Summary

Субдуральная мягкая электрокортикография (ЭКоГ) Имплантация решетки и долговременная кортикальная регистрация у минипигов

Published: March 31, 2023
doi:

Summary

В данной работе мы представляем метод долгосрочной оценки работоспособности и безопасности мягких субдуральных электродных решеток в модели минипига, описывающий хирургический метод и инструменты, послеоперационную магнитно-резонансную томографию, электрофизиологию слуховой коры, электрохимические свойства имплантата и посмертную иммунохимию.

Abstract

Неврологические нарушения и заболевания можно диагностировать или лечить с помощью электрокортикографии (ЭКоГ). При лекарственно-устойчивой эпилепсии они помогают разграничить эпилептическую область для резекции. В долгосрочных приложениях, таких как интерфейсы мозг-компьютер, эти эпикортикальные электроды используются для записи намерения движения мозга, для управления роботизированными конечностями парализованных пациентов. Тем не менее, нынешние жесткие электродные сетки не удовлетворяют потребности в записи мозга с высоким разрешением и долгосрочной биоинтеграции. В последнее время были предложены соответствующие электродные решетки для достижения долгосрочной стабильности имплантата с высокой производительностью. Тем не менее, необходимы доклинические исследования этих новых технологий имплантатов, чтобы подтвердить их долгосрочную функциональность и профиль безопасности для переноса на людей. В этом контексте модели свиней обычно используются при разработке медицинских устройств из-за их больших размеров органов и простоты обращения с животными. Тем не менее, в литературе описано лишь несколько применений мозга, в основном из-за ограничений хирургического вмешательства и интеграции системы имплантатов на живом животном.

Здесь мы сообщаем о методе длительной имплантации (6 месяцев) и оценке мягких ECoG-матриц в модели минипига. В исследовании впервые представлена система имплантатов, состоящая из мягкой микроизготовленной электродной решетки, интегрированной с полимерным трансдермальным портом, совместимым с магнитно-резонансной томографией (МРТ), в котором размещены инструментальные разъемы для электрофизиологических записей. Затем в исследовании описывается хирургическая процедура, от субдуральной имплантации до восстановления животного. Мы сосредоточимся на слуховой коре как на целевой области, где вызванные потенциалы индуцируются акустической стимуляцией. Наконец, мы описываем последовательность сбора данных, которая включает в себя МРТ всего мозга, электрохимическую характеристику имплантата, интраоперационную и свободно движущуюся электрофизиологию, а также иммуногистохимическое окрашивание извлеченного мозга.

Эта модель может быть использована для исследования безопасности и функциональности новой конструкции кортикальных протезов; Обязательное доклиническое исследование, позволяющее представить себе трансляцию для пациентов.

Introduction

Неврологические нарушения и заболевания можно диагностировать или лечить с помощью электрокортикографии (ЭКоГ). Эти электродные сетки имплантируются на поверхность мозга и позволяют регистрировать или стимулировать кору головного мозгачеловека. Например, в случае лекарственно-устойчивой эпилепсии они помогают разграничить эпилептическую область для резекции2. В долгосрочных приложениях, таких как интерфейсы мозг-компьютер, эти эпикортикальные электроды используются для записи намерения движения мозга, для управления роботизированными конечностями парализованныхпациентов. Однако современные электродные сетки изготавливаются из жестких металлических блоков, встроенных в жесткие полимерные подложки, и не отвечают потребности в записи мозга с высоким разрешением и длительной субдуральной биоинтеграции (>30 дней). Скорее, они создают местные тканевые реакции, которые приводят к фиброзной инкапсуляции имплантированного устройства, что со временем приводит к ухудшению производительности. В последнее время были предложены гибкие или растяжимые электродные решетки с использованием тонких полимерных подложек, изготовленных методами микрофабрикации, для достижения высоких показателей при длительных имплантациях за счет ограничения тканевой реакции 4,5. Тем не менее, доклинические исследования этих новых технологий имплантатов необходимы для подтверждения их долгосрочной функциональности и профиля безопасности, чтобы можно было представить себе их применение на людях. В этом контексте модели минипигов и свиней обычно используются при разработке устройств в других медицинских контекстах (например, в сердечно-сосудистой, скелетной или желудочной системах) из-за их больших размеров органов и простоты обращения с животными 6,7,8. Тем не менее, в литературе описано лишь несколько применений, нацеленных на нейрофизиологию головного мозга, в основном из-за ограничений хирургического доступа и интеграции системы имплантатов на живом животном 9,10,11,12. Они часто несовместимы с хронической имплантацией живым животным, так как потребовали бы, например, разработки сложного аппаратного обеспечения, такого как имплантируемая встраиваемая электроника. Кроме того, они не исследуют влияние системы имплантатов на ткани-мишени, что имеет решающее значение для аспекта биобезопасности в трансляционных исследованиях. Модель свиньи близка к анатомии человека с точки зрения строения коры головного мозга, костей черепа и толщины кожи13. Кроме того, их способность обучаться поведенческим задачам делает их мощной моделью для исследования стратегий функциональной реабилитации илисенсорного восприятия.

Внедрение новых технологий и методов лечения на человека требует оценки безопасности и эффективности, как того требуют компетентные медицинские органы. Они, как правило, описываются в технических документах и нормах15, однако они требуют только прохождения этих испытаний и не исследуют фактический эффект имплантации устройства или сбора других полезных данных параллельно с исследованием безопасности. Для полного исследования биобезопасности и производительности головного мозга мы представляем здесь лонгитюдный и систематический сбор данных визуализации мозга, электрофизиологических измерений, оценки электрохимических свойств имплантированных электродов и посмертной гистологии на модели свиньи. Для достижения этой цели необходимо учесть несколько аспектов, чтобы создать полную экспериментальную модель: (i) минимально инвазивный хирургический доступ для имплантации устройства вместе с механически стабильным трансдермальным портом для подключения к электродам, (ii) надежная парадигма электрофизиологической регистрации, которая служит производительностью для имплантированных электродов как под наркозом, так и в свободно движущихся условиях, (iii) визуализация in vivo (компьютерная томография [КТ] и/или магнитно-резонансная томография [МРТ]) в различные моменты времени для отслеживания эволюции мозга и имплантата, а также совместимости имплантированной системы с оборудованием для визуализации, и (iv) подготовка тканей для извлечения мозга для гистологического анализа.

