PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

A doença residual mínima (MRD) é o pequeno número de células cancerígenas que ainda estão presentes no corpo após o tratamento. Devido ao seu pequeno número, eles não levam a nenhum sinal ou sintoma físico. Eles geralmente não são detectados por métodos tradicionais, como visualização microscópica e / ou rastreamento de proteínas séricas anormais no sangue. Um resultado de teste positivo para DRM indica a presença de células doentes residuais. Um resultado negativo significa que as células doentes residuais estão ausentes. Após o tratamento do câncer, as células cancerígenas restantes no corpo podem se tornar ativas e começar a se multiplicar, causando uma recaída da doença. A detecção de DRM é indicativa de que o tratamento não foi completamente eficaz ou que o tratamento foi incompleto. Outra razão para os resultados positivos para MRD após o tratamento pode ser que nem todas as células cancerígenas responderam à terapia ou porque as células cancerígenas se tornaram resistentes aos medicamentos usados¹.

O linfoma angioimunoblástico de células T (AITL) é um subtipo de linfoma periférico de células T (PTCL) derivado de células T foliculares auxiliares²; é o tipo mais comum de linfoma de células T, representando cerca de 15% a 20% do PTCL³. É um grupo de malignidades relacionadas que afetam o sistema linfático. A célula de origem é a célula T auxiliar folicular. A classificação da OMS de 2016 o categoriza como Linfoma Angioimunoblástico de Células T⁴. Em 2022, a OMS o renomeou como linfoma nodal de células auxiliares foliculares T, tipo angioimunoblástico (nTFHL-AI), juntamente com linfoma nodal de células auxiliares foliculares T, tipo folicular (nTFHL-F) e linfoma nodal de células auxiliares foliculares T, sem outra especificação (nTFHL-NOS), coletivamente referido como linfoma de células T auxiliares foliculares nodulares (nTFHL). Isso foi feito para identificar suas importantes características clínicas e imunofenotípicas e assinaturas e mutantes semelhantes de expressão gênica do T folicular helper (TFH). Geneticamente, o nTFHL-AI é caracterizado pela aquisição progressiva de mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas precoces por meio de mutações TET2 e DNMT3A, enquanto mutações RHOA e IDH2 também estão presentes em células tumorais TFH⁵. Vários estudos mostraram que a mutação RHOA G17V ocorre em 50% a 80% dos pacientes com AITL 6,7,8,9. A proteína RHOA codificada pelo gene RHOA é ativada pela ligação do trifosfato de guanosina (GTP) e inativada pela ligação do difosfato de guanosina (GDP). Quando ativado, ele pode se ligar a uma variedade de proteínas efetoras e regular uma variedade de processos biológicos. Fisiologicamente, o RHOA medeia a migração e a polaridade das células T, desempenha um papel no desenvolvimento dos timócitos e medeia a ativação da sinalização do receptor pré-T (pré-TCR)¹⁰. A mutação RHOA G17V é uma mutação de perda de função que desempenha um papel determinante na patogênese do linfoma¹¹. A detecção de sua mutação de baixa frequência é útil para o monitoramento de DRM de AITL.

O sequenciamento de Sanger tem sido usado há mais de 40 anos como padrão-ouro para a detecção de mutações conhecidas e desconhecidas. No entanto, seu limite de detecção é de apenas 5%-20%, o que limita sua aplicação para detecção de mutações de baixa frequência^12,13. No sequenciamento de Sanger, a sensibilidade de detecção pode ser reduzida para 0,1% substituindo a PCR tradicional por BDA, uma tecnologia de bloqueio selvagem¹⁴. A tecnologia BDA adiciona principalmente um primer incompatível complementar ao tipo mutante ao projetar primers convencionais para competir com o tipo selvagem, de modo a atingir o objetivo de amplificar o tipo mutante. A chave para o design do primer é o primer de incompatibilidade e a modificação do terminal. Ao mesmo tempo, de acordo com o princípio estrutural do DNA, a diferença entre a energia livre de Gibbs dos dois primers está entre 0,8 kcal / mol e 5 kcal / mol. Outro passo fundamental nessa técnica é suprimir a amplificação do tipo selvagem, ajustando a proporção de primers do tipo selvagem e do tipo bloqueador^14,15.

Atualmente, as técnicas comuns de detecção de mutação somática de baixa frequência incluem PCR alelo-específico baseado em PCR (reação em cadeia da polimerase alelo-específica, ASPCR), PCR do sistema de mutação refratária à amplificação (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR) usado para genotipagem de SNP com a ajuda de primers refratários. O design de primers para os alelos mutante e normal permite a amplificação seletiva e a PCR digital (Droplet Digital PCR, ddPCR), um método para realizar PCR digital baseado na tecnologia de gotículas de emulsão água-óleo¹⁶. Uma amostra é fracionada em 20.000 gotículas e, para cada gota, uma amplificação por PCR das moléculas modelo é feita com uma sensibilidade de 1 x ^10-5; a amplificação de deslocamento do bloqueador (BDA) também é um método de enriquecimento de alelos raros baseado em PCR usado para detecção e quantificação precisas de SNVs e indels até 0,01% VAF em um ambiente altamente multiplexado; A tecnologia de ácido nucleico bloqueado (ácido nucleico bloqueado não extensível, LNA) é uma classe de análogos de RNA de alta afinidade em que o anel de ribose é bloqueado na conformação ideal para a ligação de Watson-Crick; sondas específicas de hotspot (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), sobrepõem-se à sequência de primer alvo, incluem uma única mutação e são modificadas com um espaçador C3 na extremidade C3^‘ para evitar amplificação por qPCR 14,16,17,18. Quando existe uma mutação na sequência, o HSSP se liga competitivamente à mutação alvo e impede que o primer se ligue à sequência mutante alvo, o que interrompe a amplificação da sequência; NGS (sequenciamento de próxima geração) – sequenciamento de alto rendimento baseado em imunoglobulina (igHTS) Perfil personalizado de câncer por sequenciamento profundo (CAAP-seq), é um método baseado em sequenciamento de próxima geração usado para quantificar o DNA circulante em células cancerígenas (a sensibilidade é 1 x ^10-4); etc. Entre eles, a maioria dos métodos é baseada em PCR e só pode detectar um pequeno número de sítios de mutação, e os métodos baseados em NGS podem detectar múltiplos sítios, mas o custo é alto e o processo é complicado 14,16,17,18. Houve relatos sobre a detecção de mutações de baixa frequência RHOA G17V com base na qPCR, mas o limite de detecção pode chegar a apenas cerca de 2%¹⁹. Não há relato sobre a detecção da mutação de baixa frequência RHOA G17V com base no sequenciamento de Sanger. Aqui, demonstramos o aumento da sensibilidade alcançado pelo BDA, um PCR em bloco do tipo selvagem combinado com o sequenciamento de Sanger, para otimizar a detecção de mutações somáticas de baixa frequência RHOA G17V, e a sensibilidade de detecção pode chegar a 0,5%. Dados adicionais para IDH2 e JAK1 também são fornecidos.

Este artigo fornece um protocolo detalhado do esquema de detecção de baixa frequência RHOA G17V por sequenciamento Sanger e fornece uma referência para o desenvolvimento de mais detecção de mutação de baixa frequência com base na plataforma de sequenciamento Sanger. Este método pode ser usado para detectar e monitorar possíveis mutações de resistência a medicamentos e resíduos mínimos em tumores.