JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

Published: May 24, 2024
doi:
10.3791/66507
,
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry,Marquette University, 3School of Medicine,Washington University

Summary

Proteaz ile aktive edilmiş reseptörlerin (PAR’lar) ligandlarını tanımlamak için kullanılan endotel hücreleri ile bir kalsiyum mobilizasyon testi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiştir. Yeni protokol, toplam test süresini 90-120 dakika azaltır ve tekrarlanabilir konsantrasyon-yanıt eğrileri verir.

Abstract

Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, hücre içi, floresan, kalsiyum bağlayıcı boyalar ve aynı anda 1.536 kuyudan floresan emisyonlarını ölçebilen görüntüleme cihazlarının kullanılmasıyla yüksek verimli bir şekilde hızla izlenir. Bununla birlikte, bu cihazlar çok daha pahalıdır ve kuyuları ayrı ayrı tarayan yaygın olarak bulunan plaka okuyuculara göre bakımı zor olabilir. Burada tarif edilen, Gαq sinyalinin proteaz ile aktive edilen reseptör (PAR) güdümlü aktivasyonunu ve ardından kalsiyum bağlayıcı boya Fluo-4 kullanılarak kalsiyum mobilizasyonunu ölçmek için bir endotel hücre hattı (EA.hy926) ile kullanım için optimize edilmiş bir plaka okuyucu testidir. Bu test, Dockendorff laboratuvarında tanımlanan allosterik PAR1 hedefli anti-enflamatuar “parmodulin” ligandları dahil olmak üzere bir dizi PAR ligandını karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, otomatik bir sıvı işleyiciye olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve 96 oyuklu plakalarda PAR ligandlarının orta verimli taramasına izin verir ve kalsiyum mobilizasyonunu başlatan diğer reseptörlerin çalışmasına uygulanabilir olmalıdır.

Introduction

Proteaz ile aktive olan reseptörler (PAR’lar)1,2,3, trombositler ve endotel hücreleri 4,5,6,7 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde eksprese edilen A sınıfı G proteinine bağlı reseptörlerin (GPCR’ler) bir alt ailesidir. GPCR’lerin çoğundan farklı olarak, PAR’lar benzersiz bir molekül içi aktivasyon moduna sahiptir. Çoğu GPCR, farklı bir bağlanma cebi ile etkileşime giren çözünür ligandlar tarafından aktive edilir, ancak PAR’lar, N-terminalinin proteolitik bölünmesi ile aktive edilir, bu da bir hücre 6,8,9’un yüzeyindeki hücre dışı döngü 2 alanı ile etkileşime girebilen yeni bir bağlı ligand ile sonuçlanır. Bu etkileşim reseptörü aktive eder ve iltihaplanma ve trombosit aktivasyonugibi etkileri teşvik eden çeşitli sinyal yollarını başlatabilir 4,10,11,12. Farklı proteazlar, N-terminali üzerindeki benzersiz bölgelerde bölünme yoluyla PAR’ları aktive edebilir ve farklı sinyal yollarını başlatan reseptör konformasyonlarını stabilize eden farklı bağlı ligandları (TL) ortaya çıkarır 9,13,14,15. Örneğin, alt ailenin en iyi çalışılmış üyesi olan PAR1’de, trombin tarafından bölünme, trombosit aktivasyonu ve endotelyuma lökosit alımı dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik süreci desteklemek için kullanılır, ancak reseptör aşırı eksprese edildiğinde veya aşırı aktive edildiğinde zararlı etkilere yol açabilir 4,16,17,18,19,20,21 . Tersine, aktive protein C (aPC) ile bölünme, anti-enflamatuar etkileri ve endotel bariyerlerinin korunmasını teşvik edebilir 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR’lar ayrıca moleküller arası bir şekilde TL’lerin peptit analogları tarafından da aktive edilebilir 13,30,31. Bu peptitler, PAR hedefli proteazlar yerine PAR inhibisyonunu (modülasyon) ölçmek için rutin olarak kullanılır ve bu protokolde kullanılırlar.

Sepsis22,32, kardiyovasküler hastalık 33,34,35,36,37,38, böbrek hastalığı 39,40,41,42, orak hücre hastalığı43, fibroz44, osteoporoz ve osteoartrit45 dahil olmak üzere çok sayıda bozukluk patolojik PAR1 sinyali ile ilişkilidir,46, nörodejenerasyon 47,48,49,50,51 ve kanser 52,53,54,55,56,57,58,59. PAR1 antagonistleri, 1990’lardan beri kardiyovasküler hastalık için antiplatelet ajanlar olarak incelenmiştir ve reseptörle ilişkili hastalıkların artan listesi, biyolojik problar (alet bileşikleri) veya potansiyel terapötikler olarak kullanılmak üzere yeni ligandların tanımlanmasını gerektirmektedir. Şu anda, yüksek riskli hastalarda koroner arter hastalığını tedavi etmek için kullanılan FDA onaylı tek bir PAR1 antagonisti olan vorapaxar bulunmaktadır 34,36,37,60. Alternatif bir PAR1 antagonisti olan pepducin PZ-128, kalp kateterizasyonu hastalarında trombozu önlemek için başarılı bir faz II çalışmasını tamamladı38. Dockendorff grubu, parmodulinler 61,62 olarak bilinen ayrı bir küçük molekül sınıfı olan PAR1 ligandlarının tıbbi kimyası ve farmakolojisine odaklanmıştır. Vorapaxar gibi bildirilen PAR1 antagonistlerinin aksine, parmodulinler, aPC’ye benzer sitoprotektif etkileri teşvik ederken Gαq yolunu seçici olarak bloke eden PAR1’in allosterik, önyargılı modülatörleridir. Vorapaxar gibi güçlü ortosterik PAR1 antagonistlerinin aksine, yayınlanan parmodulinler de geri dönüşümlüdür 63,64,65.

