Субдуральная мягкая электрокортикография (ЭКоГ) Имплантация решетки и долговременная кортикальная регистрация у минипигов
Summary
В данной работе мы представляем метод долгосрочной оценки работоспособности и безопасности мягких субдуральных электродных решеток в модели минипига, описывающий хирургический метод и инструменты, послеоперационную магнитно-резонансную томографию, электрофизиологию слуховой коры, электрохимические свойства имплантата и посмертную иммунохимию.
Abstract
Неврологические нарушения и заболевания можно диагностировать или лечить с помощью электрокортикографии (ЭКоГ). При лекарственно-устойчивой эпилепсии они помогают разграничить эпилептическую область для резекции. В долгосрочных приложениях, таких как интерфейсы мозг-компьютер, эти эпикортикальные электроды используются для записи намерения движения мозга, для управления роботизированными конечностями парализованных пациентов. Тем не менее, нынешние жесткие электродные сетки не удовлетворяют потребности в записи мозга с высоким разрешением и долгосрочной биоинтеграции. В последнее время были предложены соответствующие электродные решетки для достижения долгосрочной стабильности имплантата с высокой производительностью. Тем не менее, необходимы доклинические исследования этих новых технологий имплантатов, чтобы подтвердить их долгосрочную функциональность и профиль безопасности для переноса на людей. В этом контексте модели свиней обычно используются при разработке медицинских устройств из-за их больших размеров органов и простоты обращения с животными. Тем не менее, в литературе описано лишь несколько применений мозга, в основном из-за ограничений хирургического вмешательства и интеграции системы имплантатов на живом животном.
Здесь мы сообщаем о методе длительной имплантации (6 месяцев) и оценке мягких ECoG-матриц в модели минипига. В исследовании впервые представлена система имплантатов, состоящая из мягкой микроизготовленной электродной решетки, интегрированной с полимерным трансдермальным портом, совместимым с магнитно-резонансной томографией (МРТ), в котором размещены инструментальные разъемы для электрофизиологических записей. Затем в исследовании описывается хирургическая процедура, от субдуральной имплантации до восстановления животного. Мы сосредоточимся на слуховой коре как на целевой области, где вызванные потенциалы индуцируются акустической стимуляцией. Наконец, мы описываем последовательность сбора данных, которая включает в себя МРТ всего мозга, электрохимическую характеристику имплантата, интраоперационную и свободно движущуюся электрофизиологию, а также иммуногистохимическое окрашивание извлеченного мозга.
Эта модель может быть использована для исследования безопасности и функциональности новой конструкции кортикальных протезов; Обязательное доклиническое исследование, позволяющее представить себе трансляцию для пациентов.
Introduction
Неврологические нарушения и заболевания можно диагностировать или лечить с помощью электрокортикографии (ЭКоГ). Эти электродные сетки имплантируются на поверхность мозга и позволяют регистрировать или стимулировать кору головного мозгачеловека. Например, в случае лекарственно-устойчивой эпилепсии они помогают разграничить эпилептическую область для резекции2. В долгосрочных приложениях, таких как интерфейсы мозг-компьютер, эти эпикортикальные электроды используются для записи намерения движения мозга, для управления роботизированными конечностями парализованныхпациентов. Однако современные электродные сетки изготавливаются из жестких металлических блоков, встроенных в жесткие полимерные подложки, и не отвечают потребности в записи мозга с высоким разрешением и длительной субдуральной биоинтеграции (>30 дней). Скорее, они создают местные тканевые реакции, которые приводят к фиброзной инкапсуляции имплантированного устройства, что со временем приводит к ухудшению производительности. В последнее время были предложены гибкие или растяжимые электродные решетки с использованием тонких полимерных подложек, изготовленных методами микрофабрикации, для достижения высоких показателей при длительных имплантациях за счет ограничения тканевой реакции 4,5. Тем не менее, доклинические исследования этих новых технологий имплантатов необходимы для подтверждения их долгосрочной функциональности и профиля безопасности, чтобы можно было представить себе их применение на людях. В этом контексте модели минипигов и свиней обычно используются при разработке устройств в других медицинских контекстах (например, в сердечно-сосудистой, скелетной или желудочной системах) из-за их больших размеров органов и простоты обращения с животными 6,7,8. Тем не менее, в литературе описано лишь несколько применений, нацеленных на нейрофизиологию головного мозга, в основном из-за ограничений хирургического доступа и интеграции системы имплантатов на живом животном 9,10,11,12. Они часто несовместимы с хронической имплантацией живым животным, так как потребовали бы, например, разработки сложного аппаратного обеспечения, такого как имплантируемая встраиваемая электроника. Кроме того, они не исследуют влияние системы имплантатов на ткани-мишени, что имеет решающее значение для аспекта биобезопасности в трансляционных исследованиях. Модель свиньи близка к анатомии человека с точки зрения строения коры головного мозга, костей черепа и толщины кожи13. Кроме того, их способность обучаться поведенческим задачам делает их мощной моделью для исследования стратегий функциональной реабилитации илисенсорного восприятия.
