Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR
Summary
Bu makale, anjiyoimmünoblastik lenfomada Sanger dizilemesine dayalı düşük frekanslı bir tespit yönteminin uygulamasını tanıtmaktadır. Bu yöntemi diğer hastalıklara uygulamak için bir temel sağlayın.
Abstract
Tümör tedavisinden sonra minimal rezidüel hastalığı (MRD) izlerken, tedavi sırasında ilaç direnci mutasyonları ve dolaşımdaki tümör hücresi mutasyonları için tespit edildiğinden daha düşük tespit limiti gereksinimleri vardır. Geleneksel Sanger dizilemesi %5-%20 vahşi tip mutasyon tespitine sahiptir, bu nedenle tespit limiti ilgili gereksinimleri karşılayamaz. Bunun üstesinden geldiği bildirilen vahşi tip engelleme teknolojileri arasında engelleyici yer değiştirme amplifikasyonu (BDA), uzatılamayan kilitli nükleik asit (LNA), sıcak noktaya özgü problar (HSSP) vb. bulunur. Bu teknolojiler, vahşi türü bloke etmek veya vahşi türü tanımak için belirli oligonükleotid dizileri kullanır ve daha sonra bunu, vahşi tip amplifikasyonu önlemek ve mutant amplifikasyonu yükseltmek için diğer yöntemlerle birleştirerek yüksek hassasiyet, esneklik ve rahatlık gibi özelliklere yol açar. Bu protokol, RHOA G17V düşük frekanslı somatik mutasyonların tespitini optimize etmek için Sanger dizilimi ile birleştirilmiş vahşi tip bir bloke edici PCR olan BDA’yı kullanır ve tespit duyarlılığı %0,5’e ulaşabilir, bu da anjiyoimmünoblastik T hücreli lenfomanın MRD izlemesi için bir temel sağlayabilir.
Introduction
Minimal rezidüel hastalık (MRD), tedaviden sonra vücutta hala mevcut olan az sayıda kanser hücresidir. Sayılarının az olması nedeniyle herhangi bir fiziksel belirti veya semptoma yol açmazlar. Genellikle mikroskobik görselleştirme ve/veya kandaki anormal serum proteinlerinin izlenmesi gibi geleneksel yöntemlerle tespit edilmezler. MRD pozitif bir test sonucu, artık hastalıklı hücrelerin varlığını gösterir. Negatif bir sonuç, artık hastalıklı hücrelerin bulunmadığı anlamına gelir. Kanser tedavisi sonrası, vücutta kalan kanser hücreleri aktif hale gelebilir ve çoğalmaya başlayabilir, bu da hastalığın nüksetmesine neden olabilir. MRD’nin saptanması, tedavinin tamamen etkili olmadığının veya tedavinin eksik olduğunun göstergesidir. Tedaviden sonra MRD pozitif sonuçların bir başka nedeni, tüm kanser hücrelerinin tedaviye yanıt vermemesi veya kanser hücrelerinin kullanılan ilaçlara dirençli hale gelmesi olabilir1.
Anjiyoimmünoblastik T hücreli lenfoma (AITL), T foliküler yardımcı hücrelerden türetilen periferik T hücreli lenfomanın (PTCL) bir alt tipidir2; PTCL’nin yaklaşık %15-20’sini oluşturan en yaygın T hücreli lenfoma türüdür3. Lenfatik sistemi etkileyen bir grup ilişkili malignitedir. Köken hücresi foliküler T yardımcı hücresidir. 2016 DSÖ sınıflandırması bunu Anjiyoimmünoblastik T hücreli Lenfoma4 olarak sınıflandırır. 2022’de DSÖ, Nodal T-foliküler yardımcı hücreli lenfoma, anjiyoimmünoblastik tip (nTFHL-AI) ve Nodal T-foliküler yardımcı hücreli lenfoma, foliküler tip (nTFHL-F) ve Nodal T-foliküler yardımcı hücreli lenfoma, başka türlü belirtilmemiş (nTFHL-NOS), topluca nodüler foliküler yardımcı T hücreli lenfoma (nTFHL) olarak yeniden adlandırdı. Bu, önemli klinik ve immünofenotipik özelliklerini ve benzer T foliküler yardımcı (TFH) gen ekspresyon imzalarını ve mutantlarını tanımlamak için yapıldı. Genetik olarak, nTFHL-AI, TET2 ve DNMT3A mutasyonları yoluyla erken hematopoietik kök hücrelerde somatik mutasyonların ilerleyici kazanımı ile karakterize edilirken, RHOA ve IDH2 mutasyonları TFH tümör hücrelerinde de mevcuttur5. Birçok çalışma, RHOA G17V mutasyonunun AITL hastalarının %50-80’inde meydana geldiğini göstermiştir 6,7,8,9. RHOA geni tarafından kodlanan RHOA proteini, guanozin trifosfat (GTP) bağlanması ile aktive edilir ve guanozin difosfat (GDP) bağlanması ile inaktive edilir. Aktive edildiğinde, çeşitli efektör proteinlere bağlanabilir ve çeşitli biyolojik süreçleri düzenleyebilir. Fizyolojik olarak, RHOA, T hücresi göçüne ve polaritesine aracılık eder, timosit gelişiminde rol oynar ve pre-T hücre reseptörünün (pre-TCR) aktivasyonuna aracılık eder10. RHOA G17V mutasyonu, lenfoma patogenezinde itici bir rol oynayan bir fonksiyon kaybı mutasyonudur11. Düşük frekanslı mutasyonunun saptanması, AITL’nin MRD izlemesi için yararlıdır.
