低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

微小残存病変(MRD)は、治療後も体内にまだ存在する少数のがん細胞です。数が少ないため、身体的な兆候や症状を引き起こすことはありません。それらは、顕微鏡による可視化や血液中の異常な血清タンパク質の追跡など、従来の方法では検出されないことがよくあります。MRD陽性の検査結果は、残存した疾患細胞の存在を示します。陰性の結果は、残存した疾患細胞が存在しないことを意味します。がん治療後、体内に残っているがん細胞が活性化して増殖し始め、病気が再発する可能性があります。MRDの検出は、治療が完全に効果的ではなかったか、治療が不完全であったことを示しています。治療後にMRD陽性の結果が出るもう一つの理由は、すべてのがん細胞が治療に反応しなかったこと、またはがん細胞が使用した薬剤に耐性を持つようになったためである可能性があります¹。

血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)は、T濾胞性ヘルパー細胞²に由来する末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)のサブタイプです。これは最も一般的なタイプのT細胞リンパ腫であり、PTCL^の約15%〜20%を占めています3。これは、リンパ系に影響を与える関連する悪性腫瘍のグループです。起源の細胞は濾胞性Tヘルパー細胞です。2016年のWHO分類では、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫⁴に分類されています。2022年、WHOは、この病院をNodal T-follicular helper cell lymphoma, angioimmunoblastic-type (nTFHL-AI)と改名し、Nodal T-follicular helper cell lymphoma, follicular-type (nTFHL-F)およびNodal T-follicular helper cell lymphoma, not otherwise specified(nTFHL-NOS)と改名し、結節性濾胞性ヘルパーT細胞リンパ腫(nTFHL)と総称しました。これは、その重要な臨床的および免疫表現型の特徴、および類似のT濾胞性ヘルパー(TFH)遺伝子発現シグネチャーおよび変異体を同定するために行われました。遺伝的には、nTFHL-AIは、TET2およびDNMT3A変異を介して初期の造血幹細胞における体細胞変異の進行性獲得を特徴とし、一方、RHOAおよびIDH2変異はTFH腫瘍細胞にも存在する⁵。いくつかの研究は、RHOA G17V変異がAITL患者の50%〜80%で発生することを示しています6,7,8,9。RHOA遺伝子によってコードされるRHOAタンパク質は、グアノシン三リン酸(GTP)結合によって活性化され、グアノシン二リン酸(GDP)結合によって不活性化されます。活性化されると、さまざまなエフェクタータンパク質に結合し、さまざまな生物学的プロセスを調節できます。生理学的には、RHOAはT細胞の遊走と極性を媒介し、胸腺細胞の発生に関与し、プレT細胞受容体(pre-TCR)シグナル伝達の活性化を媒介します¹⁰。RHOA G17V変異は、リンパ腫の病因¹¹において推進的な役割を果たす機能喪失型変異である。その低周波変異の検出は、AITLのMRDモニタリングに役立ちます。

サンガーシーケンシングは、既知および未知の変異を検出するためのゴールドスタンダードとして40年以上にわたって使用されてきました。しかし、その検出限界はわずか5%〜20%であり、低頻度の突然変異検出^12,13への適用が制限される。サンガーシーケンシングでは、従来のPCRを野生ブロッキング技術であるBDAに置き換えることにより、検出感度を0.1%に低下させることができます¹⁴。BDA技術は、変異型を増幅するという目的を達成するために、野生型と競合するように従来のプライマーを設計する際に、主に変異型に相補的なミスマッチプライマーを添加する。プライマー設計の鍵となるのは、ミスマッチプライマーと末端修飾です。同時に、DNAの構造原理によれば、2つのプライマーのギブス自由エネルギーの差は0.8 kcal / molと5 kcal / molの間です。この技術におけるもう一つの重要なステップは、野生型とブロッキングプライマーの比率を調整することによって野生型増幅を抑制することである^14,15。

現在、一般的な低頻度体細胞突然変異検出技術には、PCRベースの対立遺伝子特異的PCR(対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ASPCR)、増幅難治性突然変異システムPCR(増幅難治性突然変異システム-PCR、ARMS-PCR)が含まれます。変異体および正常対立遺伝子のプライマーを設計することにより、選択的増幅およびデジタルPCR(Droplet Digital PCR、ddPCR)、水-油エマルジョン液滴技術に基づくデジタルPCRの実施方法¹⁶が可能になる。サンプルを20,000個の液滴に分画し、各液滴について、テンプレート分子のPCR増幅を1 x ^10-5の感度で行います。ブロッカー変位増幅(BDA)は、高度にマルチプレックス化された環境でSNVおよびインデルを0.01%VAFまで正確に検出および定量するために使用されるPCRベースの希少対立遺伝子濃縮法でもあります。ロック核酸技術(非拡張型ロック核酸、LNA)は、リボース環がWatson-Crick結合の理想的なコンフォメーションにロックされている高親和性RNAアナログの一種です。ホットスポット特異的プローブ(Hot-Spot-Specific Probe、HSSP)は、標的プライマー配列とオーバーラップし、単一の変異を含み、qPCR 14,16,17,18による増幅を防ぐために、C3’末端にC3スペーサーで修飾されています。配列に変異が存在する場合、HSSPは標的変異に競合的に結合し、プライマーが標的変異体配列に結合するのを防ぎ、配列増幅を停止します。NGS(次世代シーケンシング)ベースの免疫グロブリンハイスループットシーケンシング(igHTS)ディープシーケンシングによるがん個別プロファイリング(CAAP-seq)は、がん細胞の循環DNAを定量するために使用される次世代シーケンシングベースの方法です(感度は1 x ^10-4です)。等。その中で、ほとんどの方法はPCRに基づいており、少数の突然変異部位しか検出できず、NGSベースの方法は複数の部位を検出できますが、コストが高く、プロセスは複雑です14,16,17,18。qPCRに基づくRHOA G17V低周波変異の検出に関する報告がありますが、検出限界は約2%¹⁹にしか達できません。サンガーシーケンシングに基づくRHOA G17V低周波変異の検出に関する報告はありません。ここでは、RHOA G17V低頻度体細胞変異の検出を最適化するために、サンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロックPCRであるBDAによって達成される感度の向上を示し、検出感度は0.5%に達することができます。IDH2 と JAK1 の追加データも提供されます。

この記事では、サンガーシーケンシングによるRHOAG17V低周波検出スキームの詳細なプロトコルを提供し、サンガーシーケンシングプラットフォームに基づくより低周波変異検出の開発のためのリファレンスを提供します。この方法は、腫瘍内の薬剤耐性変異の可能性と最小限の残留物を検出し、モニタリングするために使用できます。