PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

La maladie résiduelle minime (MRM) est le petit nombre de cellules cancéreuses qui sont encore présentes dans le corps après le traitement. En raison de leur petit nombre, ils n’entraînent aucun signe ou symptôme physique. Ils passent souvent inaperçus par les méthodes traditionnelles, telles que la visualisation microscopique et/ou le suivi des protéines sériques anormales dans le sang. Un résultat de test MRD positif indique la présence de cellules malades résiduelles. Un résultat négatif signifie qu’il n’y a pas de cellules malades résiduelles. Après le traitement du cancer, les cellules cancéreuses restantes dans le corps peuvent devenir actives et commencer à se multiplier, provoquant une rechute de la maladie. La détection de la MRM indique que le traitement n’a pas été complètement efficace ou qu’il était incomplet. Une autre raison des résultats positifs à la MRM après le traitement pourrait être que toutes les cellules cancéreuses n’ont pas répondu au traitement ou parce que les cellules cancéreuses sont devenues résistantes aux médicaments utilisés¹.

Le lymphome T angio-immunoblastique (AITL) est un sous-type de lymphome T périphérique (PTCL) dérivé des cellules T auxiliaires folliculaires² ; c’est le type le plus courant de lymphome à cellules T, représentant environ 15 à 20 % du PTCL³. Il s’agit d’un groupe de tumeurs malignes apparentées qui affectent le système lymphatique. La cellule d’origine est la cellule T auxiliaire folliculaire. La classification de l’OMS de 2016 le classe dans la catégorie Lymphome T angio-immunoblastique⁴. En 2022, l’OMS l’a renommé Lymphome ganglionnaire à cellules auxiliaires folliculaires T de type angio-immunoblastique (nTFHL-AI), ainsi que Lymphome ganglionnaire à cellules auxiliaires folliculaires T de type folliculaire (nTFHL-F) et Lymphome ganglionnaire à cellules auxiliaires T, non spécifié ailleurs (nTFHL-NOS), collectivement appelés lymphome T auxiliaire folliculaire nodulaire (nTFHL). Cela a été fait pour identifier ses caractéristiques cliniques et immunophénotypiques importantes ainsi que les signatures et les mutants similaires de l’expression du gène T follicular helper (TFH). Génétiquement, nTFHL-AI est caractérisé par l’acquisition progressive de mutations somatiques dans les cellules souches hématopoïétiques précoces par le biais de mutations TET2 et DNMT3A, tandis que les mutations RHOA et IDH2 sont également présentes dans les cellules tumorales TFH⁵. Plusieurs études ont montré que la mutation RHOA G17V se produit chez 50 à 80 % des patients atteints d’AITL 6,7,8,9. La protéine RHOA codée par le gène RHOA est activée par la liaison à la guanosine triphosphate (GTP) et inactivée par la liaison à la guanosine diphosphate (GDP). Lorsqu’il est activé, il peut se lier à une variété de protéines effectrices et réguler une variété de processus biologiques. Physiologiquement, RHOA médie la migration et la polarité des lymphocytes T, joue un rôle dans le développement des thymocytes et médie l’activation de la signalisation¹⁰ du récepteur pré-T des lymphocytes T (pré-TCR). La mutation RHOA G17V est une mutation de perte de fonction qui joue un rôle moteur dans la pathogenèse du lymphome¹¹. La détection de sa mutation à basse fréquence est utile pour le suivi de la MRM de l’AITL.

Le séquençage de Sanger est utilisé depuis plus de 40 ans comme référence pour la détection de mutations connues et inconnues. Cependant, sa limite de détection n’est que de 5 à 20 %, ce qui limite son application pour la détection des mutations à basse fréquence^12,13. Dans le séquençage de Sanger, la sensibilité de détection peut être réduite à 0,1 % en remplaçant la PCR traditionnelle par la BDA, une technologie de blocage sauvage¹⁴. La technologie BDA ajoute principalement une amorce dépareillée complémentaire au type mutant lors de la conception d’amorces conventionnelles pour concurrencer le type sauvage afin d’atteindre l’objectif d’amplifier le type mutant. La clé de la conception de l’amorce est l’amorce incohérente et la modification du terminal. Dans le même temps, selon le principe structurel de l’ADN, la différence entre l’énergie libre de Gibbs des deux amorces est comprise entre 0,8 kcal/mol et 5 kcal/mol. Une autre étape clé de cette technique consiste à supprimer l’amplification de type sauvage en ajustant le rapport entre les amorces de type sauvage et les amorces bloquantes^14,15.