Внедрение новых технологий и методов лечения на человека требует оценки безопасности и эффективности, как того требуют компетентные медицинские органы. Они, как правило, описываются в технических документах и нормах15, однако они требуют только прохождения этих испытаний и не исследуют фактический эффект имплантации устройства или сбора других полезных данных параллельно с исследованием безопасности. Для полного исследования биобезопасности и производительности головного мозга мы представляем здесь лонгитюдный и систематический сбор данных визуализации мозга, электрофизиологических измерений, оценки электрохимических свойств имплантированных электродов и посмертной гистологии на модели свиньи. Для достижения этой цели необходимо учесть несколько аспектов, чтобы создать полную экспериментальную модель: (i) минимально инвазивный хирургический доступ для имплантации устройства вместе с механически стабильным трансдермальным портом для подключения к электродам, (ii) надежная парадигма электрофизиологической регистрации, которая служит производительностью для имплантированных электродов как под наркозом, так и в свободно движущихся условиях, (iii) визуализация in vivo (компьютерная томография [КТ] и/или магнитно-резонансная томография [МРТ]) в различные моменты времени для отслеживания эволюции мозга и имплантата, а также совместимости имплантированной системы с оборудованием для визуализации, и (iv) подготовка тканей для извлечения мозга для гистологического анализа.
Здесь мы сообщаем о методе длительной имплантации (6 месяцев) и оценке мягких ECoG-матриц в модели минипига (схематически показана на рисунке 1). Мягкие электродные решетки, представленные в наших предыдущих докладах, изготовлены из тонких силиконовых мембран со встроенными эластичными золотыми тонкими пленками, используемыми в качестве электрических дорожек16,17. Контакт с тканью осуществляется через смесь наночастиц платины, встроенных в силиконовую матрицу для мягкого и эффективного электрохимического интерфейса с тканью мозга18. Имплантаты соединяются через гибкий кабель, туннелированный субдурально через череп и кожу, к трансдермальному порту, в котором размещаются коннекторы на голове животного. Размер и форма имплантата могут быть изменены в соответствии с целью и потребностями исследования. Текущие электродные полоски в этом исследовании отражают реальный размер клинических полосок. Клинически доступные субдуральные полоски и сетки использовали в качестве компараторов с использованием того же подхода. Полимерный трансдермальный порт, совместимый с МРТ, размещается на черепе с помощью системы подножки, которая надежно фиксирует его на черепе. Здесь мы подробно опишем хирургическую процедуру, от субдуральной имплантации обоих полушарий до восстановления животного. В качестве мишени мы сосредоточимся на слуховой коре, где вызванные потенциалы индуцируются акустической стимуляцией как в условиях анестезии, так и в условиях свободного движения. В разные моменты времени мозг животного визуализируется на МРТ (или КТ для клинических электродов) под наркозом и измеряются электрохимические свойства электродов. Методы определения характеристик электродов используются для отслеживания эволюции имплантата и границы раздела электрод-ткань (см. Schiavone et al.19 для получения более подробной информации). К ним относятся хроноамперометрия для проверки способности электродного контакта к стимуляции, электрохимическая импедансная спектроскопия (EIS), которая может указать на эволюцию резистивных и емкостных компонентов электрода, а также измерения межканального сопротивления для обнаружения разрушений герметичной инкапсуляции. Наконец, мы разработали конвейер для извлечения тканей для перфузии мозга после эвтаназии, эксплантации его с установленными электродами, разрезания и проведения гистологического анализа с использованием различных маркеров воспаления. В целом, этот метод позволит проводить доклинические исследования с надежным мультимодальным сбором данных для будущего клинического применения новых технологий и методов лечения мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье мы приводим метод длительной имплантации и оценки мягких матриц ECoG. В этом исследовании мы разработали последовательный, минимально инвазивный хирургический подход для двусторонней имплантации функциональных электродных сеток над височными долями (в данном случае, нацеленными на слуховую кору). Сначала мы оценили функциональность сетки, успешно зарегистрировав вызванные потенциалы в течение всего периода исследования (6 месяцев) и отследив электрохимические свойства электродов (см. рис. 6). Во-вторых, мы оценили биобезопасность сеток in vivo с помощью МРТ и создания полностью МРТ-совместимой системы, а также после вскрытия, разработав протокол забора тканей и иммуноокрашивания.
