Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Minimal residual disease (MRD) is het kleine aantal kankercellen dat na de behandeling nog in het lichaam aanwezig is. Vanwege hun kleine aantal leiden ze niet tot fysieke tekenen of symptomen. Ze worden vaak niet gedetecteerd door traditionele methoden, zoals microscopische visualisatie en/of het volgen van abnormale serumeiwitten in het bloed. Een MRD-positief testresultaat duidt op de aanwezigheid van resterende zieke cellen. Een negatief resultaat betekent dat er geen zieke cellen achterblijven. Na de behandeling van kanker kunnen de resterende kankercellen in het lichaam actief worden en zich gaan vermenigvuldigen, waardoor de ziekte terugvalt. Het detecteren van MRD is een indicatie dat de behandeling niet volledig effectief was of dat de behandeling onvolledig was. Een andere reden voor MRD-positieve resultaten na de behandeling kan zijn dat niet alle kankercellen reageerden op de therapie of omdat de kankercellen resistent werden tegen de gebruikte medicijnen^.

Angioimmunoblastisch T-cellymfoom (AITL) is een subtype van perifeer T-cellymfoom (PTCL) afgeleid van T-folliculaire helpercellen²; het is het meest voorkomende type T-cellymfoom, goed voor ongeveer 15%-20% van PTCL³. Het is een groep verwante maligniteiten die het lymfestelsel aantasten. De cel van oorsprong is de folliculaire T-helpercel. De WHO-classificatie van 2016 categoriseert het als angioimmunoblastisch T-cellymfoom⁴. In 2022 hernoemde de WHO het tot Nodaal T-folliculair helpercellymfoom, angioimmunoblastisch type (nTFHL-AI), samen met Nodaal T-folliculair helpercellymfoom, folliculair type (nTFHL-F) en Nodaal T-folliculair helpercellymfoom, niet anders gespecificeerd (nTFHL-NOS), gezamenlijk aangeduid als nodulair folliculair helper T-cellymfoom (nTFHL). Dit werd gedaan om de belangrijke klinische en immunofenotypische kenmerken en vergelijkbare T-folliculaire helper (TFH) genexpressiesignaturen en mutanten te identificeren. Genetisch gezien wordt nTFHL-AI gekenmerkt door de progressieve verwerving van somatische mutaties in vroege hematopoëtische stamcellen via TET2- en DNMT3A-mutaties, terwijl RHOA– en IDH2-mutaties ook aanwezig zijn in TFH-tumorcellen⁵. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat de RHOA G17V-mutatie voorkomt bij 50%-80% van de AITL-patiënten 6,7,8,9. Het RHOA-eiwit dat wordt gecodeerd door het RHOA-gen wordt geactiveerd door guanosinetrifosfaat (GTP)-binding en geïnactiveerd door guanosinedifosfaat (GDP)-binding. Wanneer het wordt geactiveerd, kan het zich binden aan een verscheidenheid aan effectoreiwitten en een verscheidenheid aan biologische processen reguleren. Fysiologisch gezien medieert RHOA de migratie en polariteit van T-cellen, speelt het een rol bij de ontwikkeling van thymocyten en bemiddelt het de activering van pre-T-celreceptor (pre-TCR)-signalering¹⁰. De RHOA G17V-mutatie is een mutatie met functieverlies die een drijvende rol speelt in de pathogenese van lymfoom¹¹. De detectie van de laagfrequente mutatie is nuttig voor de MRD-monitoring van AITL.

Sanger-sequencing wordt al meer dan 40 jaar gebruikt als de gouden standaard voor het detecteren van bekende en onbekende mutaties. De detectielimiet is echter slechts 5%-20%, wat de toepassing ervan voor detectie van laagfrequente mutaties beperkt^{tot 12,13}. Bij Sanger-sequencing kan de detectiegevoeligheid worden verlaagd tot 0,1% door de traditionele PCR te vervangen door BDA, een wild-blocking-technologie¹⁴. BDA-technologie voegt voornamelijk een niet-overeenkomende primer toe die complementair is aan het mutanttype bij het ontwerpen van conventionele primers om te concurreren met het wildtype om het doel van het versterken van het mutanttype te bereiken. De sleutel tot het ontwerp van de primer is de mismatch-primer en de terminalmodificatie. Tegelijkertijd ligt het verschil tussen de Gibbs-vrije energie van de twee primers volgens het structurele principe van DNA tussen 0,8 kcal/mol en 5 kcal/mol. Een andere belangrijke stap in deze techniek is het onderdrukken van wild-type versterking door de verhouding tussen wild-type en blokkerende primers aan te passen^14,15.

