חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

מחלה שיורית מינימלית (MRD) היא המספר הקטן של תאים סרטניים שעדיין נמצאים בגוף לאחר הטיפול. בשל מספרם הקטן, הם אינם מובילים לסימנים או תסמינים פיזיים כלשהם. לעתים קרובות הם אינם מזוהים בשיטות מסורתיות, כגון הדמיה מיקרוסקופית ו / או מעקב אחר חלבונים חריגים בסרום בדם. תוצאת בדיקת MRD חיובית מצביעה על נוכחות של תאים חולים שיורית. תוצאה שלילית פירושה כי תאים חולים שיורית נעדרים. לאחר טיפול סרטני, התאים הסרטניים הנותרים בגוף יכולים להיות פעילים ולהתחיל להתרבות, גרימת הישנות המחלה. גילוי MRD מעיד על כך שהטיפול לא היה יעיל לחלוטין או שהטיפול לא היה שלם. סיבה נוספת לתוצאות MRD חיוביות לאחר הטיפול עשויה להיות שלא כל התאים הסרטניים הגיבו לטיפול או מכיוון שהתאים הסרטניים הפכו עמידים לתרופות המשמשות¹.

לימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T (באנגלית: Angioimmunoblastic T-cell lymphoma או AITL) היא תת-סוג של לימפומה היקפית של תאי T פוליקולריים (PTCL) שמקורה בתאי עזר פוליקולריים^{מסוג T 2}; זהו הסוג הנפוץ ביותר של לימפומה של תאי T, המהווה כ 15%-20% של PTCL³. זוהי קבוצה של ממאירויות הקשורות המשפיעות על מערכת הלימפה. תא המקור הוא תא עוזר T פוליקולרי. סיווג 2016 של ארגון הבריאות העולמי מסווג אותו כלימפומה אנגיואימונובלסטית של תאי T⁴. בשנת 2022, ארגון הבריאות העולמי שינה את שמו ללימפומה של תאי עוזר T-follicular Nodal, מסוג אנגיואימונובלסטי (nTFHL-AI), יחד עם לימפומה של תאי עוזר T-follicular Nodal, סוג פוליקולרי (nTFHL-F) ולימפומה של תאי עוזר T-follicular Nodal, שלא צוין אחרת (nTFHL-NOS), המכונים ביחד לימפומה של תאי T מסייעים פוליקולרית נודולרית (nTFHL). זה נעשה כדי לזהות את התכונות הקליניות והאימונופנוטיפיות החשובות שלו וחתימות ביטוי גנים ומוטציות דומות של עוזר זקיקי T (TFH). מבחינה גנטית, nTFHL-AI מאופיין ברכישה מתקדמת של מוטציות סומטיות בתאי גזע המטופויטיים מוקדמים באמצעות מוטציות TET2 ו- DNMT3A, בעוד שמוטציות RHOA ו- IDH2 קיימות גם בתאי גידול TFH⁵. מספר מחקרים הראו כי מוטציית RHOA G17V מתרחשת ב 50%-80% מחולי AITL 6,7,8,9. חלבון RHOA המקודד על ידי הגן RHOA מופעל על ידי קישור גואנוזין טריפוספט (GTP) ומנוטרל על ידי קישור גואנוזין דיפוספט (GDP). כאשר הוא מופעל, הוא יכול להיקשר למגוון חלבונים משפיעים ולווסת מגוון תהליכים ביולוגיים. מבחינה פיזיולוגית, RHOA מתווך נדידה וקוטביות של תאי T, ממלא תפקיד בהתפתחות תימוציטים, ומתווך הפעלה של איתות קולטן תא קדם-T (pre-TCR)¹⁰. מוטציית RHOA G17V היא מוטציה של אובדן תפקוד הממלאת תפקיד מניע בפתוגנזה של לימפומה¹¹. זיהוי המוטציה בתדר נמוך מועיל לניטור MRD של AITL.