Başlangıçta, parmodulinler Flaumenhaft ve meslektaşları tarafından trombositlerde P-selektin ekspresyonunu veya granül sekresyonunu inhibe etme yetenekleri nedeniyle tanımlandı61,66. Bununla birlikte, parmodulinlerin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için alternatif bir yöntem gerekliydi. GPCR ile ilgili sinyalleri izlemenin yaygın bir yöntemi, uygun bir hücre içi kalsiyum bağlayıcı boya67,68 kullanılarak ölçülebilen önemli bir ikincil haberci olan hücre içi Ca2+ mobilizasyonunu ölçmektir. PAR1 tarafından indüklenen kalsiyum mobilizasyonunun Gαq 69,70’in aktivasyonu yoluyla olduğunu gösteren önemli kanıtlar sağlanmıştır. Bağlı ligandı (veya uygun bir eksojen ligand) tarafından aktive edildikten sonra, PAR1, Gαq alt birimine bağlı guanozin difosfatın (GDP) guanozin trifosfat (GTP) ile değiştirilmesine neden olan konformasyonel bir değişikliğe uğrar.68. Gαq alt birimi daha sonra fosfatidilinositol 4,5 bifosfatın (PIP2) hidrolizini katalize eden ve 1,4,5-inositol trifosfat (IP3) ve diasilgliserol (DAG) oluşturan fosfolipaz Cβ’yı (PLC-β) aktive eder. Son olarak, IP3, endoplazmik retikulumun zarındaki IP3’e duyarlı Ca2+ kanallarına bağlanır ve Ca2+‘nın sitoplazmaya salınmasına izin verir, burada hücrelere eklenen Fluo-4 gibi Ca2+ bağımlı floresan boyalara bağlanabilir71. Bu işlem saniyeler içinde gerçekleşir ve Ca2+ konsantrasyonunu 100 kat artırabilir, bu da kalsiyuma bağlı boya miktarında ciddi bir değişikliğe ve sağlam bir floresan sinyaline yol açar.

2018’de Dockendorff grubu,PAR1 72’nin Gαq yolunun antagonistlerini tanımlamak için kullanılabilecek orta verimli bir Ca 2+ mobilizasyon testini açıkladı. Test, PAR926 ekspresyonunda gözle görülür bir değişiklik olmadan çoklu geçişler için kullanılabilen ve sitoprotektif etkilerin in vitro ölçümleri için kurulan hibrit bir insan endotel hücre hattı olan EA.hy731’ü kullandı.

Orijinal protokol, 96 oyuklu plakalarda EA.hy926 hücrelerini kullandı ve 488 nm’de yoğun floresansı ve yüksek hücre geçirgenliği nedeniyle seçilen Fluo-4 / boyası ile yüklendi. Boya hücrelere yüklendikten sonra, otomatik 8 kanallı bir sıvı işleyici ile uzun yıkama adımları gerçekleştirildi (96 kanallı yıkayıcı gibi daha hızlı sıvı işleme yöntemlerine erişilemiyordu). Bu testin tekrarlanabilirliği, dikkatli, otomatik robotik ortam değişiklikleri olmadan olandan daha üstündü. Antagonistler daha sonra hücrelerle inkübe edildi, PAR1, seçici bir agonistin (bir seferde 16 kuyucuk) sıralı ilavesi yoluyla aktive edildi ve aktiviteyi belirlemek için kalsiyum mobilizasyonu ve boya bağlanmasından kaynaklanan floresan değişiklikleri ölçüldü.

