Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Unter der minimalen Resterkrankung (MRD) versteht man die geringe Anzahl von Krebszellen, die nach der Behandlung noch im Körper vorhanden sind. Aufgrund ihrer geringen Anzahl führen sie zu keinen körperlichen Anzeichen oder Symptomen. Sie werden mit herkömmlichen Methoden, wie z. B. der mikroskopischen Visualisierung und/oder der Verfolgung abnormaler Serumproteine im Blut, oft nicht entdeckt. Ein positives MRD-Testergebnis weist auf das Vorhandensein von erkrankten Restzellen hin. Ein negatives Ergebnis bedeutet, dass verbleibende kranke Zellen nicht vorhanden sind. Nach der Krebsbehandlung können die verbleibenden Krebszellen im Körper aktiv werden und sich zu vermehren beginnen, was zu einem Rückfall der Krankheit führt. Der Nachweis einer MRD ist ein Hinweis darauf, dass die Behandlung entweder nicht vollständig wirksam war oder dass die Behandlung unvollständig war. Ein weiterer Grund für MRD-positive Ergebnisse nach der Behandlung könnte sein, dass nicht alle Krebszellen auf die Therapie ansprachen oder dass die Krebszellen resistent gegen die eingesetzten Medikamente wurden¹.

Das angioimmunoblastische T-Zell-Lymphom (AITL) ist ein Subtyp des peripheren T-Zell-Lymphoms (PTCL), das von follikulären T-Helferzellen abgeleitet^{wird 2}; Es ist die häufigste Form des T-Zell-Lymphoms und macht etwa 15 % bis 20 % der PTCL³ aus. Es handelt sich um eine Gruppe verwandter bösartiger Erkrankungen, die das Lymphsystem betreffen. Die Ursprungszelle ist die follikuläre T-Helferzelle. Die WHO-Klassifikation von 2016 kategorisiert es als angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom⁴. Im Jahr 2022 benannte die WHO es zusammen mit dem nodalen T-follikulären Helferzell-Lymphom, angioimmunoblastischem Typ (nTFHL-AI) in nodales T-follikuläres Helferzell-Lymphom, follikulärer Typ (nTFHL-F) und nodales T-follikuläres Helferzell-Lymphom, nicht anderweitig spezifiziert (nTFHL-NOS) um, zusammen als noduläres follikuläres T-Helfer-T-Zell-Lymphom (nTFHL) bezeichnet. Dies geschah, um seine wichtigen klinischen und immunphänotypischen Merkmale und ähnliche Genexpressionssignaturen und -mutanten für T-Follikelhelfer (TFH) zu identifizieren. Genetisch ist nTFHL-AI durch den fortschreitenden Erwerb somatischer Mutationen in frühen hämatopoetischen Stammzellen durch TET2- und DNMT3A-Mutationen gekennzeichnet, während RHOA– und IDH2-Mutationen auch in TFH-Tumorzellen vorhanden sind⁵. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die RHOA G17V-Mutation bei 50%-80% der AITL-Patienten auftritt 6,7,8,9. Das vom RHOA-Gen kodierte RHOA-Protein wird durch die Bindung von Guanosintriphosphat (GTP) aktiviert und durch die Bindung von Guanosindiphosphat (GDP) inaktiviert. Wenn es aktiviert wird, kann es an eine Vielzahl von Effektorproteinen binden und eine Vielzahl biologischer Prozesse regulieren. Physiologisch vermittelt RHOA die Migration und Polarität von T-Zellen, spielt eine Rolle bei der Entwicklung von Thymozyten und vermittelt die Aktivierung der Signalübertragung des Prä-T-Zell-Rezeptors (Prä-TCR)¹⁰. Die RHOA G17V-Mutation ist eine Funktionsverlust-Mutation, die eine treibende Rolle bei der Pathogenese des Lymphoms spielt¹¹. Der Nachweis seiner niederfrequenten Mutation ist hilfreich für das MRD-Monitoring von AITL.