Sanger dizilemesi, bilinen ve bilinmeyen mutasyonların tespiti için altın standart olarak 40 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır. Bununla birlikte, tespit limiti sadece %5-%20’dir, bu da düşük frekanslı mutasyon tespiti12,13 için uygulamasını sınırlar. Sanger dizilemesinde, geleneksel PCR’yi vahşi bir engelleme teknolojisi olan BDA ile değiştirerek algılama hassasiyeti %0,1’e düşürülebilir14. BDA teknolojisi, mutant tipini büyütme amacına ulaşmak için vahşi tiple rekabet etmek için geleneksel primerleri tasarlarken, esas olarak mutant tipine tamamlayıcı olarak uyumsuz bir astar ekler. Astar tasarımının anahtarı, uyumsuzluk astarı ve terminal modifikasyonudur. Aynı zamanda, DNA’nın yapısal prensibine göre, iki primerin Gibbs serbest enerjisi arasındaki fark 0.8 kcal/mol ile 5 kcal/mol arasındadır. Bu teknikteki bir diğer önemli adım, vahşi tip ve bloke edici primerlerin14,15 oranını ayarlayarak vahşi tip amplifikasyonu baskılamaktır.
Şu anda, yaygın düşük frekanslı somatik mutasyon tespit teknikleri arasında PCR tabanlı alele özgü PCR (alele özgü polimeraz zincir reaksiyonu, ASPCR), refrakter primerler yardımıyla SNP’nin genotiplendirilmesi için kullanılan amplifikasyon-refrakter mutasyon sistemi PCR (amplifikasyon-refrakter mutasyon sistemi-PCR, ARMS-PCR) bulunmaktadır. Mutant ve normal aleller için primerlerin tasarlanması, su-yağ emülsiyonu damlacık teknolojisine dayanan dijital PCR gerçekleştirmek için bir yöntem olan seçici amplifikasyona ve dijital PCR’ye (Damlacık Dijital PCR, ddPCR) izin verir16. Bir numune 20.000 damlacığa bölünür ve her damlacık için şablon moleküllerinin bir PCR amplifikasyonu 1 x 10-5 hassasiyetle yapılır; bloker deplasman amplifikasyonu (BDA) aynı zamanda, yüksek oranda çoğullanmış bir ortamda SNV’lerin ve indellerin %0.01 VAF’ye kadar doğru tespiti ve kantitasyonu için kullanılan PCR tabanlı nadir bir alel zenginleştirme yöntemidir; kilitli nükleik asit teknolojisi (uzatılamayan kilitli nükleik asit, LNA), riboz halkasının Watson-Crick bağlanması için ideal konformasyonda kilitlendiği yüksek afiniteli RNA analogları sınıfıdır; sıcak noktaya özgü problar (Sıcak Noktaya Özgü Prob, HSSP), hedef primer dizisiyle örtüşür, tek bir mutasyon içerir ve qPCR 14,16,17,18 ile amplifikasyonu önlemek için C3′ ucunda bir C3 ara parçası ile modifiye edilir. Dizide bir mutasyon mevcut olduğunda, HSSP hedef mutasyona rekabetçi bir şekilde bağlanır ve primerin hedef mutant diziye bağlanmasını önler, bu da dizi amplifikasyonunu durdurur; NGS (yeni nesil dizileme) tabanlı immünoglobulin yüksek verimli dizileme (igHTS) Derin Dizileme ile Kanser Kişiselleştirilmiş Profilleme (CAAP-seq), kanser hücrelerinde dolaşan DNA’yı ölçmek için kullanılan yeni nesil dizileme tabanlı bir yöntemdir (duyarlılık 1 x 10-4’tür); ve saire. Bunlar arasında, çoğu yöntem PCR’ye dayanır ve yalnızca az sayıda mutasyon bölgesini tespit edebilir ve NGS tabanlı yöntemler birden fazla bölgeyi tespit edebilir, ancak maliyeti yüksektir ve süreç karmaşıktır 14,16,17,18. qPCR’ye dayalı RHOA G17V düşük frekanslı mutasyonların tespiti hakkında raporlar vardır, ancak tespit limiti yalnızca yaklaşık %2’ye ulaşabilir19. Sanger dizilimine dayalı RHOA G17V düşük frekanslı mutasyonun tespiti hakkında bir rapor yoktur. Burada, RHOA G17V düşük frekanslı somatik mutasyonların tespitini optimize etmek için Sanger dizileme ile birleştirilmiş vahşi tip bir blok PCR olan BDA tarafından elde edilen hassasiyet artışını gösteriyoruz ve tespit duyarlılığı %0,5’e ulaşabilir. IDH2 ve JAK1 için ek veriler de sağlanmaktadır.