Здесь мы сообщаем о методе длительной имплантации (6 месяцев) и оценке мягких ECoG-матриц в модели минипига (схематически показана на рисунке 1). Мягкие электродные решетки, представленные в наших предыдущих докладах, изготовлены из тонких силиконовых мембран со встроенными эластичными золотыми тонкими пленками, используемыми в качестве электрических дорожек16,17. Контакт с тканью осуществляется через смесь наночастиц платины, встроенных в силиконовую матрицу для мягкого и эффективного электрохимического интерфейса с тканью мозга18. Имплантаты соединяются через гибкий кабель, туннелированный субдурально через череп и кожу, к трансдермальному порту, в котором размещаются коннекторы на голове животного. Размер и форма имплантата могут быть изменены в соответствии с целью и потребностями исследования. Текущие электродные полоски в этом исследовании отражают реальный размер клинических полосок. Клинически доступные субдуральные полоски и сетки использовали в качестве компараторов с использованием того же подхода. Полимерный трансдермальный порт, совместимый с МРТ, размещается на черепе с помощью системы подножки, которая надежно фиксирует его на черепе. Здесь мы подробно опишем хирургическую процедуру, от субдуральной имплантации обоих полушарий до восстановления животного. В качестве мишени мы сосредоточимся на слуховой коре, где вызванные потенциалы индуцируются акустической стимуляцией как в условиях анестезии, так и в условиях свободного движения. В разные моменты времени мозг животного визуализируется на МРТ (или КТ для клинических электродов) под наркозом и измеряются электрохимические свойства электродов. Методы определения характеристик электродов используются для отслеживания эволюции имплантата и границы раздела электрод-ткань (см. Schiavone et al.19 для получения более подробной информации). К ним относятся хроноамперометрия для проверки способности электродного контакта к стимуляции, электрохимическая импедансная спектроскопия (EIS), которая может указать на эволюцию резистивных и емкостных компонентов электрода, а также измерения межканального сопротивления для обнаружения разрушений герметичной инкапсуляции. Наконец, мы разработали конвейер для извлечения тканей для перфузии мозга после эвтаназии, эксплантации его с установленными электродами, разрезания и проведения гистологического анализа с использованием различных маркеров воспаления. В целом, этот метод позволит проводить доклинические исследования с надежным мультимодальным сбором данных для будущего клинического применения новых технологий и методов лечения мозга.