Чтобы свести к минимуму инвазивность, мы оптимизировали размер окна трепанации черепа. Для того, чтобы добраться до слуховой коры, расположенной на височной доли, и избежать резекции височной мышцы, мы разработали технику скольжения имплантата под твердую мозговую оболочку. Этот метод позволяет резко уменьшить поверхность облученного мозга и при этом достичь удаленных целей. Хотя этот тип имплантации может показаться слепым, применение рентгеноконтрастных маркеров на устройствах, которые визуализируются на интраоперационном рентгеновском снимке, позволяет проверить позиционирование и гарантирует, что решетка не будет свернута под твердую мозговую оболочку. Субдуральное скольжение оказалось безопасным в большинстве повторений, которые мы выполняли. Кроме того, дюротомия в разрезе сводит к минимуму выпячивание мозга во время открытой трепанации черепа и облегчает закрытие вокруг имплантата, не требуя дополнительного материала, такого как искусственная твердая мозговая оболочка, которая может повлиять на воспалительную реакцию. Наконец, сильной стороной этого хирургического подхода является его способность транспонироваться в различные области коры головного мозга. Игра с координатами, положением трепанации черепа и размером устройства, которые можно регулировать, позволяет этому методу воздействовать на большую часть области коры головного мозга.
Хирургический метод, представленный здесь, наряду с функциональной оценкой и исследованием биоинтеграции с течением времени, не ограничивается технологией мягких электродов, используемой в этом отчете. Другие субдуральные электроды, которые разрабатываются для перевода человеком, могут быть оценены с помощью того же протокола. Преимущество этого метода заключается в том, что большинство деталей, таких как кабель и пьедестал, являются модульными, настраиваемыми и могут быть адаптированы к конкретному тестируемому устройству. Кроме того, интракортикальные или глубоко проникающие зонды также могут использоваться вместо или в сочетании с субдуральными электродами, поскольку для этого требуется только корректировка геометрии черепа и дюротомии. Затем долгосрочные результаты можно сравнить с их клиническими аналогами, как мы сделали здесь.
Одним из основных ограничений представленного метода является наличие пазух черепа у минипигов, которые развиваются в течениепервого года жизни. В связи с этим важными аспектами, которые следует учитывать, являются возраст имплантации, а также размер животного. Выполнение трепанации черепа у взрослого человека нарушает целостность пазух носа и приводит к высокому риску серьезной инфекции в хронических условиях. Такие пазухи видны на рентгенограмме плоскости и компьютерной томографии перед операцией. С другой стороны, проведение хронической имплантации слишком рано, у слишком маленького животного, также не является оптимальным, когда череп подвергается массивному росту и ремоделированию. Мы предположили, что эти «движения черепа» после операции могут привести к смещению и сгибанию имплантата, что в конечном итоге наносит ущерб эксперименту. Мы обнаружили, что геттингенские минипиги, возраст которых на момент имплантации составляет примерно 5-6 месяцев (и 8 кг), должны давать наилучшие результаты.