À l’heure actuelle, les techniques courantes de détection des mutations somatiques à basse fréquence comprennent la PCR basée sur la PCR (réaction en chaîne par polymérase spécifique de l’allèle, ASPCR), la PCR du système de mutation réfractaire à l’amplification (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR) utilisée pour le génotypage des SNP à l’aide d’amorces réfractaires. La conception d’amorces pour les allèles mutants et normaux permet l’amplification sélective et la PCR numérique (Droplet Digital PCR, ddPCR), une méthode de PCR numérique basée sur la technologie des gouttelettes d’émulsion eau-huile¹⁶. Un échantillon est fractionné en 20 000 gouttelettes, et pour chaque gouttelette, une amplification PCR des molécules matrices est effectuée avec une sensibilité de 1 x ^10-5 ; l’amplification par déplacement de bloqueur (BDA) est également une méthode d’enrichissement d’allèles rares basée sur la PCR utilisée pour la détection et la quantification précises des SNV et des indels jusqu’à 0,01 % VAF dans un environnement hautement multiplexé ; La technologie des acides nucléiques verrouillés (acide nucléique verrouillé non extensible, LNA) est une classe d’analogues d’ARN de haute affinité dans laquelle le cycle ribose est verrouillé dans la conformation idéale pour la liaison Watson-Crick ; Les sondes spécifiques au point chaud (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP) chevauchent la séquence d’amorce cible, incluent une seule mutation et sont modifiées avec un espaceur C3 à ^{l’extrémité} C3′ pour empêcher l’amplification par qPCR 14,16,17,18. Lorsqu’une mutation dans la séquence existe, le HSSP se fixe de manière compétitive à la mutation cible et empêche l’amorce de se lier à la séquence mutante cible, ce qui arrête l’amplification de la séquence ; Le séquençage personnalisé du cancer par séquençage profond (CAAP-seq) basé sur le séquençage à haut débit (NGS next-generation sequencing) est une méthode basée sur le séquençage de nouvelle génération utilisée pour quantifier l’ADN circulant dans les cellules cancéreuses (sensibilité est de 1 x ^10-4) ; etc. Parmi eux, la plupart des méthodes sont basées sur la PCR et ne peuvent détecter qu’un petit nombre de sites de mutation, et les méthodes basées sur le NGS peuvent détecter plusieurs sites, mais le coût est élevé et le processus est compliqué 14,16,17,18. Des rapports ont fait état de la détection de mutations à basse fréquence de RHOA G17V sur la base de la qPCR, mais la limite de détection ne peut atteindre qu’environ 2 %¹⁹. Il n’existe aucun rapport sur la détection de la mutation basse fréquence RHOA G17V basée sur le séquençage de Sanger. Ici, nous démontrons l’augmentation de sensibilité obtenue par BDA, une PCR par blocs de type sauvage combinée au séquençage de Sanger, pour optimiser la détection des mutations somatiques à basse fréquence RHOA G17V, et la sensibilité de détection peut atteindre 0,5%. Des données supplémentaires pour IDH2 et JAK1 sont également fournies.

Cet article fournit un protocole détaillé du schéma de détection basse fréquence RHOA G17V par séquençage Sanger et fournit une référence pour le développement d’une détection de mutation à basse fréquence basée sur la plateforme de séquençage Sanger. Cette méthode peut être utilisée pour détecter et surveiller d’éventuelles mutations de résistance aux médicaments et des résidus minimaux dans les tumeurs.