PCR bloccante wild-type combinata con sequenziamento Sanger per il rilevamento di mutazioni somatiche a bassa frequenza

La malattia minima residua (MRD) è il piccolo numero di cellule tumorali che sono ancora presenti nell’organismo dopo il trattamento. A causa del loro piccolo numero, non portano ad alcun segno o sintomo fisico. Spesso non vengono rilevate con i metodi tradizionali, come la visualizzazione microscopica e/o il monitoraggio delle proteine sieriche anomale nel sangue. Un risultato positivo al test MRD indica la presenza di cellule malate residue. Un risultato negativo significa che le cellule malate residue sono assenti. Dopo il trattamento del cancro, le cellule tumorali rimanenti nel corpo possono diventare attive e iniziare a moltiplicarsi, causando una ricaduta della malattia. Il rilevamento della MRD è indicativo che il trattamento non è stato completamente efficace o che il trattamento è stato incompleto. Un altro motivo per i risultati positivi alla MRD dopo il trattamento potrebbe essere che non tutte le cellule tumorali hanno risposto alla terapia o perché le cellule tumorali sono diventate resistenti ai farmaci utilizzati¹.

Il linfoma angioimmunoblastico a cellule T (AITL) è un sottotipo di linfoma periferico a cellule T (PTCL) derivato dalle cellule T follicolari helper²; è il tipo più comune di linfoma a cellule T, rappresentando circa il 15%-20% del PTCL³. È un gruppo di tumori maligni correlati che colpiscono il sistema linfatico. La cellula di origine è la cellula T helper follicolare. La classificazione dell’OMS del 2016 lo classifica come linfoma angioimmunoblastico a cellule T⁴. Nel 2022, l’OMS lo ha rinominato linfoma a cellule helper follicolari nodali, di tipo angioimmunoblastico (nTFHL-AI), insieme a linfoma a cellule helper follicolari nodali, di tipo follicolare (nTFHL-F) e linfoma a cellule helper follicolari nodali, non altrimenti specificato (nTFHL-NOS), collettivamente denominati linfoma a cellule T helper follicolari nodulari (nTFHL). Questo è stato fatto per identificare le sue importanti caratteristiche cliniche e immunofenotipiche e le firme di espressione genica dell’helper follicolare T (TFH) e i mutanti simili. Geneticamente, nTFHL-AI è caratterizzata dalla progressiva acquisizione di mutazioni somatiche nelle cellule staminali ematopoietiche precoci attraverso mutazioni TET2 e DNMT3A, mentre le mutazioni RHOA e IDH2 sono presenti anche nelle cellule tumorali TFH⁵. Diversi studi hanno dimostrato che la mutazione RHOA G17V si verifica nel 50%-80% dei pazienti AITL 6,7,8,9. La proteina RHOA codificata dal gene RHOA è attivata dal legame con la guanosina trifosfato (GTP) e inattivata dal legame con la guanosina difosfato (GDP). Quando attivato, può legarsi a una varietà di proteine effettrici e regolare una varietà di processi biologici. Fisiologicamente, RHOA media la migrazione e la polarità delle cellule T, svolge un ruolo nello sviluppo dei timociti e media l’attivazione della segnalazione del pre-recettore delle cellule T (pre-TCR)¹⁰. La mutazione RHOA G17V è una mutazione con perdita di funzione che svolge un ruolo determinante nella patogenesi del linfoma¹¹. L’individuazione della sua mutazione a bassa frequenza è utile per il monitoraggio MRD di AITL.

