Karakterisering van modulatoren van protease-geactiveerde receptoren met een calciummobilisatietest met behulp van een plaatlezer

Protease-geactiveerde receptoren (PAR’s)^1,2,3 zijn een subfamilie van klasse A G eiwitgekoppelde receptoren (GPCR’s) die tot expressie worden gebracht in verschillende celtypen, waaronder bloedplaatjes en endotheelcellen ^4,5,6,7. In tegenstelling tot de meeste GPCR’s hebben PAR’s een unieke intramoleculaire activeringswijze. De meeste GPCR’s worden geactiveerd door oplosbare liganden die interageren met een aparte bindingszak, maar PAR’s worden geactiveerd door de proteolytische splitsing van de N-terminus, wat resulteert in een nieuwe vastgebonden ligand die kan interageren met het extracellulaire lus 2-domein op het oppervlak van een cel ^6,8,9. Deze interactie activeert de receptor en kan verschillende signaalroutes initiëren, waardoor effecten zoals ontsteking en activering van bloedplaatjes worden bevorderd 4,10,11,12. Verschillende proteasen kunnen PAR’s activeren door splitsing op unieke plaatsen op de N-terminus, waardoor verschillende tethered liganden (TL) worden onthuld die receptorconformaties stabiliseren, die verschillende signaalroutes initiëren ^9,13,14,15. In het best bestudeerde lid van de subfamilie, PAR1, wordt splitsing door trombine bijvoorbeeld gebruikt om tal van biologische processen te ondersteunen, waaronder activering van bloedplaatjes en rekrutering van leukocyten naar het endotheel, maar kan leiden tot schadelijke effecten wanneer de receptor tot overexpressie wordt gebracht of overactiveerd 4,16,17,18,19,20,21 . Omgekeerd kan splitsing door geactiveerd proteïne C (aPC) ontstekingsremmende effecten en het behoud van endotheelbarrières bevorderen 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR’s kunnen ook op intermoleculaire wijze worden geactiveerd door peptide-analogen van de TL’s 13,30,31. Deze peptiden worden routinematig gebruikt om PAR-remming (modulatie) te meten in plaats van PAR-gerichte proteasen, en ze worden in dit protocol gebruikt.

Talrijke aandoeningen worden in verband gebracht met pathologische PAR1-signalering, waaronder sepsis^22,32, hart- en vaatziekten 33,34,35,36,37,38, nierziekte 39,40,41,42, sikkelcelziekte ⁴³, fibrose⁴⁴, osteoporose en artrose^45,46, neurodegeneratie 47,48,49,50,51 en kanker 52,53,54,55,56,57,58,59. Antagonisten van PAR1 zijn sinds de jaren 1990 bestudeerd als plaatjesaggregatieremmers voor hart- en vaatziekten, en de groeiende lijst van ziekten die verband houden met de receptor vereist de identificatie van nieuwe liganden voor gebruik als biologische sondes (gereedschapsverbindingen) of als potentiële therapieën. Momenteel is er slechts één door de FDA goedgekeurde PAR1-antagonist, vorapaxar, die wordt gebruikt voor de behandeling van coronaire hartziekte bij patiënten met een hoog risico 34,36,37,60. Een alternatieve PAR1-antagonist, de pepducine PZ-128, voltooide een succesvolle fase II-studie om trombose bij hartkatheterisatiepatiënten te voorkomen³⁸. De Dockendorff-groep heeft zich gericht op de medicinale chemie en farmacologie van een aparte klasse van kleine moleculen, PAR1-liganden die bekend staan als parmodulinen^61,62. In tegenstelling tot gerapporteerde PAR1-antagonisten zoals vorapaxar, zijn parmodulinen allosterische, bevooroordeelde modulatoren van PAR1 die selectief de G_αq-route blokkeren en cytoprotectieve effecten bevorderen die vergelijkbaar zijn met aPC. In tegenstelling tot krachtige orthosterische PAR1-antagonisten zoals vorapaxar, zijn gepubliceerde parmodulinen ook omkeerbaar 63,64,65.

