Implante de arranjo de eletrocorticografia mole subdural (ECoG) e registro cortical de longa duração em miniporcos

Os procedimentos cirúrgicos e comportamentais foram aprovados pelo comitê de ética local de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelas autoridades veterinárias locais (Cantão de Genebra) e federais (Suíça) com o número de autorização GE11120A. Miniporcos fêmeas da raça Göttingen (n = 7) aos 2-6 meses de idade (5-8 kg) foram utilizados neste estudo. 1. Planejamento pré-cirúrgico Caracterização in vitro do sistema de implantes molesCronoamperometria: Registra a queda de tensão após a injeção de uma evolução de pulso de corrente bifásica (ou seja, o transiente de tensão [VT]) usando um osciloscópio conectado em paralelo a um gerador de pulsos. Conecte o gerador de pulsos sequencialmente a cada eletrodo e a um contador de platina em solução salina (solução salina tamponada com fosfato [PBS] 1x). Consulte a etapa 3.1 para obter as configurações. Espectrograma de impedância eletroquímica: Medir a impedância eletroquímica em diferentes frequências usando um potenciômetro. Conecte o potenciômetro sequencialmente a cada eletrodo usando o contador de platina e um eletrodo de referência Ag/AgCl em solução salina (PBS 1x). Consulte a etapa 3.2 para obter as configurações. Resistência intercanal: No estado seco, meça a resistência de corrente contínua (CC) entre canais adjacentes usando um multímetro portátil. Seleção do implante: Após as três medidas citadas acima, selecionar o implante juntamente com os seguintes critérios: impedância a 1 kHz abaixo de 100 kΩ e nenhuma resistência intercanal abaixo de 1 MΩ. EsterilizaçãoEsterilização de implantes: Coloque os implantes selecionados individualmente em sacos de esterilização juntamente com um marcador de esterilização e lacre-os. Utilize embalagem dupla para garantir a esterilidade durante a cirurgia.NOTA: Neste caso, a esterilização do gás peróxido de hidrogênio (H 2 O2) é usada devido ao ciclo de tempo curto e baixa temperatura (55 °C). As alternativas são o gás óxido de etileno (ETO) ou a esterilização em autoclave, mas a compatibilidade com o sistema de implante deve ser garantida. Esterilização de instrumentos: Coloque os instrumentos limpos em sacos duplos de esterilização ou caixas de instrumentos estéreis juntamente com marcadores de esterilização. A esterilização em autoclave é mais comum para instrumentais, masH 2 O2 ou ETO são alternativas possíveis. 2. Implante cirúrgico de matrizes ECoG moles AnestesiaPré-medicação: Isole o animal e jejue-o durante a noite. Injetar uma mistura de midazolam a 0,75 mg/kg, atropina a 0,25 μg/kg e haldol a 0,1 mg/kg por via intradérmica e aguardar até que o animal esteja sedado. Pesar o animal antes de prosseguir. Instalação de eletrodo intravenoso (IV):Coloque o animal sobre a mesa de cirurgia em uma almofada de aquecimento. Induzir anestesia colocando máscara facial no animal, utilizando sevoflurano a 3%-3,5%. Coloque eletrocardiograma no abdômen, um sensor de saturação sanguínea na cauda e um sensor de temperatura na narina. Coloque um chumbo IV em uma veia da orelha e confirme o acesso ao sangue usando uma seringa cheia de soro fisiológico. Certifique-se de que os olhos são mantidos hidratados usando pomada. Intubação: Injetar um bolus de atracúrio a 0,5 mg/kg, cetamina a 1 mg/kg e fentanil a 1-2 μg/kg. Coloque o animal de costas para intubação. Insira um tubo de 4,5 mm. Medicação: Após a intubação, suspender a anestesia com sevoflurano e instalar infusão de propofol na dose de 10 mg/kg/h, fentanil na dose de 2 μg/kg/h, atracúrio na dose de 0,2-0,5 mg/kg/h e solução salina na dose de 4-7 mg/kg/h. Inicie uma perfusão de manitol a 1 g/kg/h para reduzir o inchaço cerebral durante a cirurgia.NOTA: Um regime de analgesia multimodal pode ser usado se recomendado pelo comitê de ética animal local. Radiografia pré-operatóriaColoque o animal em seu abdômen na posição de esfinge. Remova temporariamente qualquer objeto metálico nas proximidades do cérebro e do crânio do animal (por exemplo, chumbo de temperatura na narina). Adquira uma radiografia axial e sagital com contraste ósseo. Coloque um objeto metálico com dimensões conhecidas no campo de aquisição sagital para servir como uma escala para medir a espessura do crânio na frente e atrás do cérebro. Identificar a localização dos seios frontais (visíveis por vazios abaixo do crânio) e marcar a localização mais posterior na cabeça do animal utilizando um marcador permanente. Isso indicará o ponto mais distante onde qualquer craniotomia ou colocação de parafuso pode ser feita na abordagem cirúrgica descrita abaixo. Campo asséptico e preparação da pele: Raspe toda a superfície da cabeça além do campo cirúrgico. Usando uma almofada estéril, esfregue bem a cabeça com betadine. Em seguida, colocar campos estéreis sobre a mesa de instrumentação e sobre o animal para revelar apenas a janela cirúrgica. Finalmente, esfregue a cabeça novamente com uma almofada estéril usando betadina. Craniotomia e durotomiaCorte de pele: Incise a pele com uma faca de bisturi ao longo da linha média. Separe o músculo e o periósteo (25 mm lateralmente do bregma em ambos os lados e 40 mm anterior e posterior ao bregma) do osso usando um raspador e coloque espalhadores para obter o melhor acesso para posterior perfuração. Medidas e marcação: Identificar bregma e lambda e marcá-los com caneta cirúrgica estéril (Figura 2A, B). Usando