Bu makale, Sanger dizilemesi ile RHOA G17V düşük frekanslı algılama şemasının ayrıntılı bir protokolünü sağlar ve Sanger dizileme platformuna dayalı daha düşük frekanslı mutasyon tespitinin geliştirilmesi için bir referans sağlar. Bu yöntem, tümörlerde olası ilaca dirençli mutasyonları ve minimal kalıntıları tespit etmek ve izlemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan BDA teknolojisine dayalı WTB-PCR, vahşi tiple rekabet etmek, vahşi türü bastırmak ve mutant ürünü çoğaltmak için geleneksel primerler tasarlarken, mutant tipe tamamlayıcı uyumsuz bir primer sunar. Daha sonra, WTB-PCR ürünleri mutasyon analizi için dizilendi. WTB-PCR / Sanger’in faydası basitliği ve yüksek hassasiyetidir. Bu yazıda oluşturulan tespit şemasına göre, mevcut Sanger bazlı tahlillerin çoğu, BDA yoluyla baskılayıcı primerle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kindstar Global Corporation’ın finansal desteği ve Moleküler Biyoloji Laboratuvarı liderlerinin ve ilgili meslektaşların yardımıyla tamamlanmıştır. Şirkete, liderlere ve ilgili çalışma arkadaşlarına destekleri ve yardımları için teşekkür ederiz. Bu yazı sadece bilimsel araştırma amaçlı olup, herhangi bir ticari faaliyet teşkil etmemektedir.
Materials
| Automatic DNA extractor | 9001301 | Qiagen | |
| DNA nucleic acid detector | Q32854 | Thermo fisher | |
| PCR amplification kit | P4600 | merck | |
| PCR instrument | C1000 Touch | Biorad | |
| proteinase K solution | D3001-2-A | zymo research | |
| proteinase K storage buffer | D3001-2-C | zymo research | |
| Sequencing amplification enzyme kit | P7670-FIN | Qiagen |
References
- Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD) Available from: https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019)
- Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).
- Mariko, Y., et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).
- Daniel, A. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Rita, A., et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms. Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).
- Hae, Y. Y., et al. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).
- Lee, P. H., et al. RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment. Exp Mol Pathol. 110, 104294 (2019).
- Mamiko, S. Y., et al. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).
- Palomero, T., et al. Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).
- Fujisawa, M., et al. Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).
- Voena, C., et al. RHO family GTPases in the biology of lymphoma. Cells. 8 (7), 646 (2019).
- Shendure, J., et al. DNA sequencing an 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
- Athanasios, C. T., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).
- Wu, L. R., et al. Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification. Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).
- John, S. J., et al. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).
- Coren, A. M., et al. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Eliza, M. L., et al. Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research. Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).
- Lee, H. J., et al. Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Biosensors. 12 (8), 597 (2022).
- Matsubara, R. N., et al. Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR. PLoS One. 9 (10), e109714 (2014).
- Dieffenbach, C. W., et al. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
.