Protocol

Хирургические и поведенческие процедуры были одобрены местным этическим комитетом в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены местными (кантон Женева) и федеральными (Швейцария) ветеринарными органами с номером разрешения GE11120A. В данном исследовании использовались самки геттингенских минипигов (n = 7) в возрасте 2-6 месяцев (5-8 кг). 1. Предоперационное планирование Характеристика системы мягких имплантатов in vitroХроноамперометрия: Регистрация падения напряжения при инжекции двухфазного импульса тока (т. е. переходного напряжения [VT]) с помощью осциллографа, подключенного параллельно к генератору импульсов. Последовательно подключите генератор импульсов к каждому электроду и счетчику платины в физиологическом растворе (фосфатно-солевой буфер [PBS] 1x). Обратитесь к шагу 3.1 для получения настроек. Электрохимическая импеданс-спектрограмма: Измерьте электрохимический импеданс на разных частотах с помощью потенциометра. Последовательно подключите потенциометр к каждому электроду с помощью платинового счетчика и электрода сравнения Ag/AgCl в физиологическом растворе (PBS 1x). Обратитесь к шагу 3.2 для получения настроек. Межканальное сопротивление: в сухом состоянии измерьте сопротивление постоянному току (DC) между соседними каналами с помощью ручного мультиметра. Выбор имплантата: После трех измерений, приведенных выше, выберите имплантат со следующими критериями: импеданс на 1 кГц ниже 100 кОм и отсутствие межканального сопротивления ниже 1 МОм. СтерилизацияСтерилизация имплантатов: Поместите выбранные имплантаты по отдельности в стерилизационные пакеты вместе со стерилизационным маркером и запечатайте их. Используйте двойную упаковку, чтобы обеспечить стерильность во время операции.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае используется газовая стерилизация перекисью водорода (H2O2) из-за короткого временного цикла и низкой температуры (55 °C). Альтернативой является газообразная стерилизация окисью этилена (ETO) или автоклавная стерилизация, но должна быть обеспечена совместимость с системой имплантатов. Стерилизация инструментов: Поместите очищенные инструменты в двойные стерилизационные пакеты или стерильные коробки для инструментов вместе со стерилизационными маркерами. Стерилизация в автоклаве наиболее распространена для инструментов, но H 2O2 или ETO являются возможными альтернативами. 2. Хирургическая имплантация мягких матриц ECoG АнестезияПремедикация: Изолируйте животное и голодайте в течение ночи. Вводят внутрикожно смесь мидазолама в дозе 0,75 мг/кг, атропина в дозе 0,25 мкг/кг и халдола в дозе 0,1 мг/кг и ждать, пока животное не будет успокоено. Взвесьте животное, прежде чем продолжить. Установка внутривенного (в/в) отведения:Положите животное на операционный стол на грелку. Вызвать анестезию, надев на животное маску для лица, используя севофлуран в дозе 3%-3,5%. Поместите электрокардиограмму на живот, датчик насыщения крови на хвост, а датчик температуры в ноздрю. Поместите внутривенный провод в ушную вену и подтвердите доступ крови с помощью шприца, наполненного физиологическим раствором. Обеспечьте увлажнение глаз с помощью мази. Интубация: Вводят болюс атракуриума в дозе 0,5 мг/кг, кетамина в дозе 1 мг/кг и фентанила в дозе 1-2 мкг/кг. Положите животное на спину для интубации. Вставьте трубку диаметром 4,5 мм. Медикаментозное лечение: После интубации прекратить анестезию севофлураном и установить инфузию пропофола в дозе 10 мг/кг/ч, фентанила в дозе 2 мкг/кг/ч, атракурия в дозе 0,2-0,5 мг/кг/ч и физиологический раствор в дозе 4-7 мг/кг/ч. Начните инфузию маннита в дозе 1 г/кг/ч, чтобы уменьшить отек мозга во время операции.ПРИМЕЧАНИЕ: Мультимодальный режим анальгезии может быть использован по рекомендации местного комитета по этике животных. Предоперационный рентгенПоложите животное на живот в позу сфинкса. Временно удалите любой металлический предмет в непосредственной близости от мозга и черепа животного (например, температурный свинец в ноздре). Получают осевой и сагиттальный плоский рентгеновский снимок с контрастированием кости. Поместите металлический предмет с известными размерами в сагиттальное поле захвата, который будет служить шкалой для измерения толщины черепа в передней и задней частях мозга. Определите расположение лобных пазух (видимых по пустотам под черепом) и отметьте самое заднее место на голове животного с помощью перманентного маркера. Это укажет самую дальнюю точку, где может быть выполнена трепанация черепа или установка винта в хирургическом доступе, описанном ниже. Подготовка асептического поля и кожи: Сбрить всю поверхность головы за пределами операционного поля. Используя стерильную салфетку, тщательно потрите голову бетадином. Затем наденьте стерильные простыни на инструментальный стол и на животное, чтобы открыть только операционное окно. Наконец, снова потрите голову стерильной салфеткой с использованием бетадина. Трепанация черепа и дуротомияРазрез кожи: Надрежьте кожу ножом для скальпеля по средней линии. Отделите мышцу и надкостницу (25 мм латерально от брегмы с обеих сторон и 40 мм спереди и сзади от брегмы) от кости с помощью рашпиля и установите разбрасыватели, чтобы получить оптимальный доступ для последующего сверления. Измерения и маркировка: Определите брегму и лямбду и пометьте их стерильной хирургической ручкой (рис. 2A, B). Используя стерильную линейку, определите контур костного лоскута с центром вокруг мишени имплантации в обоих полушариях. В данном конкретном случае была выбрана слуховая кора с координатами от -5 мм до -15 мм от брегмы и от -4 мм до -20 мм латерально. Затем подгоните трепанацию черепа под размер имплантата и анатомических ориентиров, ограничив размер отверстия. Трепанация черепа:С помощью костного сверла с круглым режущим сверлом просверлите контур трепанации черепа с учетом толщины черепа, измеренной на шаге 2.2. Орошайте место сверления солевым раствором, чтобы избежать перегрева кости. Осторожно просверлите контур равномерно, пока не дойдете до твердой мозговой оболочки. При первом прорыве закончите сверлить контур до тех пор, пока он не станет достаточно тонким, чтобы почти прорваться. Затем плоским шпателем (либо со стороны средней линии, либо с боковой стороны), чтобы отломить костный лоскут целиком, используя краниотомический край в качестве рычага. Если сопротивление слишком сильное, продолжайте истончать кость. Поместите кусочек кости в стерильный физиологический раствор. После того, как костный лоскут удален, осторожно отколите край краниотомии с помощью керисона, чтобы острый костный край не врезался в твердую мозговую оболочку. При чрезмерном кровотечении на твердой мозговой оболочке или кости используйте гель или костный воск соответственно. Поместите влажный компресс (стандартную прокладку в стерильный физиологический раствор) в трепанацию черепа и повторите этот шаг на другой полусфере (Рисунок 2B). Дуротомия:Используя иглу из шовного набора 6-0, осторожно проткните и приподнимите твердую мозговую оболочку на переднем или заднем конце черепа на полпути между медиальной и латеральной сторонами и создайте начало разреза ножом. Затем с помощью небольшого плоского шпателя, введенного в субдуральное пространство, выступающего в качестве режущей основы для защиты коры, создайте переднезаднюю щель в твердой мозговой оболочке, продвигаясь одновременно обоими инструментами. Убедитесь, что разрез немного больше, чем ширина имплантата (Рисунок 2C). Если на этом этапе возникло какое-либо кровотечение или повреждение, покройте его гелевой пеной и подождите, пока оно прекратится.ПРИМЕЧАНИЕ: Траектория разреза должна быть адаптирована, если в твердой мозговой оболочке присутствуют крупные кровеносные сосуды, чтобы избежать кровотечения. ИмплантацияУстановка устройства:Орошайте имплантат (дополнительный рисунок 1A) физиологическим раствором с обеих сторон, чтобы он легче скользил в субдуральное пространство. Поместите имплантат над щелью твердой мозговой оболочки и с помощью небольших щипцов субдурально введите устройство, последовательно сдвинув его по каждому краю. Осторожно возьмитесь за пьедестал и продвигайтесь вместе с имплантатом, чтобы не создавать натяжения, препятствующего введению. Когда край соединителя окажется в верхней части прорези, остановите вставку. Закрепите имплантат: Чтобы закрепить имплантат на месте, поместите титановый мост на трос после края краниотомии или в анкерные крылья и закрепите его одним или двумя титановыми винтами с помощью соответствующей отвертки (Рисунок 2D). Заземление: Осторожно снимите 1 см изоляции проводов заземления и вставьте ее эпидурально на задний конец краниотомии (или в любом эпидуральном месте, удаленном от интересующей коры головного мозга или крупных кровеносных сосудов) (проволока на рисунке 2E) Повторите шаги 2.4.4. и 2.5.1.