ПЦР с блокированием дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру для выявления низкочастотных соматических мутаций

Минимальная остаточная болезнь (МОБ) — это небольшое количество раковых клеток, которые все еще присутствуют в организме после лечения. Благодаря своему небольшому количеству, они не приводят к каким-либо физическим признакам или симптомам. Они часто остаются незамеченными с помощью традиционных методов, таких как микроскопическая визуализация и/или отслеживание аномальных сывороточных белков в крови. Положительный результат теста на МОБ указывает на наличие остаточных пораженных клеток. Отрицательный результат означает, что остаточные больные клетки отсутствуют. После лечения рака оставшиеся в организме раковые клетки могут активизироваться и начать размножаться, вызывая рецидив заболевания. Обнаружение МОБ свидетельствует о том, что либо лечение не было полностью эффективным, либо лечение было незавершенным. Другой причиной МОБ-положительных результатов после лечения может быть то, что не все раковые клетки реагировали на терапию или потому что раковые клетки стали устойчивыми к используемым лекарствам^.

Ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ) является подтипом периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛ), происходящей из Т-фолликулярных хелперов²; это наиболее распространенный тип Т-клеточной лимфомы, на долю которого приходится около 15%-20% PTCL³. Это группа родственных злокачественных новообразований, которые поражают лимфатическую систему. Исходной клеткой является фолликулярная Т-хелперная клетка. Классификация ВОЗ 2016 года классифицирует его как ангиоиммунобластическую Т-клеточную лимфому⁴. В 2022 г. ВОЗ переименовала его в узловую Т-фолликулярную хелперную лимфому ангиоиммунобластного типа (nTFHL-AI) вместе с узловой Т-фолликулярной хелперной лимфомой фолликулярного типа (nTFHL-F) и узловой Т-фолликулярной хелперной лимфомой, не уточненной иначе (nTFHL-NOS), которые в совокупности именуются узловой фолликулярной хелперной Т-клеточной лимфомой (nTFHL). Это было сделано для выявления его важных клинических и иммунофенотипических особенностей и сходных сигнатур экспрессии гена Т-фолликулярного хелпера (TFH) и мутантов. Генетически nTFHL-AI характеризуется прогрессирующим приобретением соматических мутаций в ранних гемопоэтических стволовых клетках через мутации TET2 и DNMT3A, в то время как мутации RHOA и IDH2 также присутствуют в опухолевых клетках TFH⁵. Несколько исследований показали, что мутация RHOA G17V встречается у 50%-80% пациентов с AITL 6,7,8,9. Белок RHOA, кодируемый геном RHOA, активируется связыванием с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) и инактивируется связыванием с гуанозиндифосфатом (GDP). При активации он может связываться с различными эффекторными белками и регулировать различные биологические процессы. Физиологически RHOA опосредует миграцию и полярность Т-клеток, играет роль в развитии тимоцитов и опосредует активацию сигнальных рецепторов пре-Т-клеток (пре-TCR)¹⁰. Мутация RHOA G17V является мутацией, приводящей к потере функции, которая играет ведущую роль в патогенезе лимфомы¹¹. Обнаружение его низкочастотной мутации полезно для мониторинга МОБ AITL.

Секвенирование по Сэнгеру уже более 40 лет используется в качестве золотого стандарта для обнаружения известных и неизвестных мутаций. Тем не менее, его предел обнаружения составляет всего 5%-20%, что ограничивает его применение для обнаружения низкочастотных мутаций^12,13. При секвенировании по Сэнгеру чувствительность обнаружения может быть снижена до 0,1% путем замены традиционной ПЦР на BDA, технологию блокирования дикой природы¹⁴. Технология BDA в основном добавляет несовпадающий праймер, комплементарный мутантному типу, при разработке обычных праймеров для конкуренции с диким типом, чтобы достичь цели амплификации мутантного типа. Ключом к проектированию грунтовки является несоответствие праймера и модификация клеммы. В то же время, согласно структурному принципу ДНК, разница между свободной энергией Гиббса двух праймеров составляет от 0,8 ккал/моль до 5 ккал/моль. Еще одним ключевым шагом в этой методике является подавление амплификации дикого типа путем регулировки соотношения диких и блокирующих праймеров^14,15.

В настоящее время распространенными методами выявления низкочастотных соматических мутаций являются аллель-специфическая ПЦР на основе ПЦР (аллель-специфическая полимеразная цепная реакция, ASPCR), амплификационно-рефрактерная мутационная система PCR (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR), используемая для генотипирования SNP с помощью рефрактерных праймеров. Разработка праймеров для мутантных и нормальных аллелей позволяет селективно амплифицировать и проводить цифровую ПЦР (Droplet Digital PCR, ddPCR) — метод проведения цифровой ПЦР, основанный на технологии капель водно-масляной эмульсии¹⁶. Образец фракционируют на 20 000 капель, и для каждой капли проводят ПЦР-амплификацию молекул-матриц с чувствительностью 1 х ^10-5; амплификация смещения блокеров (BDA) также является методом обогащения редких аллелей на основе ПЦР, используемым для точного обнаружения и количественного определения SNV и инделов с концентрацией до 0,01% VAF в среде с высокой мультиплексированностью; технология заблокированных нуклеиновых кислот (нерасширяемая заблокированная нуклеиновая кислота, LNA) — класс высокоаффинных аналогов РНК, в которых кольцо рибозы заперто в идеальной конформации для связывания по методу Уотсона-Крика; зонды, специфичные для горячих точек (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), перекрывают целевую последовательность праймера, включают одну мутацию и модифицируются спейсером C3 на конце C3^‘ для предотвращения амплификации с помощью qPCR 14,16,17,18. Когда мутация в последовательности существует, HSSP конкурентно присоединяется к целевой мутации и предотвращает связывание праймера с целевой мутантной последовательностью, что останавливает амплификацию последовательности; NGS (next-generation sequencing) – высокопроизводительное секвенирование иммуноглобулинов (igHTS) Персонализированное профилирование рака методом глубокого секвенирования (CAAP-seq), это метод нового поколения, основанный на секвенировании, используемый для количественной оценки циркулирующей ДНК в раковых клетках (чувствительность составляет 1 x ^10-4); и так далее. Среди них большинство методов основаны на ПЦР и могут обнаруживать только небольшое количество сайтов мутаций, а методы, основанные на NGS, могут обнаруживать несколько сайтов, но стоимость высока, а процесс сложен 14,16,17,18. Были сообщения об обнаружении низкочастотных мутаций RHOA G17V на основе количественной ПЦР, но предел обнаружения может достигать только около 2%¹⁹. Нет сообщений об обнаружении низкочастотной мутации RHOA G17V на основе секвенирования по Сэнгеру. Здесь мы демонстрируем повышение чувствительности, достигнутое BDA, блочной ПЦР дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру, для оптимизации обнаружения низкочастотных соматических мутаций RHOA G17V, при этом чувствительность обнаружения может достигать 0,5%. Также предоставляются дополнительные данные для IDH2 и JAK1.

В данной статье представлен подробный протокол схемы детектирования низкочастотных мутаций RHOA G17V методом секвенирования по Сэнгеру, а также приведены рекомендации по разработке более низкочастотных детектирующих мутаций на основе платформы секвенирования Сэнгера. Этот метод может быть использован для обнаружения и мониторинга возможных мутаций лекарственной устойчивости и минимальных остатков в опухолях.