ד”ר הרטמוט ויילר (המכון לחקר הדם ורסיטי), וד”ר לגי ארנולד (אוניברסיטת ויסקונסין-מילווקי) על מתן מקום ותמיכה עקיפה לפרויקט זה, ולד”ר ג’ון מקורבי (המכללה הרפואית של ויסקונסין) על הייעוץ הרלוונטי. אנו מודים למכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R15HL127636), למשרד ההגנה של ארה”ב (W81XWH22101) ולקרן הלאומית למדע (2223225) על התמיכה במענקים.

Materials

Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells ATCC CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent Corning 25-056-CI Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 97068-091
Gelatin from porcine skin MilliporeSigma G2500 Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X) Corning 30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v) Corning 25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Thermo 172571000
Bovine serum albumin (BSA) Avantor 97061-420
Calcium chloride dihydrate Thermo 42352-0250
Dimethyl sulfoxide Thermo J66650-AD
Fluo-4/AM Invitrogen F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free) Corning 21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate MilliporeSigma M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407) Spectrum Chemical P1166
Probenecid TCI America P1975
Sodium hydroxide VWR International BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt) Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate Corning 3603 with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL Avantor 89039-664
Centrifuge tube, 50 mL Avantor 89039-656
Culture flask, T-75 Corning 353136 tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL Corning RES-V-50-S
Enspire plate reader Perkin Elmer Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL Avantor 20170-038
Pasteur pipette, 9" Fisher 13-678-6B must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips Avantor 76318-802
Pipette tips, 20 µL Biotix 63300042 sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL Biotix 63300044 sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL Biotix 63300047 sterile, filtered tips
Prism GraphPad volume 6 used
Serological pipette, 5 mL Tradewinds Direct  07-5005
Serological pipette, 10 mL Tradewinds Direct  07-5010
Serological pipette, 25 mL Tradewinds Direct  07-5025
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Tags

Calcium MobilizationPlate ReaderIntracellular CalciumFluorescent DyeFluo-4Protease-activated Receptor (PAR)G-protein SignalingEndothelial CellsEA.hy926PAR LigandsParmodulinHigh-throughput Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DeRousse, J. T., Dockendorff, C. Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader. J. Vis. Exp. (207), e66507, doi:10.3791/66507 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image