-2.5.3 на контралатеральном полушарии. Интраоперационная рентгенография для подтверждения установки:Положите влажную прокладку (стандартную прокладку в стерильном физиологическом растворе) на место операции, чтобы сохранить ткань увлажненной. Затем наденьте стерильную хирургическую простыню, чтобы покрыть голову животного. Сделайте плоские рентгеновские снимки (аксиальные и сагиттальные), чтобы убедиться, что имплантаты правильно расположены и не сгибаются, используя рентгеновские маркеры в качестве индикаторов. Если нет, снимите простыню и извлеките устройство, чтобы снова вставить его (повторите шаги 2.4.4. и 2.5.1.-2.5.3 еще раз). Закрытие твердой мозговой оболочки: Осторожно зашить твердую мозговую оболочку вокруг кабеля имплантата с помощью рассасывающегося шовного материала 3-0 и небольшого иглодержателя. Максимально сблизите два края твердой мозговой оболочки, не разрывая тонкую мембрану шовной проволокой (рис. 2D, E). Установка костного лоскута: Закрепите титановый мост на передней и задней части каждого костного лоскута с помощью титанового винта. Будьте внимательны, чтобы спланировать расположение мостов Ti относительно размещения ножек подножки на следующих шагах. Прикрутите конец титановых мостиков к черепу (рис. 2F, G). Размещение пьедестала и подножкиПозиционирование: В этой конфигурации подножка имеет шесть ножек с двумя отверстиями для винтов каждая (дополнительный рисунок 1B). Спланируйте размещение подножки на черепе, чтобы оптимизировать расположение винтов (избегайте размещения их на краю трепанации черепа или в височной мышце). Пропустите отверстия в ножках, если их нельзя вкрутить. Крепление подножки: Вкрутите титановые винты подножки до тех пор, пока она не встанет на место (см. Рисунок 2H). Установка пьедестала: Снимите титановые перемычки над соединительными кабелями и переверните пьедестал, чтобы приземлиться на подножку. Прикрутите пьедестал к подножке. Убедитесь, что пьедестал надежно закреплен на месте (Рисунок 2I). Наложение швов и закрытиеОчистка раны: Очистите подкожное пространство от любых костей или других загрязнений, промыв физиологическим раствором. Отрежьте немного кожи по краям пьедестала, чтобы создать круглый край после цилиндра. Подкожные швы: Снимите распределители и сложите кожные лоскуты вместе. Создавайте подкожные швы с помощью нерассасывающейся шовной проволоки 4-0 на расстоянии 3 мм друг от друга с помощью простых прерывистых швов или простых непрерывных швов. Начните с постамента, двигаясь к нему по обе стороны от разреза. Дермальные швы: Швы на коже с помощью нерассасывающейся шовной проволоки 6-0 на расстоянии 5 мм друг от друга. Начните с постамента, двигаясь к нему по обе стороны от разреза. Позаботьтесь о том, чтобы обеспечить хорошее расположение тканей между двумя кожными лоскутами и возле края пьедестала, чтобы избежать пустоты (рис. 2J). Повязка на рану: Снова очистите область раны стерильной салфеткой с бетадином. Наложите на рану самоклеящуюся стерильную повязку. Измерения in vivo: Для измерений in vivo следуйте разделам 3, 4 и 5. Пробуждение: После того, как все измерения будут выполнены, снимите с животного все анестетики, но держите на вентиляции легких. Для обезболивания применяют пластырь с бупренорфином (25 мг/ч) в течение 24 ч. Положите животное на грелку, накрытую шторами, чтобы ускорить время пробуждения. Когда самопроизвольное дыхание восстановится, экстубируйте животное и поместите в кислородную маску до тех пор, пока сознание не восстановится (что может занять от 1 до 4 часов). Послеоперационный уход за животным: В течение 5 дней держите животное под пристальным наблюдением. Дают дозу цефалексина по 75 мг два раза в сутки с пищей, отдельно от других животных. Ежедневно проводите дезинфекцию раны, нанося обильное количество бетадина смоченными стерильными прокладками (лучше всего это делать во время кормления).ПРИМЕЧАНИЕ: Долгосрочный уход и содержание: Прооперированное животное содержится в изоляции в течение 24 часов. Его возвращают в исходную социальную группу, если животное достаточно хорошо себя чувствует, чтобы социально взаимодействовать со своими сверстниками. Необходимо проводить ежедневное наблюдение за постаментом и вскрытием кожи, чтобы следить за интеграцией устройства на голове. При необходимости очистите место вокруг пьедестала обильным количеством бетадина. 3. Характеристика мягкого имплантата in vivo Хроноамперометрия: Регистрируйте падение напряжения при инжекции двухфазного импульса тока (т.е. VT) с помощью осциллографа, подключенного параллельно к генератору импульсов. Последовательно подключите генератор импульсов к каждому электроду и проводу заземления. Проводят стимулирующий импульс при 100 мкА с длительностью импульса 300 мкс при 100 Гц. Электрохимическая импедансная спектроскопия: измерение электрохимического импеданса на различных частотах с помощью потенциометра. Последовательно подключите генератор импульсов к каждому электроду, используя заземляющий провод в качестве встречного электрода и заземления. Установите напряжение возбуждения на 200 мВ и диапазон частот от 1 Гц до 1 МГц, с тремя точками на декаду. Межканальные короткие измерения: Измерьте сопротивление постоянному току между соседними каналами с помощью ручного мультиметра. In vivo межканальное сопротивление постоянному току измеряется только для того, чтобы убедиться в отсутствии дефицита ниже 1 кОм, указывающего на полное разрушение инкапсуляции. 4. Электрофизиологическая регистрация Спонтанная активность: Подключите беспроводную систему записи к пьедесталу и записывайте базовую активность в течение 2-3 минут. Эти записи будут служить контролем для анализа слуховых вызванных потенциалов. Слуховые вызванные потенциалы: В дополнение к беспроводной системе вставьте динамики в закрытое поле в уши животного. Звуковая импульсная акустическая стимуляция воспроизведения на различных частотах (в диапазоне от 200 до 20 000 Гц) при уровне звукового давления (SPL) около 70 дБ в течение 120 повторений. Затем усредните записи и выровняйте их по периоду стимула для анализа. Сенсорные вызванные потенциалы: поместите иглы в рыло в трех разных положениях. Пробуждайте сенсорные потенциалы, стимулируя рыло в течение ~30 с с помощью генератора импульсов с разной амплитудой для получения кривых рекрутинга. 5. Визуализация in vivo Перевозка животных: Держите животное под наркозом пропофола, как описано в шаге 2.1. Используйте транспортировочную тележку, в которой находятся аппарат искусственной вентиляции легких, шприцевой насос и монитор жизненно важных функций, для транспортировки животного из операционной в кабинет визуализации и обратно. Компьютерная томография: поместите животное на стол сканера и удалите все металлические предметы вокруг головы (например, датчик температуры). Получите компьютерную томографию с минимальным разрешением (толщина среза 0,4 мм) с помощью изометрической съемки с автоматическим выбором тока и напряжения для контрастирования кости. Магнитно-резонансная томография: Снимите с животного все оборудование, содержащее металл (используйте совместимые с МРТ внутривенные электроды и интубационную трубку). Держите животное на вентиляции легких и анестезируйте севофлураном под давлением 3%-3,5%, используя аппарат искусственной вентиляции легких, расположенный вне камеры МРТ и подключенный через длинную трубку к животному. Перед первой последовательностью вводят болюс фентанила в дозе 1-2 мкг/кг. Используйте три изометрические последовательности с наименьшим разрешением: T1-, T2- и турбо-спиновое эхо (TSE) взвешенные последовательности (параметры, показанные в дополнительном файле 1). 