PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia

La enfermedad residual mínima (ERM) es la pequeña cantidad de células cancerosas que aún están presentes en el cuerpo después del tratamiento. Debido a su pequeño número, no provocan ningún signo o síntoma físico. A menudo pasan desapercibidos por los métodos tradicionales, como la visualización microscópica y/o el seguimiento de proteínas séricas anormales en la sangre. Un resultado positivo de la prueba de ERM indica la presencia de células enfermas residuales. Un resultado negativo significa que las células enfermas residuales están ausentes. Después del tratamiento contra el cáncer, las células cancerosas restantes en el cuerpo pueden activarse y comenzar a multiplicarse, lo que provoca una recaída de la enfermedad. La detección de ERM es indicativa de que el tratamiento no fue completamente eficaz o que el tratamiento fue incompleto. Otra razón para los resultados positivos de ERM después del tratamiento podría ser que no todas las células cancerosas respondieron a la terapia o porque las células cancerosas se volvieron resistentes a los medicamentos utilizados^.

El linfoma angioinmunoblástico de células T (AITL) es un subtipo de linfoma periférico de células T (PTCL) derivado de células T foliculares auxiliares²; es el tipo más común de linfoma de células T, que representa alrededor del 15% al 20% de PTCL³. Es un grupo de neoplasias malignas relacionadas que afectan al sistema linfático. La célula de origen es la célula T auxiliar folicular. La clasificación de la OMS de 2016 lo categoriza como linfoma angioinmunoblástico de células T⁴. En 2022, la OMS lo rebautizó como linfoma nodal de células foliculares auxiliares de tipo angioinmunoblástico (nTFHL-AI), junto con linfoma de células auxiliares foliculares foliculares nodales (nTFHL-F) y linfoma de células auxiliares foliculares T nodales, no especificado de otro modo (nTFHL-NOS), denominados colectivamente linfoma de células T auxiliares foliculares nodulares (nTFHL). Esto se hizo para identificar sus importantes características clínicas e inmunofenotípicas y las firmas y mutantes similares de expresión génica de T folicular helper (TFH). Genéticamente, nTFHL-AI se caracteriza por la adquisición progresiva de mutaciones somáticas en células madre hematopoyéticas tempranas a través de mutaciones TET2 y DNMT3A, mientras que las mutaciones RHOA e IDH2 también están presentes en células tumorales TFH⁵. Varios estudios han demostrado que la mutación RHOA G17V ocurre en el 50%-80% de los pacientes con AITL ^6,7,8,9. La proteína RHOA codificada por el gen RHOA se activa por la unión del trifosfato de guanosina (GTP) y se inactiva por la unión del difosfato de guanosina (GDP). Cuando se activa, puede unirse a una variedad de proteínas efectoras y regular una variedad de procesos biológicos. Fisiológicamente, RHOA media la migración y polaridad de las células T, desempeña un papel en el desarrollo de los timocitos y media la activación de la señalización del receptor de células pre-T (pre-TCR)¹⁰. La mutación RHOA G17V es una mutación de pérdida de función que desempeña un papel determinante en la patogénesis del linfoma¹¹. La detección de su mutación de baja frecuencia es útil para la monitorización de la ERM de AITL.

La secuenciación de Sanger se ha utilizado durante más de 40 años como el estándar de oro para la detección de mutaciones conocidas y desconocidas. Sin embargo, su límite de detección es solo del 5%-20%, lo que limita su aplicación para la detección de mutaciones de baja frecuencia^12,13. En la secuenciación de Sanger, la sensibilidad de detección puede disminuirse hasta el 0,1% sustituyendo la PCR tradicional por BDA, una tecnología de bloqueo de la naturaleza^{salvaje 14}. La tecnología BDA agrega principalmente un cebador no coincidente complementario al tipo mutante cuando se diseñan cebadores convencionales para competir con el tipo salvaje y lograr el propósito de amplificar el tipo mutante. La clave para el diseño del cebador es el cebador no coincidente y la modificación del terminal. Al mismo tiempo, de acuerdo con el principio estructural del ADN, la diferencia entre la energía libre de Gibbs de los dos cebadores está entre 0,8 kcal/mol y 5 kcal/mol. Otro paso clave en esta técnica es suprimir la amplificación de tipo salvaje ajustando la proporción de cebadores de tipo salvaje y bloqueante^14,15.

En la actualidad, las técnicas comunes de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia incluyen PCR específica de alelos basada en PCR (reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo, ASPCR), sistema de mutación refractaria a la amplificación PCR (sistema de mutación refractaria a la amplificación-PCR, ARMS-PCR) utilizada para el genotipado de SNP con la ayuda de cebadores refractarios. El diseño de cebadores para los alelos mutantes y normales permite la amplificación selectiva y la PCR digital (Droplet Digital PCR, ddPCR), un método para realizar PCR digital que se basa en la tecnología de gotas de emulsión agua-aceite¹⁶. Una muestra se fracciona en 20.000 gotas y, para cada gota, se realiza una amplificación por PCR de las moléculas madre con una sensibilidad de 1 x ^10-5; la amplificación por desplazamiento de bloqueadores (BDA) es también un método de enriquecimiento de alelos raros basado en PCR que se utiliza para la detección y cuantificación precisas de SNV e indels de hasta 0,01% de VAF en un entorno altamente multiplexado; La tecnología de ácido nucleico bloqueado (ácido nucleico bloqueado no extensible, LNA), es una clase de análogos de ARN de alta afinidad en los que el anillo de ribosa está bloqueado en la conformación ideal para la unión de Watson-Crick; Las sondas específicas de puntos calientes (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), se superponen a la secuencia de cebadores objetivo, incluyen una sola mutación y se modifican con un espaciador C3 en el extremo ^C3‘ para evitar la amplificación por qPCR 14,16,17,18. Cuando existe una mutación en la secuencia, el HSSP se adhiere competitivamente a la mutación objetivo y evita que el cebador se una a la secuencia mutante objetivo, lo que detiene la amplificación de la secuencia; NGS (secuenciación de próxima generación) – secuenciación de inmunoglobulinas de alto rendimiento (igHTS) Perfil personalizado del cáncer por secuenciación profunda (CAAP-seq), es un método basado en secuenciación de próxima generación que se utiliza para cuantificar el ADN circulante en las células cancerosas (la sensibilidad es 1 x ^10-4); etcetera. Entre ellos, la mayoría de los métodos se basan en PCR y solo pueden detectar un pequeño número de sitios de mutación, y los métodos basados en NGS pueden detectar múltiples sitios, pero el costo es alto y el proceso es complicado 14,16,17,18. Ha habido informes sobre la detección de mutaciones de baja frecuencia en RHOA G17V basadas en la qPCR, pero el límite de detección solo puede alcanzar alrededor del 2%¹⁹. No hay informes sobre la detección de la mutación de baja frecuencia RHOA G17V basada en la secuenciación de Sanger. Aquí, demostramos el aumento de la sensibilidad logrado por BDA, una PCR en bloque de tipo salvaje combinada con la secuenciación de Sanger, para optimizar la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia RHOA G17V, y la sensibilidad de detección puede alcanzar el 0,5%. También se proporcionan datos adicionales para IDH2 y JAK1.

Este artículo proporciona un protocolo detallado del esquema de detección de baja frecuencia RHOA G17V mediante secuenciación de Sanger y proporciona una referencia para el desarrollo de más detección de mutaciones de baja frecuencia basada en la plataforma de secuenciación de Sanger. Este método se puede utilizar para detectar y monitorizar posibles mutaciones de resistencia a los fármacos y residuos mínimos en los tumores.