Op dit moment omvatten veelgebruikte laagfrequente somatische mutatiedetectietechnieken PCR-gebaseerde allelspecifieke PCR (allelspecifieke polymerasekettingreactie, ASPCR), amplificatie-refractair mutatiesysteem PCR (amplificatie-refractair mutatiesysteem-PCR, ARMS-PCR) die wordt gebruikt voor genotypering van SNP met behulp van vuurvaste primers. Het ontwerpen van primers voor de mutante en normale allelen maakt selectieve amplificatie en digitale PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR) mogelijk, een methode voor het uitvoeren van digitale PCR die is gebaseerd op water-olie-emulsiedruppeltechnologie¹⁶. Een monster wordt gefractioneerd in 20.000 druppeltjes en voor elke druppel wordt een PCR-amplificatie van de sjabloonmoleculen gedaan met een gevoeligheid van 1 x ^10-5; blocker displacement amplification (BDA) is ook een op PCR gebaseerde verrijkingsmethode voor zeldzame allels die wordt gebruikt voor nauwkeurige detectie en kwantificering van SNV’s en indels tot 0,01% VAF in een sterk gemultiplexte omgeving; vergrendelde nucleïnezuurtechnologie (niet-uitbreidbaar vergrendeld nucleïnezuur, LNA), is een klasse van RNA-analogen met hoge affiniteit waarin de ribosering is vergrendeld in de ideale conformatie voor Watson-Crick-binding; hotspot-specifieke sondes (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), overlappen de doelprimersequentie, bevatten een enkele mutatie en worden gemodificeerd met een C3-afstandhouder aan ^{het C3}‘-uiteinde om amplificatie door qPCR 14,16,17,18 te voorkomen. Wanneer er een mutatie in de sequentie bestaat, hecht de HSSP zich competitief aan de doelmutatie en voorkomt dat de primer zich bindt aan de doelmutantsequentie, waardoor de sequentieamplificatie stopt; NGS (next-generation sequencing) – op immunoglobuline high-throughput sequencing (igHTS) Kanker gepersonaliseerde profilering door diepe sequencing (CAAP-seq), het is een op sequencing gebaseerde methode van de volgende generatie die wordt gebruikt om circulerend DNA in kankercellen te kwantificeren (gevoeligheid is 1 x ^10-4); enz. Onder hen zijn de meeste methoden gebaseerd op PCR en kunnen ze slechts een klein aantal mutatieplaatsen detecteren, en de op NGS gebaseerde methoden kunnen meerdere plaatsen detecteren, maar de kosten zijn hoog en het proces is ingewikkeld 14,16,17,18. Er zijn meldingen gedaan over de detectie van RHOA G17V laagfrequente mutaties op basis van de qPCR, maar de detectielimiet kan slechts ongeveer 2% ^bereiken19. Er is geen rapport over de detectie van RHOA G17V laagfrequente mutatie op basis van Sanger-sequencing. Hier demonstreren we de toename van de gevoeligheid die wordt bereikt door BDA, een wildtype blok-PCR in combinatie met Sanger-sequencing, om de detectie van RHOA G17V laagfrequente somatische mutaties te optimaliseren, en de detectiegevoeligheid kan 0,5% bereiken. Aanvullende gegevens voor IDH2 en JAK1 worden ook verstrekt.

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol van het RHOA G17V-detectieschema voor lage frequenties door Sanger-sequencing en biedt een referentie voor de ontwikkeling van meer laagfrequente mutatiedetectie op basis van het Sanger-sequencingplatform. Deze methode kan worden gebruikt om mogelijke mutaties in resistentie tegen geneesmiddelen en minimale residuen in tumoren op te sporen en te monitoren.