6. Свободно движущаяся запись Выполните ту же процедуру, что описана в разделе 4, для записи сигналов бодрствования от мозга. Подключите беспроводную головку, держа животное на руках у экспериментатора или кормя его лакомствами, чтобы отвлечь его. Обеспечьте акустическую стимуляцию с помощью внешних динамиков, расположенных близко к животному. 7. Перфузия и подготовка тканей НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Если животное еще не находится под наркозом, следуйте шагу 2.1 для протокола анестезии. Введение катетера в сонную артерию для перфузии (дополнительный рисунок 2)Рассечение сонной артерии и яремной вены: Перерезать горло по средней линии с помощью прижигателя/резака. Сначала разрежьте кожу, а затем мышцу, следуя средней белой линии (без сосудов под ней) (дополнительный рисунок 2А). Далее раскройте, используя пальцы, чтобы освободить пространство вокруг трахеи и под мышцей. Ищите сонную артерию (бьющуюся и розоватую); Блуждающий нерв иногда также находится вокруг (белый), а яремная вена может быть снизу или сбоку (красная). Установите разбрасыватели (см. дополнительный рисунок 2B). Начните рассечение сонной артерии с помощью тонких щипцов и круглых ножниц. Используйте ножницы, чтобы вскрыть соединительную ткань. Если нет кровеносных сосудов, разрежьте; если есть кровеносные сосуды, прижгите и двигайтесь вперед (дополнительный рисунок 2C, D). При достаточном рассечении используйте зажим, чтобы пройти под сонную артерию, чтобы она была полностью изолирована (дополнительный рисунок 2E). Повторите ту же операцию с яремной веной (Дополнительный рисунок 2F). Когда оба сосуда будут полностью рассечены и изолированы, наложите на них шовную проволоку. Пока не закрывайте их. Два шва вокруг сонной артерии, один у самого основания (шов 1 со стороны сердца для перфузии мозга) и один с другой стороны (шов 2), показаны на дополнительном рисунке 2G. Наложите один шов вокруг яремной вены (шов 3), не закрывая; Разметьте провода скотчем для разрезания вены позже. Очень плотно затяните шов 1, иначе он будет кровоточить (дополнительный рисунок 2H). Завяжите три узла. Наложите зажим на проволоку, чтобы придать вес и создать напряжение в сонной артерии. Зажмите сонную артерию с помощью сосудистого зажима на противоположной стороне диссекции сонной артерии (со стороны мозга для перфузии мозга; Дополнительный рисунок 2I). Шов 2 находится посередине, еще не закрыт. Используйте черные щипцы, чтобы захватить и потянуть сонную артерию. С помощью тонких ножниц разрежьте половину сонной артерии у основания рассечения (рядом со швом 1, со стороны сердца; см. дополнительный рисунок 2J). Следите за тем, чтобы срез был максимально аккуратным и доходил до самого сосуда, а не только до «оболочки»; В противном случае катетер не пройдет. Вставьте катетер, как показано на дополнительном рисунке 2K. Промойте и наполните катетер сначала PBS, чтобы в катетере не оставалось воздуха (дополнительный рисунок 2K ). Закройте шов 2 достаточно плотно, чтобы он не отшел, но не слишком сильно, чтобы катетер все еще мог немного двигаться (дополнительный рисунок 2L). Затем снимите зажим сосуда, завершите введение катетера как можно дальше и завершите закрытие шва 2 (плотно закройте). При желании используйте шовные проволоки на шовной нити 1, чтобы прикрепить основание катетера к коже на выходе из раны в качестве дополнительного шага безопасности. Затем переведите животное в зону перфузии и подключите его к PBS/гепарину. Когда начнется перфузия, снять шов 3 и перерезать яремную вену Эвтаназия: Введите пентобарбитал (90 мг/кг) внутривенно и промойте катетер физиологическим раствором, чтобы обеспечить успешное введение полной дозы. Перфузия: С помощью перфузионного насоса (200 мл/мин) вставьте катетер сонной артерии в PBS/гепарин (1 л для свиньи весом 15 кг), а затем в PBS, содержащий 4% параформальдегида (PFA) (5 л для свиньи весом 15 кг). Когда начнется перфузия, снять шов 3 и перерезать яремную вену. Забор тканейОбезглавливание: Когда перфузия закончится, отделите голову животного от тела с помощью скальпеля, разрезав кожу и мышцы и вставив лезвие между первым и вторым позвонками. Постфиксация: Погрузите голову в 4% PFA в PBS еще на 48 ч при 4 °C, а затем переведите в PBS перед удалением мозга. Извлечение головного мозга и имплантатов:Снимите кожу с помощью скальпеля и начните осторожно разрезать кость с помощью ронжера, начиная с первых позвонков, следуя от спинного мозга к мозжечку. После того, как мозжечок обнажен, осторожно удалите височные кости и обнажите теменную и лобную доли. В этот момент открутите пьедестал от подножки и отрежьте ножки подножки плоскогубцами. Удалите кость рядом с кабельным входом в череп, чтобы освободить систему имплантатов от кости, не вытаскивая имплантаты из выхода твердой мозговой оболочки. Если кабели имплантата встроены в кость, обрежьте кабель как можно ближе к выходу. Как только обнажится достаточное количество поверхности мозга, осторожно срежьте твердую мозговую оболочку по средней линии с помощью маленьких ножниц. Освободите кабели имплантата от выхода твердой мозговой оболочки. Сделайте фотографии места установки имплантата в головной мозг. Затем с помощью маленькой ложечки отделите мозг от черепно-мозговых нервов, расположенных ниже. Аккуратно извлеките мозг. Удалите имплантаты из головного мозга. Постфиксация головного мозга: В зависимости от качества перфузии, экстрагированный мозг снова в течение 24 ч в 4% PFA в PBS при 4 °C. Держать в 0,1 м PBS при температуре 4 °C до тех пор, пока мозг не будет разрезан. Разрез мозга: Разделите два полушария с помощью бритвенного лезвия. Затем разрежьте мозг ортогонально на четыре разные части. Разрежьте имплантируемую зону пополам, чтобы получить два блока, содержащих имплантируемую зону и контрольную зону. Сохраните два других блока, если нужно больше контрольных слайдов. Криозащита и замораживание мозга: Перенесите мозговые блоки в раствор сначала 15% сахарозы, а затем 30% сахарозы при 4 °C, пока мозг не погрузится и не достигнет равновесия. Затем заморозьте ткань в изопентане при -55 °C в системе замораживания тканей. 8. Гистология Срезы тканейКриостат: Поместите замороженный мозг в криостат и обрежьте до тех пор, пока не будут получены полные секции. Затем разрежьте мозг на участки по 40 мкм и погрузите группами по три в 0,1 М PBS в луночные планшеты. Внимательно обратите внимание на порядок тарелок. Выбор сечения: Выбор сечений в зависимости от зоны для анализа (имплантируемая область или контрольная зона). Последовательно вынимайте срезы из колодцев, используя тонкую щетку, чтобы осмотреть их на наличие повреждений. Поместите их в новые луночные планшеты, заполненные 0,1 M PBS для дальнейшего окрашивания. ИммуногистохимияПриготовление: Инкубируют срезы в 0,3% Triton X/PBS в течение 15 мин, а затем в 3% бычьем сывороточном альбумине (BSA)/PBS в течение 1 ч при комнатной температуре (RT). Первичные антитела: Инкубируют ткани с первичными антителами в течение 48 ч при РТ (анти-GFAP, крысы, разбавленные в дозе 1/300; анти-Iba1, кролики, разбавленные в дозе 1/400; анти-NeuN, морские свинки, разбавленные в дозе 1/1000; все в 1% BSA/PBS). Накройте пластины лунок алюминиевой фольгой. Промывка: Промыть лунки 0,1 м PBS три раза в течение 5 минут. Вторичные антитела: Инкубируют ткани с вторичными антителами в течение 2 ч при RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; все разбавлены в дозе 1/400 в 1% BSA/PBS). DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол): инкубируют ткани с DAPI в течение 15 мин (1/1000 в 1% BSA/PBS). Промывка: Промыть колодцы 0,1 м PBS пять раз в течение 15 минут. Монтаж: Установите направляющие с помощью монтажного носителя и защитного стекла. Храните слайды в темноте в холодильнике при температуре 4 °C. ОтображениеИзображение всего предметного стекла: Изображение предметных стекол с 10-кратным увеличением (значение рабочего расстояния объектива = 3 100 мкм) с помощью микроскопа-сканера на трех различных длинах волн (640 нм, 560 нм, 485 нм). Всю информацию о мощности и усилении можно найти в Дополнительном файле 2. Микроскопическая визуализация: Изображение интересующей области при 20-кратном увеличении (апохромат 20x/0,8 M27) с помощью конфокального микроскопа на четырех длинах волн (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Всю информацию о мощности и усилении можно найти в Дополнительном файле 3.