Bu protokol, PAR1 aracılı kalsiyum mobilizasyonunun ölçülmesine izin verirken, her 96 oyuklu plakayı test etmek için gereken süre ile sınırlıdır. Uzun deney süreleri, yalnızca her gün taranabilecek bileşiklerin sayısının sınırlı olması nedeniyle değil, aynı zamanda zamanla boya akışının meydana gelmesi ve bazal floresansı artırarak tahlil penceresini daraltması nedeniyle de sorunludur. Uzun deney süresine katkıda bulunanlardan biri, plaka yıkama için 8 kanallı bir sıvı işleyicinin kullanılmasıdır ve bu da her deneye 30 dakikadan fazla ekler. Tedarik zinciri sorunları nedeniyle gerekli ipuçlarının elde edilmesi de zorlaştı. Burada, sıvı bir işleyici gerektirmeyen ve bu nedenle daha yüksek verimde çalıştırılabilen PAR aracılı kalsiyum mobilizasyon testi için güncellenmiş bir protokol rapor edilmiştir. Bu protokol aynı zamanda hücre içi kalsiyum mobilizasyonuna yol açan diğer GPCR’lerle sinyalizasyonu ölçmek için de uygun olmalıdır. Bu güncellenmiş plaka okuyucu protokolü, pahalı hücre görüntüleme cihazları için kaynaklara sahip olmayan ancak çok sayıda bileşiği hızlı bir şekilde taraması gereken akademik ve küçük endüstriyel laboratuvarlar için idealdir. Bir plaka görüntüleyici kullanılarak yapılan bir kalsiyum mobilizasyon testi örneği için, Caers ve ark.74’e bakınız.

Protocol

Aşağıdaki protokolün 1. ve 2. adımlarında yapılan tüm medya değişimleri/eklemeleri steril bir başlıkta gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe, steril davlumbazda kullanılan tüm plastik malzemeler sterilize edilmiş ve mühürlenmiş olarak satın alınmalı veya otoklav yoluyla uygun şekilde sterilize edilmelidir. 1. EA.hy926 hücre hattının başlatılması EA.hy926 hücrelerini edinin. Hücre şişeleri…

Representative Results

Bu testin amacı genellikle üç ila dört yeni parmodulin için konsantrasyon-tepki eğrileri (CRC’ler) üretmektir. Her tahlil plakasında, NRD-21 gibi bilinen bir bileşik için genellikle ek bir CRC üretilir ve bu, bilinen IC50’si nedeniyle deney için bir kalite kontrolü görevi görür. CRC’leri oluşturmak için, Tablo 1’de gösterilen gibi bir plaka haritası planlanmalıdır. Bunun yerine tek noktalı konsantrasyon tepkileri isteniyorsa, 10 μM niha…

Discussion

Daha önce bildirilen protokol72 genellikle güvenilir ve yeni bir kurşun parmodulin tanımlamamıza izin verirken, NRD-21,62 daha verimli bir protokol istendi. Tahlil, COVID-19 salgınının neden olduğu tedarik sıkıntısı sırasında daha da tehlikeye girdi. Otomatik sıvı işleyici için uç almak zorlaştı ve uçları yıkamaya, sterilize etmeye ve yeniden kullanmaya çalışmak, önemli farklılıklarla CRC’ler üretti. Bu, geli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Kan Araştırma Enstitüsü) ve Dr. Leggy Arnold’a (Wisconsin-Milwaukee Üniversitesi) bu projeye yer sağladıkları ve dolaylı destek sağladıkları için ve Dr. John McCorvy’ye (Wisconsin Tıp Fakültesi) ilgili tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü’ne (R15HL127636), ABD Savunma Bakanlığı’na (W81XWH22101) ve Ulusal Bilim Vakfı’na (2223225) hibe desteği için teşekkür ederiz.

Materials

Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells ATCC CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent Corning 25-056-CI Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 97068-091
Gelatin from porcine skin MilliporeSigma G2500 Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X) Corning 30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v) Corning 25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Thermo 172571000
Bovine serum albumin (BSA) Avantor 97061-420
Calcium chloride dihydrate Thermo 42352-0250
Dimethyl sulfoxide Thermo J66650-AD
Fluo-4/AM Invitrogen F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free) Corning 21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate MilliporeSigma M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407) Spectrum Chemical P1166
Probenecid TCI America P1975
Sodium hydroxide VWR International BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt) Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate Corning 3603 with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL Avantor 89039-664
Centrifuge tube, 50 mL Avantor 89039-656
Culture flask, T-75 Corning 353136 tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL Corning RES-V-50-S
Enspire plate reader Perkin Elmer Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL Avantor 20170-038
Pasteur pipette, 9" Fisher 13-678-6B must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips Avantor 76318-802
Pipette tips, 20 µL Biotix 63300042 sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL Biotix 63300044 sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL Biotix 63300047 sterile, filtered tips
Prism GraphPad volume 6 used
Serological pipette, 5 mL Tradewinds Direct  07-5005
Serological pipette, 10 mL Tradewinds Direct  07-5010
Serological pipette, 25 mL Tradewinds Direct  07-5025
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Tags

Calcium MobilizationPlate ReaderIntracellular CalciumFluorescent DyeFluo-4Protease-activated Receptor (PAR)G-protein SignalingEndothelial CellsEA.hy926PAR LigandsParmodulinHigh-throughput Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DeRousse, J. T., Dockendorff, C. Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader. J. Vis. Exp. (207), e66507, doi:10.3791/66507 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image