تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر للكشف عن الطفرة الجسدية منخفضة التردد
Summary
تقدم هذه المقالة تطبيق طريقة الكشف منخفضة التردد على أساس تسلسل سانجر في سرطان الغدد الليمفاوية الوعائية. توفير أساس لتطبيق هذه الطريقة على الأمراض الأخرى.
Abstract
عند مراقبة الحد الأدنى المتبقي من المرض (MRD) بعد علاج الورم ، هناك متطلبات أعلى للحد الأدنى للكشف مقارنة بالكشف عن طفرات مقاومة الأدوية وطفرات الخلايا السرطانية المنتشرة أثناء العلاج. يحتوي تسلسل سانجر التقليدي على اكتشاف طفرة من النوع البري بنسبة 5٪ -20٪ ، لذلك لا يمكن أن يلبي حد اكتشافه المتطلبات المقابلة. تشمل تقنيات الحجب من النوع البري التي تم الإبلاغ عنها للتغلب على هذا تضخيم إزاحة المانع (BDA) ، والحمض النووي المقفل غير القابل للتمديد (LNA) ، والمجسات الخاصة بالنقاط الساخنة (HSSP) ، وما إلى ذلك. تستخدم هذه التقنيات تسلسلات قليلة النوكليوتيدات المحددة لمنع النوع البري أو التعرف على النوع البري ثم دمج هذا مع طرق أخرى لمنع تضخيم النوع البري وتضخيم التضخيم الطافر ، مما يؤدي إلى خصائص مثل الحساسية العالية والمرونة والراحة. يستخدم هذا البروتوكول BDA ، وهو تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر ، لتحسين الكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد RHOA G17V ، ويمكن أن تصل حساسية الكشف إلى 0.5٪ ، والتي يمكن أن توفر أساسا لمراقبة MRD لسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية الوعائية.
Introduction
الحد الأدنى من المرض المتبقي (MRD) هو عدد قليل من الخلايا السرطانية التي لا تزال موجودة في الجسم بعد العلاج. نظرا لقلة عددهم ، فإنها لا تؤدي إلى أي علامات أو أعراض جسدية. غالبا ما لا يتم اكتشافها بالطرق التقليدية ، مثل التصور المجهري و / أو تتبع بروتينات المصل غير الطبيعية في الدم. تشير نتيجة اختبار MRD الإيجابية إلى وجود خلايا مريضة متبقية. النتيجة السلبية تعني أن الخلايا المريضة المتبقية غائبة. علاج ما بعد السرطان ، يمكن أن تصبح الخلايا السرطانية المتبقية في الجسم نشطة وتبدأ في التكاثر ، مما يتسبب في انتكاسة المرض. يشير اكتشاف MRD إلى أن العلاج لم يكن فعالا تماما أو أن العلاج لم يكن مكتملا. قد يكون السبب الآخر للنتائج الإيجابية ل MRD بعد العلاج هو عدم استجابة جميع الخلايا السرطانية للعلاج أو لأن الخلايا السرطانية أصبحت مقاومة للأدوية المستخدمة1.
سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية المناعية الوعائية (AITL) هو نوع فرعي من سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية المحيطية (PTCL) مشتق من الخلايا التائية المساعدة2. إنه النوع الأكثر شيوعا من سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية ، وهو ما يمثل حوالي 15٪ -20٪ من PTCL3. إنها مجموعة من الأورام الخبيثة ذات الصلة التي تؤثر على الجهاز اللمفاوي. الخلية الأصلية هي الخلية التائية المساعدة الجريبية. يصنفه تصنيف منظمة الصحة العالمية لعام 2016 على أنه سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائيةالمناعية الوعائية 4. في عام 2022 ، أعادت منظمة الصحة العالمية تسميته باسم سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا المساعدة العقدية T ، والنوع المناعي الوعائي (nTFHL-الذكاء الاصطناعي) ، جنبا إلى جنب مع سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا المساعدة العقدية T ، والنوع الجريبي (nTFHL-F) وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا المساعدة العقدية التائية ، غير المحددة بطريقة أخرى (nTFHL-NOS) ، والتي يشار إليها مجتمعة باسم سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية المساعدة الجريبية العقدية (nTFHL). وقد تم ذلك لتحديد سماته السريرية والمناعية الهامة وتوقيعات التعبير الجيني المساعد T (TFH) والطفرات. وراثيا ، يتميز nTFHL-الذكاء الاصطناعي بالاستحواذ التدريجي للطفرات الجسدية في الخلايا الجذعية المكونة للدم المبكرة من خلال طفرات TET2 و DNMT3A ، بينما توجد طفرات RHOA و IDH2 أيضا في الخلايا السرطانية TFH5. أظهرت العديد من الدراسات أن طفرة RHOA G17V