Representative Results

Для подтверждения размещения (рис. 3А) и функциональности приборов после установки пьедестала проводится интраоперационная электрофизиологическая регистрация. Исходный сигнал сначала регистрируется в течение 2 мин без стимулов в качестве контроля базальной активности. Во-вторых, животное акустически стимулируют тональным всплеском на разных частотах (500-20 000 Гц), а исходные данные усредняются за период стимула для отображения слуховых вызванных потенциалов по всей решетке (например, при 800 Гц по сравнению с исходным уровнем; Рисунок 3Б). Данные, показанные здесь, не обработаны, но если присутствует слишком много шума, можно применить режекторные и полосовые фильтры. Типичными источниками шума в операционном зале являются электрогрелки, заткнутые бормашины, а также всасывающие или прижигающие устройства (среди прочего), которые следует снять перед приобретением. В записях бодрствования следует избегать больших движений мышц вокруг головы, таких как жевание, для получения более чистых наборов данных. Этот протокол применялся в каждой точке времени записи, и сигналы для одного канала можно было сравнивать с течением времени. Один из примеров проиллюстрирован на рисунке 3C, демонстрируя устойчивость и эволюцию ответа. Регистрационную способность каждого контакта в течение эксперимента можно оценить, вычислив стандартное отклонение базового сигнала в каждый момент времени (рис. 3D). В этом исследовании отношение сигнал/шум уменьшалось и стабилизировалось между 0-м и 6-м днем, несмотря на некоторую вариабельность из-за ограниченной продолжительности периода записи (т.е. 2 минуты). Это может быть дополнительно соотнесено с импедансами электродов. Визуализация in vivo проводится в послеоперационном периоде для оценки состояния мозга и позиционирования имплантата. В первой итерации протокола интраоперационная рентгенография не выполнялась, в результате чего устройство было сложено, как видно на рисунке 4A на Т1-взвешенной последовательности МРТ (см. дополнительно рисунок 4B). Никаких изменений в поведении животного не наблюдалось, но со временем это привело к фиброзной инкапсуляции вокруг устройства из-за макроскопического сжатия мозга вокруг места расположения имплантата (рис. 4C). После этого опыта была введена интраоперационная рентгенография, как показано на рисунке 4D, где рентгеноконтрастные маркеры (черные полосы, видимые на имплантате на врезке 4D) были хорошо расположены. Поверхность головного мозга в этом случае не повреждена, как это можно наблюдать на послеоперационной МРТ на рисунке 4E. В целом, с помощью этой системы имплантатов и пьедесталов возможна визуализация всего мозга. Различные последовательности в корональных плоскостях позволяют увидеть анатомические структуры (рис. 4F, G; Последовательности МРТ Т1 и Т2) или наличие жидкости и крови вокруг имплантата (рис. 4H; TSE-взвешенная последовательность МРТ). Система пьедестала почти не создает артефактов, за исключением нескольких небольших контрастных черных пустот вокруг титановых винтов (см. рис. 4G). Кроме того, клинические электроды используются в качестве компараторов в этом исследовании, но не могут быть визуализированы на МРТ из-за проблем с нагревом и безопасностью. Таким образом, компьютерная томография проводится на этих животных, как показано на рисунке 4I. Электроды хорошо видны, а система пьедестала не влияет на качество изображения. После периода имплантации животное перфузируют, а мозг извлекают. В данном исследовании анализ воспалительной реакции проводится на каждом полушарии независимо. Разрезание мозга пополам облегчает подготовку тканей перед секционированием, и имеет то преимущество, что срезы могут быть установлены на стандартные предметные стекла для микроскопии. Один из примеров образца мозга показан до (рис. 5A) и после (рис. 5B) разрезания на блоки. Контур имплантата хорошо виден и создал небольшую вмятину в головном мозге. При резке в параллельных плоскостях ткань уже выравнивается по криостату, и срезы можно легко разрезать без потерь ткани для обрезки (рис. 5C). После окрашивания визуализируется весь срез ткани (рис. 5D), где, например, хорошо виден слой нейрона в деталях (см. маркер NeuN). Целые срезы хрупкие и иногда могут приводить к некоторой потере тканей (см. нижнюю часть рисунка 5D), но область интереса остается нетронутой. При более близком рассмотрении, благодаря конфокальной микроскопии с 40-кратным увеличением, клетки четко очерчены и позволяют, например, точно исследовать маркеры воспаления (рис. 5E). Дальнейший количественный анализ может быть проведен для сравнения воспаления между контрольным и имплантированным полушариями. На рисунке 6 показана электрохимическая характеристика имплантированных электродов. Электрохимическая импедансная спектроскопия in vitro матрицы мягких электродов с модулем импеданса и фазой показана на рисунке 6A, а модуль импеданса при 1 кГц за 6 месяцев имплантации показан на рисунке 6B. Рисунок 1: Схема эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Минимально инвазивная имплантация мягкой ЭКоГ в головной мозг . (А) Хирургический доступ к черепу с признаком брегмы. (B) Двусторонняя трепанация черепа с видимой твердой мозговой оболочкой. (C) Разрезная дуротомия на первом полушарии. (D) Субдуральная имплантация мягкой ЭКоГ и закрытия твердой мозговой оболочки. (E) Разрезная дуротомия на втором полушарии. Фиксация костного лоскута на первом полушарии с помощью титановых мостовидных протезов. (F) Имплантация мягкой ЭКоГ на втором полушарии и закрытии твердой мозговой оболочки. (G) Фиксация костного лоскута на втором полушарии. (H) Расположение подножки на черепе. (I) Фиксация пьедестала на подножке. (J) Закрытие кожи вокруг основания пьедестала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Регистрация слуховых вызванных потенциалов . (А) Схема размещения электродов на поверхности височной доли. (B) Репрезентативное отображение исходной активности (серые следы) и слуховых вызванных потенциалов в ответ на стимуляцию тонового всплеска частотой 800 Гц (фиолетовая полоса). Каждое среднее соответствует одному каналу на мягком массиве ECoG. Усреднение запускается по аналоговому входному сигналу от звуковой стимуляции. Периоды акустической стимуляции «ВКЛ» и «ВЫКЛ» отмечаются на одном канале в левом нижнем углу. (C) Эволюция с течением времени (день 0, месяц 2 и месяц 5) одноканального отклика после акустического стимула по сравнению с исходным сигналом при отсутствии стимула (серый цвет). Усреднение запускается по аналоговому входному сигналу от звуковой стимуляции. Периоды стимуляции «ВКЛ» и «ВЫКЛ» отмечены внизу. Вызванный потенциал стимуляции «ВКЛ» отмечен стрелками. (D) Стандартное отклонение на канал (цветные точки) на момент времени базовой записи. Медианные значения выделены жирным синим цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Визуализация головного мозга и имплантированных электродов in vivo. (A) Послеоперационная Т1-взвешенная МРТ в корональной плоскости. Стрелка указывает на сложенный имплантат. (Б) Увеличенная часть А, где сгибание имплантата создает вмятину в головном мозге. (C) Т1-взвешенная МРТ через 1 месяц после имплантации, показывающая компрессию мозга из-за фиброзной инкапсуляции мозга в том же месте, что и С. (D) Интраоперационный рентген в плоскости, подтверждающий установку имплантата и отсутствие складки, что наблюдается при размещении рентгеноконтрастного маркера. Врезка: Фотография имплантата с рентгеноконтрастным маркером. (E) Послеоперационная Т1-взвешенная МРТ в корональной плоскости с оптимальной установкой имплантата. (F) Т1-взвешенная МРТ через 1 месяц после имплантации. (G) Т2-взвешенная МРТ через 1 месяц после имплантации. Стрелка показывает артефакт изображения от титановых винтов, удерживающих подножку на месте на черепе. (H) МРТ с ТГЭ через 1 месяц после имплантации. (I) Компьютерная томография животного, имплантированного клиническими электродами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Гистологический анализ головного мозга после длительной имплантации. (А) Фотография эксплантированного и перфузионного левого полушария мозга. (Б) Перфузионный мозг, разрезанный на блоки до стадии замораживания. (C) Изображение установки секционирования всего блока на криостате; Все «предварительно нарезанные блоки» могут быть разделены на части. (D) Иммуноокрашивание всего полушария (сканер слайдов, 20-кратный объектив) и (E) увеличение первых слоев коры головного мозга (конфокальная визуализация, 40-кратный объектив) с изображением глиальных клеток, астроцитов и нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Электрохимическая характеристика имплантированных электродов. (A) Электрохимическая импедансная спектроскопия in vitro решетки мягких электродов (маленькие серые линии для каждого канала, среднее значение красным) с модулем импеданса (вверху) и фазой (внизу). (B) Эволюция модуля импеданса на частоте 1 кГц в течение 6 месяцев после имплантации (среднее значение обозначено синим цветом; серые линии – отдельные каналы; измерение in vitro – красным цветом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1: МРТ-совместимый пьедестал. (A) Хроническая МРТ-совместимая трансдермальная соединительная система (пьедестал) для доступа к решетке мягких электродов. (B) Пьедестал с электродами, установленными на подножке для фиксации черепа. Врезка: Детали подножки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: Хирургический доступ для оптимальной перфузии головного мозга. (А) Разрез кожи и доступ к расположению сонной артерии и яремной вены. (Б) Рассечение тканей вокруг кровеносных сосудов. (С,Д) Идентификация и рассечение тканей вокруг сонной артерии и яремной вены. (E) Изоляция сонной артерии от ткани, находящейся под ней. (F) Изоляция яремной вены от ткани, расположенной под ней. (G) Наложение шовной проволоки вокруг сонной артерии (шов 1 и шов 2) и яремной вены (шов 3). (H) Наложение шва 3 у основания сонной артерии (со стороны сердца) во избежание кровотечения во время вскрытия сосуда. (I) Пережатие сонной артерии с противоположной стороны от Н. (J) Рассечение сонной артерии. (K) Введенный катетер в отверстие от J. Врезка: Праймированный катетер с физиологическим раствором, смываемый из шприца на кончик катетера. (L) Закрытие шва 2 для удержания катетера на месте и вдоль артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 1: Параметры последовательностей МРТ T1- (стр. 1-2), T2- (стр. 3-4) и TSE-взвешенных (стр. 5-6) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный файл 2: Метаданные для сканера слайдов для визуализации всего слайда окрашенных срезов мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 3: Метаданные для конфокальной визуализации увеличенного участка окрашенных срезов мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В данной статье мы приводим метод длительной имплантации и оценки мягких матриц ECoG. В этом исследовании мы разработали последовательный, минимально инвазивный хирургический подход для двусторонней имплантации функциональных электродных сеток над височными долями (в данном случае, нацеленными на слуховую кору). Сначала мы оценили функциональность сетки, успешно зарегистрировав вызванные потенциалы в течение всего периода исследования (6 месяцев) и отследив электрохимические свойства электродов (см. рис. 6). Во-вторых, мы оценили биобезопасность сеток in vivo с помощью МРТ и создания полностью МРТ-совместимой системы, а также после вскрытия, разработав протокол забора тканей и иммуноокрашивания.