Для оценки эффективности имплантированного ЭКоГ для электрофизиологических записей мы разработали экспресс-протокол регистрации слухового вызванного потенциала (AEP), который может быть использован у свободно движущихся животных и под седацией. Он состоит из представления серии акустических тоновых всплесков на определенных частотах в течение нескольких минут. Преимуществом такого протокола является тот факт, что его можно настроить на доступную длину записи за счет уменьшения количества зондируемых частот. Одна из сложностей при регистрации корковых сигналов под наркозом заключается в том, что при анализе и сравнении данных следует учитывать уровень сознания животного.
Протокол перфузии корректировался с течением времени путем наблюдения за качеством извлеченного мозга. Действительно, мы обнаружили, что легче катетеризировать только сонную артерию, а не яремную вену. Первоначально в литературе представлены методы, при которых яремная вена катетеризируется для дренирования отходов20. На практике это ограничивает отток из мозга и приводит к ухудшению извлечения крови и общему качеству перфузии. Перерезав яремную вену и оставив жидкость выходить наружу в большой емкости, где лежит животное, эффективность перфузии повышается.
Мы разработали надежный метод подготовки тканей, который работает с антителами, обычно используемыми для отслеживания воспаления. Мы разделили два полушария из практических соображений, так как половина мозга свиньи помещается на стандартных предметных стеклах микроскопа и, таким образом, совместима с большинством диагностического оборудования, доступного в гистологических лабораториях. При разрезании мозга на блоки становится возможным прямой доступ к интересующей зоне, не требуя дальнейшего разрезания всего мозга или обрезки обширных участков ткани. Срезы мозга размером 40 мкм могут быть объединены в стандартные планшеты и окрашены свободно плавающим способом без существенных изменений протокола со стороны иммуноокрашивания других видов. Полное иммунное окрашивание головного мозга также может быть представлено с использованием, например, методов CLARITY21.
В целом, этот протокол, который охватывает персонализированный дизайн имплантата до имплантации, последующее наблюдение за функциональностью и оценку биобезопасности, является надежным и последовательным. Здесь мы продемонстрировали его возможность изучения слуховой системы, но он может быть транспонирован для проверки других физиологических функций. Более того, сила нашего метода заключается в том, что он не ограничивается минипигами, а полностью переносится на другие виды, такие как овцы, козы или нечеловекообразные приматы. В определенной степени он также может быть легко адаптирован к крысам.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Бертарелли и грантового CRSII5_183519 SNSF Sinergia. Авторы также хотели бы поблагодарить Катю Галан из EPFL за помощь в разработке протокола окрашивания для гистологии, сотрудников платформы нейронных микросистем Центра био- и нейроинженерии Висса в Женеве за помощь в процессах изготовления, персонал платформы для животных в Университетском медицинском центре (CMU) при Университете Женевы (UNIGE) по уходу за животными, хирургическая помощь и послеоперационное ведение минипига (Джон Подгузник, Ксавье Белин, Фабьен Фонтао и Валид Хабре), члены команды Центра биомедицинской визуализации (CIBM) при Женевском университете (Жюльен Сонжон, Франсуа Лазейрас и Рареш Саломир), сотрудники отделения патологии Университетской клиники Женевы (HUG) (Сами Шранц, Франческа Версили, Рубен Сото и Коралина Эггер), а также Блез Ивер из Университета Гренобль-Альпы за его вклад и обмен мнениями об экспериментах с хроническими минипигами. Авторы выражают признательность сотрудникам компании Neurosoft Bioelectronics SA за помощь в процессе изготовления и за помощь в экспериментах с минипигами (Бенуа Юге и Марго Руле).