تحدث في 50٪ -80٪ من مرضى AITL6،7،8،9. يتم تنشيط بروتين RHOA المشفر بواسطة جين RHOA عن طريق ربط جوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) ويتم تعطيله بواسطة ربط ثنائي فوسفات الجوانوزين (GDP). عند تنشيطه ، يمكن أن يرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات المستجيبة وينظم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. من الناحية الفسيولوجية ، يتوسط RHOA هجرة الخلايا التائية وقطبية ، ويلعب دورا في تطور الخلايا الصعترية ، ويتوسط تنشيط إشارات مستقبلات الخلايا التائية السابقة (ما قبل TCR)10. طفرة RHOA G17V هي طفرة فقدان الوظيفة التي تلعب دورا دافعا في التسبب في سرطان الغدد الليمفاوية11. يعد اكتشاف طفرة التردد المنخفض مفيدا لمراقبة MRD ل AITL.
تم استخدام تسلسل سانجر لأكثر من 40 عاما كمعيار ذهبي للكشف عن الطفرات المعروفة وغير المعروفة. ومع ذلك ، فإن حد اكتشافه هو 5٪ -20٪ فقط ، مما يحد من تطبيقه للكشف عن الطفرات منخفضة التردد12,13. في تسلسل سانجر ، يمكن تقليل حساسية الكشف إلى 0.1٪ عن طريق استبدال تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ب BDA ، وهي تقنية حظر البرية14. تضيف تقنية BDA بشكل أساسي برايمر غير متطابق مكمل للنوع الطافر عند تصميم الاشعال التقليدية للتنافس مع النوع البري وذلك لتحقيق الغرض من تضخيم النوع الطافر. مفتاح تصميم التمهيدي هو التمهيدي غير المتطابق والتعديل الطرفي. في الوقت نفسه ، وفقا للمبدأ الهيكلي للحمض النووي ، فإن الفرق بين طاقة جيبس الحرة للبادئين يتراوح بين 0.8 كيلو كالوري / مول و 5 كيلو كالوري / مول. خطوة رئيسية أخرى في هذه التقنية هي قمع التضخيم من النوع البري عن طريق ضبط نسبة البادئات من النوع البري وحظر14,15.
في الوقت الحاضر ، تشمل تقنيات الكشف عن الطفرات الجسدية الشائعة منخفضة التردد تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل ، ASPCR) ، ونظام الطفرات المقاومة للتضخيم PCR (نظام الطفرات المقاومة للتضخيم – PCR ، ARMS-PCR) المستخدم في التنميط الجيني SNP بمساعدة الاشعال المقاومة للحرارة. يسمح تصميم البادئات للأليلات الطافرة والعادية بالتضخيم الانتقائي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (Droplet Digital PCR ، ddPCR) ، وهي طريقة لأداء تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي الذي يعتمد على تقنية قطرات مستحلب الماءوالزيت 16. يتم تجزئة العينة إلى 20000 قطرة ، ولكل قطرة ، يتم تضخيم PCR لجزيئات القالب بحساسية 1 × 10-5 ؛ تضخيم إزاحة المانع (BDA) هو أيضا طريقة تخصيب أليل نادرة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل تستخدم للكشف الدقيق والقياس الكمي ل SNVs و indels وصولا إلى 0.01٪ VAF في بيئة متعددة الإرسال ؛ تقنية الحمض النووي المقفلة (الحمض النووي المقفل غير القابل للتمديد ، LNA) ، هي فئة من نظائر الحمض النووي الريبي عالية التقارب حيث يتم قفل حلقة الريبوز في التشكل المثالي لربط Watson-Crick ؛ تتداخل المجسات الخاصة بالنقاط الساخنة (المسبار الخاص بالنقاط الساخنة ، HSSP) ، مع تسلسل التمهيدي المستهدف ، وتتضمن طفرة واحدة ، ويتم تعديلها باستخدام فاصل C3 في نهاية C3 لمنع التضخيم بواسطة qPCR14،16،17،18. عند وجود طفرة في التسلسل ، يرتبط HSSP بشكل تنافسي بالطفرة المستهدفة ويمنع التمهيدي من الارتباط بالتسلسل الطافر المستهدف الذي يوقف تضخيم التسلسل ؛ NGS (تسلسل الجيل التالي) – تسلسل عالي الإنتاجية للغلوبولين المناعي القائم (igHTS) التنميط الشخصي للسرطان عن طريق التسلسل العميق (CAAP-seq) ، وهي طريقة قائمة على التسلسل من الجيل التالي تستخدم لتحديد كمية الحمض النووي المتداول في الخلايا السرطانية (الحساسية هي 1 × 10-4) ؛ الخ. من بينها ، تعتمد معظم الطرق على تفاعل البوليميراز المتسلسل ويمكنها فقط اكتشاف عدد صغير من مواقع الطفرات ، ويمكن للطرق القائمة على NGS اكتشاف مواقع متعددة ، لكن التكلفة مرتفعة ، والعملية معقدة14،16،17،18. كانت هناك تقارير حول اكتشاف طفرات التردد المنخفض RHOA G17V بناء على qPCR ، لكن حد الكشف يمكن أن يصل فقط إلى حوالي 2٪ 19. لا يوجد تقرير عن اكتشاف طفرة التردد المنخفض RHOA G17V بناء على تسلسل سانجر. هنا ، نوضح الزيادة في الحساسية التي حققتها BDA ، وهي كتلة PCR من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر ، لتحسين الكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد RHOA G17V ، ويمكن أن تصل حساسية الكشف إلى 0.5٪. كما يتم توفير بيانات إضافية ل IDH2 و JAK1 .
توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لمخطط الكشف عن التردد المنخفض RHOA G17V بواسطة تسلسل سانجر وتوفر مرجعا لتطوير المزيد من الكشف عن الطفرات منخفضة التردد بناء على منصة تسلسل سانجر. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن الطفرات المحتملة لمقاومة الأدوية ومراقبتها والحد الأدنى من المخلفات في الأورام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم WTB-PCR المستند إلى تقنية BDA ، الموصوف في هذه المقالة ، برايمر غير متطابق مكمل للنوع الطافر عند تصميم الأوائل التقليدية للتنافس مع النوع البري ، وقمع النوع البري ، وتضخيم المنتج الطافر. بعد ذلك ، تم تسلسل منتجات WTB-PCR لتحليل الطفرة. فائدة WTB-PCR / Sanger هي بساطته وحساسيته العا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الانتهاء من هذا البحث بدعم مالي من شركة Kindstar Global Corporation وبمساعدة قادة مختبر البيولوجيا الجزيئية والزملاء ذوي الصلة. شكرا للشركة والقادة والزملاء المعنيين على دعمهم ومساعدتهم. تستخدم هذه المقالة فقط للبحث العلمي ولا تشكل أي نشاط تجاري.
Materials
| Automatic DNA extractor | 9001301 | Qiagen | |
| DNA nucleic acid detector | Q32854 | Thermo fisher | |
| PCR amplification kit | P4600 | merck | |
| PCR instrument | C1000 Touch | Biorad | |
| proteinase K solution | D3001-2-A | zymo research | |
| proteinase K storage buffer | D3001-2-C | zymo research | |
| Sequencing amplification enzyme kit | P7670-FIN | Qiagen |
References
- Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD) Available from: https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019)
- Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).
- Mariko, Y., et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).
- Daniel, A. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Rita, A., et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms. Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).
- Hae, Y. Y., et al. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).
- Lee, P. H., et al. RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment. Exp Mol Pathol. 110, 104294 (2019).
- Mamiko, S. Y., et al. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).
- Palomero, T., et al. Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).
- Fujisawa, M., et al. Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).
- Voena, C., et al. RHO family GTPases in the biology of lymphoma. Cells. 8 (7), 646 (2019).
- Shendure, J., et al. DNA sequencing an 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
- Athanasios, C. T., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).
- Wu, L. R., et al. Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification. Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).
- John, S. J., et al. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).
- Coren, A. M., et al. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Eliza, M. L., et al. Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research. Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).
- Lee, H. J., et al. Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Biosensors. 12 (8), 597 (2022).
- Matsubara, R. N., et al. Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR. PLoS One. 9 (10), e109714 (2014).
- Dieffenbach, C. W., et al. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
.