Чтобы свести к минимуму инвазивность, мы оптимизировали размер окна трепанации черепа. Для того, чтобы добраться до слуховой коры, расположенной на височной доли, и избежать резекции височной мышцы, мы разработали технику скольжения имплантата под твердую мозговую оболочку. Этот метод позволяет резко уменьшить поверхность облученного мозга и при этом достичь удаленных целей. Хотя этот тип имплантации может показаться слепым, применение рентгеноконтрастных маркеров на устройствах, которые визуализируются на интраоперационном рентгеновском снимке, позволяет проверить позиционирование и гарантирует, что решетка не будет свернута под твердую мозговую оболочку. Субдуральное скольжение оказалось безопасным в большинстве повторений, которые мы выполняли. Кроме того, дюротомия в разрезе сводит к минимуму выпячивание мозга во время открытой трепанации черепа и облегчает закрытие вокруг имплантата, не требуя дополнительного материала, такого как искусственная твердая мозговая оболочка, которая может повлиять на воспалительную реакцию. Наконец, сильной стороной этого хирургического подхода является его способность транспонироваться в различные области коры головного мозга. Игра с координатами, положением трепанации черепа и размером устройства, которые можно регулировать, позволяет этому методу воздействовать на большую часть области коры головного мозга.

Хирургический метод, представленный здесь, наряду с функциональной оценкой и исследованием биоинтеграции с течением времени, не ограничивается технологией мягких электродов, используемой в этом отчете. Другие субдуральные электроды, которые разрабатываются для перевода человеком, могут быть оценены с помощью того же протокола. Преимущество этого метода заключается в том, что большинство деталей, таких как кабель и пьедестал, являются модульными, настраиваемыми и могут быть адаптированы к конкретному тестируемому устройству. Кроме того, интракортикальные или глубоко проникающие зонды также могут использоваться вместо или в сочетании с субдуральными электродами, поскольку для этого требуется только корректировка геометрии черепа и дюротомии. Затем долгосрочные результаты можно сравнить с их клиническими аналогами, как мы сделали здесь.

Одним из основных ограничений представленного метода является наличие пазух черепа у минипигов, которые развиваются в течениепервого года жизни. В связи с этим важными аспектами, которые следует учитывать, являются возраст имплантации, а также размер животного. Выполнение трепанации черепа у взрослого человека нарушает целостность пазух носа и приводит к высокому риску серьезной инфекции в хронических условиях. Такие пазухи видны на рентгенограмме плоскости и компьютерной томографии перед операцией. С другой стороны, проведение хронической имплантации слишком рано, у слишком маленького животного, также не является оптимальным, когда череп подвергается массивному росту и ремоделированию. Мы предположили, что эти «движения черепа» после операции могут привести к смещению и сгибанию имплантата, что в конечном итоге наносит ущерб эксперименту. Мы обнаружили, что геттингенские минипиги, возраст которых на момент имплантации составляет примерно 5-6 месяцев (и 8 кг), должны давать наилучшие результаты.

Для оценки эффективности имплантированного ЭКоГ для электрофизиологических записей мы разработали экспресс-протокол регистрации слухового вызванного потенциала (AEP), который может быть использован у свободно движущихся животных и под седацией. Он состоит из представления серии акустических тоновых всплесков на определенных частотах в течение нескольких минут. Преимуществом такого протокола является тот факт, что его можно настроить на доступную длину записи за счет уменьшения количества зондируемых частот. Одна из сложностей при регистрации корковых сигналов под наркозом заключается в том, что при анализе и сравнении данных следует учитывать уровень сознания животного.

Протокол перфузии корректировался с течением времени путем наблюдения за качеством извлеченного мозга. Действительно, мы обнаружили, что легче катетеризировать только сонную артерию, а не яремную вену. Первоначально в литературе представлены методы, при которых яремная вена катетеризируется для дренирования отходов20. На практике это ограничивает отток из мозга и приводит к ухудшению извлечения крови и общему качеству перфузии. Перерезав яремную вену и оставив жидкость выходить наружу в большой емкости, где лежит животное, эффективность перфузии повышается.

Мы разработали надежный метод подготовки тканей, который работает с антителами, обычно используемыми для отслеживания воспаления. Мы разделили два полушария из практических соображений, так как половина мозга свиньи помещается на стандартных предметных стеклах микроскопа и, таким образом, совместима с большинством диагностического оборудования, доступного в гистологических лабораториях. При разрезании мозга на блоки становится возможным прямой доступ к интересующей зоне, не требуя дальнейшего разрезания всего мозга или обрезки обширных участков ткани. Срезы мозга размером 40 мкм могут быть объединены в стандартные планшеты и окрашены свободно плавающим способом без существенных изменений протокола со стороны иммуноокрашивания других видов. Полное иммунное окрашивание головного мозга также может быть представлено с использованием, например, методов CLARITY21.