ריצוף סנגר משמש כבר יותר מ-40 שנה כתקן הזהב לאיתור מוטציות ידועות ולא ידועות. עם זאת, מגבלת הגילוי שלו היא רק 5%-20%, מה שמגביל את היישום שלו לגילוי מוטציות בתדר נמוך^12,13. בריצוף סנגר ניתן להפחית את רגישות הזיהוי ל-0.1% על ידי החלפת ה-PCR המסורתי ב-BDA, טכנולוגיית חסימה פראית¹⁴. טכנולוגיית BDA מוסיפה בעיקר פריימר לא תואם המשלים את הסוג המוטנטי בעת תכנון פריימרים קונבנציונליים כדי להתחרות בסוג הפראי כדי להשיג את המטרה של הגברת הסוג המוטנטי. המפתח לעיצוב פריימר הוא פריימר לא תואם ושינוי הטרמינל. יחד עם זאת, על פי העיקרון המבני של הדנ”א, ההבדל בין האנרגיה החופשית של גיבס של שני הפריימרים הוא בין 0.8 קק”ל/מול לבין 5 קק”ל/מול. צעד מפתח נוסף בטכניקה זו הוא דיכוי הגברה מסוג פרא על ידי התאמת היחס בין פריימרים מסוג פרא וחסימת פריימרים^14,15.

כיום, טכניקות נפוצות לזיהוי מוטציות סומטיות בתדר נמוך כוללות PCR ספציפי לאלל מבוסס PCR (תגובת שרשרת פולימראז ספציפית לאלל, ASPCR), מערכת מוטציות עמידה להגברה PCR (מערכת מוטציות עקשנית להגברה-PCR, ARMS-PCR) המשמשת לגנוטיפ SNP בעזרת פריימרים עקשנים. תכנון פריימרים לאללים המוטנטיים והנורמליים מאפשר הגברה סלקטיבית ו-PCR דיגיטלי (Droplet Digital PCR, ddPCR), שיטה לביצוע PCR דיגיטלי המבוססת על טכנולוגיית תחליב טיפות מים-שמן¹⁶. הדגימה מחולקת ל-20,000 טיפות, ועבור כל טיפה, הגברה PCR של מולקולות התבנית נעשית ברגישות של 1 x ^10-5; הגברה של תזוזה חוסמת (BDA) היא גם שיטת העשרת אללים נדירים מבוססת PCR המשמשת לזיהוי וכימות מדויקים של SNV ואינדלים עד 0.01% VAF בסביבה מרובבת מאוד; טכנולוגיית חומצות גרעין נעולות (באנגלית: Locked Nucleic Acid Technology, LNA) היא סוג של אנלוגים של RNA בעלי זיקה גבוהה שבהם טבעת הריבוז נעולה בקונפורמציה האידיאלית לקשירת ווטסון-קריק; גשושיות ספציפיות לנקודה חמה (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), חופפות את רצף פריימר המטרה, כוללות מוטציה יחידה, ומשנות עם מרווח C3 בקצה C3^‘ כדי למנוע הגברה על ידי qPCR 14,16,17,18. כאשר קיימת מוטציה ברצף, HSSP מתחבר באופן תחרותי למוטציית המטרה ומונע מהפריימר להיקשר לרצף מוטנטי המטרה אשר מפסיק את הגברת הרצף; NGS (ריצוף הדור הבא) – ריצוף אימונוגלובולין מבוסס תפוקה גבוהה (igHTS) סרטן פרופיל מותאם אישית על ידי ריצוף עמוק (CAAP-seq), זוהי שיטה מבוססת ריצוף הדור הבא המשמשת לכימות DNA במחזור בתאים סרטניים (רגישות היא 1 x ^10-4); וכו. ביניהם, רוב השיטות מבוססות על PCR ויכולות לזהות רק מספר קטן של אתרי מוטציה, והשיטות מבוססות NGS יכולות לזהות אתרים מרובים, אך העלות גבוהה, והתהליך מסובך 14,16,17,18. היו דיווחים על זיהוי מוטציות בתדר נמוך RHOA G17V בהתבסס על qPCR, אך מגבלת הזיהוי יכולה להגיע רק לכ –^{2% 19}. אין דיווח על זיהוי מוטציה בתדר נמוך RHOA G17V בהתבסס על ריצוף Sanger. כאן, אנו מדגימים את העלייה ברגישות שהושגה על ידי BDA, בלוק PCR מסוג פראי בשילוב עם ריצוף Sanger, כדי לייעל את הזיהוי של מוטציות סומטיות בתדר נמוך RHOA G17V, ורגישות הזיהוי יכולה להגיע ל -0.5%. נתונים נוספים עבור IDH2 ו– JAK1 מסופקים גם כן.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט של סכמת זיהוי תדר נמוך RHOA G17V על ידי ריצוף Sanger ומספק התייחסות לפיתוח זיהוי מוטציות בתדר נמוך יותר המבוסס על פלטפורמת ריצוף Sanger. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות ולנטר מוטציות עמידות אפשריות לתרופות ושאריות מינימליות בגידולים.