Die Sanger-Sequenzierung wird seit mehr als 40 Jahren als Goldstandard für den Nachweis bekannter und unbekannter Mutationen eingesetzt. Die Nachweisgrenze liegt jedoch nur bei 5 % bis 20 %, was die Anwendung für den Nachweis niederfrequenter Mutationen einschränkt^12,13. Bei der Sanger-Sequenzierung kann die Nachweisempfindlichkeit auf 0,1 % gesenkt werden, indem die traditionelle PCR durch BDA, eine Wildblocking-Technologie, ersetzt wird¹⁴. Die BDA-Technologie fügt bei der Entwicklung herkömmlicher Primer, die mit dem Wildtyp konkurrieren, hauptsächlich einen unpassenden Primer hinzu, der den Mutantentyp ergänzt, um den Zweck der Amplifikation des Mutantentyps zu erreichen. Der Schlüssel zum Primer-Design ist der Mismatch-Primer und die Terminalmodifikation. Gleichzeitig liegt die Differenz zwischen der freien Gibbs-Energie der beiden Primer nach dem Strukturprinzip der DNA zwischen 0,8 kcal/mol und 5 kcal/mol. Ein weiterer wichtiger Schritt in dieser Technik ist die Unterdrückung der Wildtyp-Amplifikation durch Anpassung des Verhältnisses von Wildtyp- und Blocking-Primern^14,15.

Zu den derzeit üblichen niederfrequenten Techniken zum Nachweis somatischer Mutationen gehören die PCR-basierte allelspezifische PCR (Allel-spezifische Polymerase-Kettenreaktion, ASPCR), die amplifikationsrefraktäre Mutationssystem-PCR (amplifikationsrefraktäres Mutationssystem-PCR, ARMS-PCR), die für die Genotypisierung von SNP mit Hilfe von refraktären Primern verwendet wird. Das Design von Primern für die mutierten und normalen Allele ermöglicht die selektive Amplifikation und die digitale PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR), ein Verfahren zur Durchführung der digitalen PCR, das auf der Wasser-Öl-Emulsions-Tröpfchentechnologie¹⁶ basiert. Eine Probe wird in 20.000 Tröpfchen fraktioniert, und für jedes Tröpfchen wird eine PCR-Amplifikation der ^{Template-Moleküle} mit einer Sensitivität von 1 x 10-5 durchgeführt; Die Blocker-Displacement-Amplifikation (BDA) ist ebenfalls eine PCR-basierte Methode zur Anreicherung seltener Allele, die für den genauen Nachweis und die Quantifizierung von SNVs und Indels bis zu 0,01 % VAF in einer stark multiplexierten Umgebung verwendet wird. Die Locked-Nukleinsäure-Technologie (Non-Extendable Locked Nucleic Acid, LNA) ist eine Klasse von hochaffinen RNA-Analoga, bei denen der Ribose-Ring in der idealen Konformation für die Watson-Crick-Bindung eingeschlossen ist. Hotspot-spezifische Sonden (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), überlappen die Ziel-Primersequenz, enthalten eine einzelne Mutation und sind mit einem C3-Spacer am C3^‘-Ende modifiziert, um eine Amplifikation durch qPCR 14,16,17,18 zu verhindern. Wenn eine Mutation in der Sequenz vorhanden ist, bindet der HSSP kompetitiv an die Zielmutation und verhindert, dass der Primer an die Zielmutantensequenz bindet, wodurch die Sequenzamplifikation gestoppt wird. NGS (Next-Generation-Sequencing) – basierte Immunglobulin-Hochdurchsatz-Sequenzierung (igHTS) Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAAP-seq), es handelt sich um eine auf Next-Generation-Sequencing basierende Methode zur Quantifizierung zirkulierender DNA in Krebszellen (Sensitivität beträgt 1 x ^10-4); etc. Unter ihnen basieren die meisten Methoden auf PCR und können nur eine kleine Anzahl von Mutationsstellen nachweisen, und die NGS-basierten Methoden können mehrere Stellen nachweisen, aber die Kosten sind hoch und der Prozess ist kompliziert ^14,16,17,18. Es gibt Berichte über den Nachweis von niederfrequenten RHOA G17V-Mutationen auf der Grundlage der qPCR, aber die Nachweisgrenze kann nur etwa 2 % ^erreichen19. Es gibt keinen Bericht über den Nachweis von RHOA G17V niederfrequenten Mutationen auf der Grundlage der Sanger-Sequenzierung. Hier zeigen wir die Erhöhung der Sensitivität, die durch BDA, eine Wildtyp-Block-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung, erreicht wird, um den Nachweis von niederfrequenten somatischen RHOA G17V-Mutationen zu optimieren, und die Nachweisempfindlichkeit kann 0,5% erreichen. Zusätzliche Daten für IDH2 und JAK1 werden ebenfalls bereitgestellt.

Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll des RHOA G17V Niederfrequenz-Detektionsschemas durch Sanger-Sequenzierung und bietet eine Referenz für die Entwicklung eines niederfrequenteren Mutationsnachweises auf der Grundlage der Sanger-Sequenzierungsplattform. Mit dieser Methode können mögliche Resistenzmutationen und minimale Rückstände in Tumoren erkannt und überwacht werden.