Aanvankelijk werden parmodulinen geïdentificeerd door Flaumenhaft en collega’s voor hun vermogen om P-selectine-expressie of granulaatsecretie in bloedplaatjes te remmen ^61,66. Er was echter een alternatieve methode nodig om de effecten van parmodulinen op endotheelcellen te bestuderen. Een veelgebruikte methode om GPCR-gerelateerde signalering te monitoren, is het meten van intracellulaire Ca²⁺-mobilisatie, een belangrijke secundaire boodschapper die kan worden gemeten met behulp van een geschikte intracellulaire calciumbindende kleurstof^67,68. Er is substantieel bewijs geleverd dat aantoont dat calciummobilisatie geïnduceerd door PAR1 plaatsvindt door de activering van G_αq^69,70. Eenmaal geactiveerd door zijn gebonden ligand (of een geschikt exogeen ligand), ondergaat PAR1 een conformationele verandering die ervoor zorgt dat guanosinedifosfaat (GDP) gebonden aan de G_{αq-subeenheid} wordt vervangen door guanosinetrifosfaat (GTP)⁶⁸. De G_{αq-subeenheid} activeert vervolgens fosfolipase Cβ (PLC-β), dat de hydrolyse van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) katalyseert, waarbij 1,4,5-inositoltrifosfaat (IP₃) en diacylglycerol (DAG) worden gevormd. Ten slotte bindt IP₃ aan IP_3-gevoelige Ca²⁺-kanalen in het membraan van het endoplasmatisch reticulum, waardoor Ca²⁺ kan worden afgegeven aan het cytoplasma, waar het kan binden aan Ca²⁺-afhankelijke fluorescerende kleurstoffen, zoals Fluo-4, die aan de cellen worden toegevoegd⁷¹. Dit proces vindt binnen enkele seconden plaats en kan de concentratie van Ca²⁺ 100-voudig verhogen, wat leidt tot een drastische verandering in de hoeveelheid calciumgebonden kleurstof en een robuust fluorescentiesignaal.

In 2018 maakte de Dockendorff-groep een medium-throughput Ca²⁺ mobilisatietest bekend die zou kunnen worden gebruikt om antagonisten van de G_αq-route van PAR1⁷² te identificeren. De test gebruikte EA.hy926⁷³, een hybride menselijke endotheelcellijn, die voor meerdere passages kan worden gebruikt zonder een merkbare verandering in PAR1-expressie, en is vastgesteld voor in vitro metingen van cytoprotectieve effecten.

Het oorspronkelijke protocol gebruikte EA.hy926-cellen in platen met 96 putjes en geladen met Fluo-4/AM-kleurstof, die werd gekozen vanwege de intense fluorescentie bij 488 nm en de hoge celpermeabiliteit. Nadat de kleurstof in de cellen was geladen, werden lange wasstappen uitgevoerd met een geautomatiseerde 8-kanaals vloeistofverwerker (snellere methoden voor vloeistofbehandeling, zoals een 96-kanaals wasmachine, waren ontoegankelijk). De reproduceerbaarheid van deze test was superieur aan die zonder de zorgvuldige, geautomatiseerde robotische mediaveranderingen. Antagonisten werden vervolgens met de cellen geïncubeerd, PAR1 werd geactiveerd door de sequentiële toevoeging van een selectieve agonist (16 putjes per keer) en veranderingen in fluorescentie als gevolg van calciummobilisatie en kleurstofbinding werden gemeten om de activiteit te bepalen.

Hoewel dit protocol de meting van PAR1-gemedieerde calciummobilisatie mogelijk maakt, wordt het beperkt door de tijd die nodig is om elke plaat met 96 putjes te testen. Lange experimenteertijden zijn problematisch, niet alleen omdat het aantal verbindingen dat elke dag kan worden gescreend beperkt is, maar ook omdat kleurstofefflux in de loop van de tijd optreedt, waardoor het testvenster wordt verkleind door de basale fluorescentie te verhogen. Een van de bijdragen aan de lange experimenttijd is het gebruik van een 8-kanaals vloeistofhandler voor het wassen van borden, wat meer dan 30 minuten toevoegt aan elk experiment. De benodigde tips werden ook moeilijk te verkrijgen door problemen met de toeleveringsketen. Hier wordt een bijgewerkt protocol gerapporteerd voor de PAR-gemedieerde calciummobilisatietest waarvoor geen vloeistofverwerker nodig is en die daarom met een hogere doorvoer kan worden uitgevoerd. Dit protocol moet ook geschikt zijn voor het meten van signalering met andere GPCR’s die leiden tot intracellulaire calciummobilisatie. Dit bijgewerkte plaatlezerprotocol is ideaal voor academische en kleine industriële laboratoria die niet over de middelen beschikken voor dure celbeeldvormingsinstrumenten, maar die snel tal van verbindingen moeten screenen. Voor een voorbeeld van een calciummobilisatietest met behulp van een plaatimager, zie Caers et ^al.74.