Materials
| Bone drill | BBraun | Elan 4 with GA861 handpiece | |
| Bone drill bit | BBraun | Neurocutter GP204R | |
| Bonewax | Ethicon | W31G | |
| Catheter | Venisystems | Abbocath 14G | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Gelfoam | Pfizer | Gelfoam | |
| Insert speakers | Etymotic | Etymotic ER2 insert Earphones | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 1700 | |
| Oscilloscope | Tektronix | MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope | |
| Perfusion pump | Shenzen | LabS3/UD15 | |
| Potentiostat | Gamry Instruments | Reference 600 | |
| Primary Antibody Anti-GFAP | Thermofischer | Anti-GFAP, Rat, # 13-0300 | |
| Primary Antibody Anti-Iba1 | Fujifilm | Anti Iba1, Rabbit, 019-19741 | |
| Primary Antibody Anti-NeuN | SigmaAldrich | Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90 | |
| Pulse Generator | AM Systems | Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | |
| Recording headstage | Multichannel systems | W2100-HS32 | |
| Recording system | Multichannel systems | W2100 | |
| Screwdriver | Medtronic | Handle: 001201, Shaft: 8001205 | |
| Secondary Antibody 488 | Thermofischer | Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006 | |
| Secondary Antibody 555 | Thermofischer | Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435 | |
| Secondary Antibody 647 | Thermofischer | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245 | |
| Slide Scanner | Olympus | VS120 | |
| Snapfrost | Excilone | Excilone Snapfrost | |
| Stab knife | Fine Science Tools | 10316-14 | |
| Suture wire dermal | Ethicon | Vicryl 2-0 | |
| Suture wire dura mater | Ethicon | Mersilk 5-0 | |
| Suture wire for catheter | Ethicon | Vycril 3-0 without needle | |
| Suture wire for lifting dura | Ethicon | Prolene 6-0 with BV-1 needle | |
| Suture wire subcutaneous | Ethicon | Vicryl 4-0 | |
| Titanium bridge | Medtronic | TiMesh 015-2001-4 | Cut out the required size |
| Titanium screws | Medtronic | 9001635, 9001640 | |
| X-ray system | GE | GE OEC 9800 Plus C-Arm |
References
- Ritaccio, A. L., Brunner, P., Schalk, G. Electrical stimulation mapping of the brain: Basic principles and emerging alternatives. Journal of Clinical Neurophysiology. 35 (2), 86-97 (2018).
- Mullin, J. P., Sexton, D., Al-Omar, S., Bingaman, W., Gonzalez-Martinez, J. Outcomes of subdural grid electrode monitoring in the stereoelectroencephalography era. World Neurosurgery. 89, 255-258 (2016).
- Vansteensel, M. J., et al. Fully implanted brain-computer interface in a locked-in patient with ALS. The New England Journal of Medicine. 375 (21), 2060-2066 (2016).
- Lacour, S. P., Courtine, G., Guck, J. Materials and technologies for soft implantable neuroprostheses. Nature Reviews. Materilas. 1, 16063 (2016).
- Fallegger, F., Schiavone, G., Lacour, S. P. Conformable hybrid systems for implantable bioelectronic interfaces. Advanced Materials. 32 (15), 1903904 (2019).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
- Khoshnevis, M., et al. Development of induced glioblastoma by implantation of a human xenograft in Yucatan minipig as a large animal model. Journal of Neuroscience Methods. 282, 61-68 (2017).
- Borton, D., et al. Developing implantable neuroprosthetics: A new model in pig. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society. 2011, 3024-3030 (2011).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Gierthmuehlen, M., et al. Evaluation of mECoG electrode arrays in the minipig: Experimental procedure and neurosurgical approach. Journal of Neuroscience Methods. 202 (1), 77-86 (2011).
- Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. Journal of Neuroscience Methods. 366, 109427 (2022).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Structure & Function. 222 (5), 2093-2114 (2017).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Shepherd, R. K., Villalobos, J., Burns, O., Nayagam, D. A. X. The development of neural stimulators: A review of preclinical safety and efficacy studies. Journal of Neural Engineering. 15 (4), 041004 (2018).
- Schiavone, G., et al. Soft, implantable bioelectronic interfaces for translational research. Advanced Matererials. 32 (17), 1906512 (2020).
- Fallegger, F., et al. MRI-compatible and conformal electrocorticography grids for translational research. Advanced Science. 8 (9), 2003761 (2021).
- Minev, I. R., Wenger, N., Courtine, G., Lacour, S. P. Research update: Platinum-elastomer mesocomposite as neural electrode coating. APL Materials. 3 (1), 014701 (2015).
- Schiavone, G., et al. Guidelines to study and develop soft electrode systems for neural stimulation. Neuron. 108 (2), 238-258 (2020).
- Musigazi, G. U., De Vleeschauwer, S., Sciot, R., Verbeken, E., Depreitere, B. Brain perfusion fixation in male pigs using a safer closed system. Laboratory Animals. 52 (4), 413-417 (2018).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