Il sequenziamento Sanger è stato utilizzato per più di 40 anni come gold standard per il rilevamento di mutazioni note e sconosciute. Tuttavia, il suo limite di rilevamento è solo del 5%-20%, il che limita la sua applicazione per il rilevamento di mutazioni a bassa frequenza^12,13. Nel sequenziamento Sanger, la sensibilità di rilevamento può essere ridotta allo 0,1% sostituendo la PCR tradizionale con BDA, una tecnologia di blocco selvaggio¹⁴. La tecnologia BDA aggiunge principalmente un primer non corrispondente complementare al tipo mutante quando si progettano primer convenzionali per competere con il tipo selvatico in modo da raggiungere lo scopo di amplificare il tipo mutante. La chiave per la progettazione dell’innesco è l’innesco non corrispondente e la modifica del terminale. Allo stesso tempo, secondo il principio strutturale del DNA, la differenza tra l’energia libera di Gibbs dei due primer è compresa tra 0,8 kcal/mol e 5 kcal/mol. Un altro passo chiave in questa tecnica è quello di sopprimere l’amplificazione wild-type regolando il rapporto tra i primer wild-type e quelli bloccanti^14,15.

Attualmente, le comuni tecniche di rilevamento delle mutazioni somatiche a bassa frequenza includono la PCR allele-specifica basata sulla PCR (reazione a catena della polimerasi allele-specifica, ASPCR), la PCR del sistema di mutazione refrattario all’amplificazione (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR) utilizzata per la genotipizzazione degli SNP con l’aiuto di primer refrattari. La progettazione di primer per gli alleli mutanti e normali consente l’amplificazione selettiva e la PCR digitale (Droplet Digital PCR, ddPCR), un metodo per eseguire la PCR digitale basato sulla tecnologia delle gocce di emulsione acqua-olio¹⁶. Un campione viene frazionato in 20.000 goccioline e per ogni gocciolina viene eseguita un’amplificazione PCR delle molecole stampo con una sensibilità di 1 x ^10-5; l’amplificazione dello spostamento del bloccante (BDA) è anche un metodo di arricchimento di alleli rari basato sulla PCR utilizzato per il rilevamento e la quantificazione accurati di SNV e indel fino allo 0,01% di VAF in un ambiente altamente multiplexato; la tecnologia degli acidi nucleici bloccati (acido nucleico bloccato non estensibile, LNA), è una classe di analoghi dell’RNA ad alta affinità in cui l’anello ribosio è bloccato nella conformazione ideale per il legame di Watson-Crick; le sonde hotspot-specifiche (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), si sovrappongono alla sequenza del primer target, includono una singola mutazione e sono modificate con un distanziatore C3 ^{all’estremità} C3′ per prevenire l’amplificazione mediante qPCR 14,16,17,18. Quando esiste una mutazione nella sequenza, l’HSSP si attacca in modo competitivo alla mutazione bersaglio e impedisce al primer di legarsi alla sequenza mutante bersaglio, interrompendo l’amplificazione della sequenza; NGS (next-generation sequencing) – based immunoglobulin high-throughput sequencing (igHTS) Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAAP-seq), è un metodo basato sul sequenziamento di nuova generazione utilizzato per quantificare il DNA circolante nelle cellule tumorali (la sensibilità è 1 x ^10-4); and so on. Tra questi, la maggior parte dei metodi si basa sulla PCR e può rilevare solo un piccolo numero di siti di mutazione, mentre i metodi basati su NGS possono rilevare più siti, ma il costo è elevato e il processo è complicato 14,16,17,18. Ci sono state segnalazioni sul rilevamento di mutazioni a bassa frequenza RHOA G17V basate sulla qPCR, ma il limite di rilevamento può raggiungere solo circa il 2%¹⁹. Non esiste un rapporto sul rilevamento della mutazione a bassa frequenza RHOA G17V basata sul sequenziamento Sanger. Qui, dimostriamo l’aumento della sensibilità raggiunto da BDA, una PCR a blocchi wild-type combinata con il sequenziamento Sanger, per ottimizzare il rilevamento delle mutazioni somatiche a bassa frequenza RHOA G17V, e la sensibilità di rilevamento può raggiungere lo 0,5%. Vengono forniti anche dati aggiuntivi per IDH2 e JAK1.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato dello schema di rilevamento a bassa frequenza RHOA G17V mediante sequenziamento Sanger e fornisce un riferimento per lo sviluppo di un rilevamento di mutazioni a bassa frequenza più ampio basato sulla piattaforma di sequenziamento Sanger. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare e monitorare possibili mutazioni di resistenza ai farmaci e residui minimi nei tumori.