В целом, этот протокол, который охватывает персонализированный дизайн имплантата до имплантации, последующее наблюдение за функциональностью и оценку биобезопасности, является надежным и последовательным. Здесь мы продемонстрировали его возможность изучения слуховой системы, но он может быть транспонирован для проверки других физиологических функций. Более того, сила нашего метода заключается в том, что он не ограничивается минипигами, а полностью переносится на другие виды, такие как овцы, козы или нечеловекообразные приматы. В определенной степени он также может быть легко адаптирован к крысам.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Бертарелли и грантового CRSII5_183519 SNSF Sinergia. Авторы также хотели бы поблагодарить Катю Галан из EPFL за помощь в разработке протокола окрашивания для гистологии, сотрудников платформы нейронных микросистем Центра био- и нейроинженерии Висса в Женеве за помощь в процессах изготовления, персонал платформы для животных в Университетском медицинском центре (CMU) при Университете Женевы (UNIGE) по уходу за животными, хирургическая помощь и послеоперационное ведение минипига (Джон Подгузник, Ксавье Белин, Фабьен Фонтао и Валид Хабре), члены команды Центра биомедицинской визуализации (CIBM) при Женевском университете (Жюльен Сонжон, Франсуа Лазейрас и Рареш Саломир), сотрудники отделения патологии Университетской клиники Женевы (HUG) (Сами Шранц, Франческа Версили, Рубен Сото и Коралина Эггер), а также Блез Ивер из Университета Гренобль-Альпы за его вклад и обмен мнениями об экспериментах с хроническими минипигами. Авторы выражают признательность сотрудникам компании Neurosoft Bioelectronics SA за помощь в процессе изготовления и за помощь в экспериментах с минипигами (Бенуа Юге и Марго Руле).

Materials

Bone drill BBraun Elan 4 with  GA861 handpiece
Bone drill bit BBraun Neurocutter GP204R
Bonewax Ethicon W31G
Catheter Venisystems Abbocath 14G
Confocal Microscope Zeiss LSM 880
Cryostat Leica CM1950
Gelfoam Pfizer Gelfoam
Insert speakers Etymotic Etymotic ER2 insert Earphones
Multimeter Fluke Fluke 1700
Oscilloscope Tektronix MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion pump Shenzen LabS3/UD15
Potentiostat Gamry Instruments Reference 600
Primary Antibody Anti-GFAP Thermofischer Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Primary Antibody Anti-Iba1 Fujifilm Anti Iba1, Rabbit, 019-19741
Primary Antibody Anti-NeuN SigmaAldrich Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Pulse Generator AM Systems Model 2100 Isolated Pulse Stimulator
Recording headstage Multichannel systems W2100-HS32
Recording system Multichannel systems W2100
Screwdriver Medtronic Handle: 001201, Shaft: 8001205
Secondary Antibody 488 Thermofischer Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006
Secondary Antibody 555 Thermofischer Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435
Secondary Antibody 647 Thermofischer Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slide Scanner Olympus VS120
Snapfrost Excilone Excilone Snapfrost
Stab knife Fine Science Tools 10316-14
Suture wire dermal Ethicon Vicryl 2-0
Suture wire dura mater Ethicon Mersilk 5-0 
Suture wire for catheter Ethicon Vycril 3-0 without needle
Suture wire for lifting dura Ethicon Prolene 6-0 with BV-1 needle
Suture wire subcutaneous Ethicon Vicryl 4-0
Titanium bridge Medtronic TiMesh 015-2001-4 Cut out the required size
Titanium screws Medtronic 9001635, 9001640
X-ray system GE GE OEC 9800 Plus C-Arm

References

  1. Ritaccio, A. L., Brunner, P., Schalk, G. Electrical stimulation mapping of the brain: Basic principles and emerging alternatives. Journal of Clinical Neurophysiology. 35 (2), 86-97 (2018).
  2. Mullin, J. P., Sexton, D., Al-Omar, S., Bingaman, W., Gonzalez-Martinez, J. Outcomes of subdural grid electrode monitoring in the stereoelectroencephalography era. World Neurosurgery. 89, 255-258 (2016).
  3. Vansteensel, M. J., et al. Fully implanted brain-computer interface in a locked-in patient with ALS. The New England Journal of Medicine. 375 (21), 2060-2066 (2016).
  4. Lacour, S. P., Courtine, G., Guck, J. Materials and technologies for soft implantable neuroprostheses. Nature Reviews. Materilas. 1, 16063 (2016).
  5. Fallegger, F., Schiavone, G., Lacour, S. P. Conformable hybrid systems for implantable bioelectronic interfaces. Advanced Materials. 32 (15), 1903904 (2019).
  6. Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
  7. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  8. Khoshnevis, M., et al. Development of induced glioblastoma by implantation of a human xenograft in Yucatan minipig as a large animal model. Journal of Neuroscience Methods. 282, 61-68 (2017).
  9. Borton, D., et al. Developing implantable neuroprosthetics: A new model in pig. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society. 2011, 3024-3030 (2011).
  10. Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
  11. Gierthmuehlen, M., et al. Evaluation of mECoG electrode arrays in the minipig: Experimental procedure and neurosurgical approach. Journal of Neuroscience Methods. 202 (1), 77-86 (2011).
  12. Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. Journal of Neuroscience Methods. 366, 109427 (2022).
  13. Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Structure & Function. 222 (5), 2093-2114 (2017).
  14. Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
  15. Shepherd, R. K., Villalobos, J., Burns, O., Nayagam, D. A. X. The development of neural stimulators: A review of preclinical safety and efficacy studies. Journal of Neural Engineering. 15 (4), 041004 (2018).
  16. Schiavone, G., et al. Soft, implantable bioelectronic interfaces for translational research. Advanced Matererials. 32 (17), 1906512 (2020).
  17. Fallegger, F., et al. MRI-compatible and conformal electrocorticography grids for translational research. Advanced Science. 8 (9), 2003761 (2021).
  18. Minev, I. R., Wenger, N., Courtine, G., Lacour, S. P. Research update: Platinum-elastomer mesocomposite as neural electrode coating. APL Materials. 3 (1), 014701 (2015).
  19. Schiavone, G., et al. Guidelines to study and develop soft electrode systems for neural stimulation. Neuron. 108 (2), 238-258 (2020).
  20. Musigazi, G. U., De Vleeschauwer, S., Sciot, R., Verbeken, E., Depreitere, B. Brain perfusion fixation in male pigs using a safer closed system. Laboratory Animals. 52 (4), 413-417 (2018).
  21. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).

Play Video

Cite This Article
Fallegger, F., Trouillet, A., Lacour, S. P. Subdural Soft Electrocorticography (ECoG) Array Implantation and Long-Term Cortical Recording in Minipigs. J. Vis. Exp. (193), e64997, doi:10.3791/64997 (2023).

View Video