uma régua estéril, defina o contorno do retalho ósseo centrado ao redor do alvo de implantação em ambos os hemisférios. Neste caso específico, optou-se pelo córtex auditivo, com coordenadas de -5 mm a -15 mm de bregma e -4 mm a -20 mm lateralmente. Em seguida, ajustar a craniotomia ao tamanho do implante e dos pontos anatômicos, limitando o tamanho da abertura. Craniotomia:Usando uma broca óssea com uma broca redonda de corte, perfurar o contorno da craniotomia, levando em consideração a espessura do crânio medida no passo 2.2. Irrigar o local de perfuração com solução salina para evitar o superaquecimento do osso. Perfure cuidadosamente o contorno de forma homogênea até atingir a dura-máter. No primeiro avanço, termine de perfurar o contorno até que ele tenha afinado o suficiente para quase romper. Em seguida, utilizar espátula plana (do lado da linha média ou lateral) para romper o retalho ósseo em peça única, utilizando a borda da craniotomia como alavanca. Se for encontrada muita resistência, continue afinando o osso. Coloque o pedaço de osso em soro fisiológico estéril. Uma vez removido o retalho ósseo, lasque cuidadosamente a borda da craniotomia, usando um Kerison para evitar que a borda óssea afiada corte na dura-máter. Se ocorrer sangramento excessivo na dura-máter ou no osso, use Gelfoam ou cera de osso, respectivamente. Colocar compressa úmida (coxim padrão em soro fisiológico estéril) na craniotomia e repetir essa etapa no outro hemisfério (Figura 2B). Durotomia:Usando a agulha de um kit de sutura 6-0, perfure e levante cuidadosamente a dura-máter na extremidade anterior ou posterior da craniotomia no meio do caminho entre os lados medial e lateral e crie o início de uma incisão com o canivete. Em seguida, usando uma pequena espátula plana inserida no espaço subdural atuando como base de corte para proteger a cortical, crie uma fenda anteroposterior na dura-máter avançando simultaneamente com ambas as ferramentas. Certifique-se de que a fenda seja ligeiramente maior que a largura do implante (Figura 2C). Se ocorrer algum sangramento ou dano nesta etapa, cubra com espuma de gel e aguarde até que pare.NOTA: A trajetória da fenda deve ser adaptada se grandes vasos sanguíneos estiverem presentes na dura-máter para evitar sangramento. ImplantaçãoInserção do dispositivo:Irrigar o implante (Figura 1A suplementar) com soro fisiológico em ambos os lados para que deslize para o espaço subdural com mais facilidade. Coloque o implante acima da fenda da dura-máter e, com pinças pequenas, insira o dispositivo por via subdural, deslizando-o sequencialmente em cada borda. Segure cuidadosamente a extremidade do pedestal do dispositivo e avance com o implante para não criar tensão que atrapalhe a inserção. Quando a borda do conector estiver localizada na parte superior da fenda, pare a inserção. Fixar o implante: Para fixar o implante no lugar, coloque uma ponte de titânio sobre o cabo após a borda da craniotomia ou nas asas de ancoragem e fixe-o com um ou dois parafusos de titânio usando a chave de fenda apropriada (Figura 2D). Colocação no solo: Remover cuidadosamente 1 cm do isolamento dos fios terra e inseri-lo epiduralmente na extremidade posterior da craniotomia (ou qualquer localização epidural distante do córtex de interesse ou dos grandes vasos sanguíneos) (fio na Figura 2E) Repita as etapas 2.4.4. e 2.5.1.-2.5.3 no hemisfério contralateral. Raio-x intraoperatório para confirmar a colocação:Coloque uma almofada úmida (almofada padrão em solução salina estéril) sobre o local da cirurgia para manter o tecido hidratado. Em seguida, coloque um pano cirúrgico estéril para cobrir a cabeça do animal. Tome imagens de raios-X planas (axiais e sagitais) para garantir que os implantes estejam bem posicionados e não sejam dobrados, usando os marcadores de raios X como indicadores. Caso contrário, remova o drape e explante o dispositivo para inseri-lo novamente (siga os passos 2.4.4. e 2.5.1.-2.5.3 novamente). Fechamento da dura-máter: Suture a dura-máter cuidadosamente ao redor do cabo do implante usando uma sutura reabsorvível 3-0 e um pequeno suporte de agulha. Aproximar ao máximo as duas bordas da dura-máter sem romper a fina membrana com o fio de sutura (Figura 2D, E). Colocação do retalho ósseo: Fixar uma ponte de titânio na parte anterior e posterior de cada retalho ósseo com um parafuso de titânio. Tenha o cuidado de planejar o posicionamento das pontes em Ti com relação à colocação das pernas da platina nas próximas etapas. Parafusar a extremidade das pontes de titânio ao crânio (Figura 2F, G). Colocação de pedestal e platinaPosicionamento: Nesta configuração, a platina possui seis pernas com dois orifícios de parafuso cada (Figura 1B Suplementar). Planejar a colocação da platina no crânio para otimizar a localização dos parafusos (evite colocá-los na borda da craniotomia ou no músculo temporal). Pule os orifícios nas pernas se eles não puderem ser parafusados dentro. Fixação da plata: Parafuso nos parafusos de titânio da platina até que esteja firmemente no lugar (ver Figura 2H). Colocação do pedestal: Remova as pontes de titânio sobre os cabos de conexão e vire sobre o pedestal para pousar na placa de pedestre. Rosqueie o pedestal na platina do pé. Verifique se o pedestal está firmemente posicionado (Figura 2I). Sutura e fechamentoLimpeza da ferida: Limpe o espaço subcutâneo de qualquer osso ou outros detritos lavando com soro fisiológico. Corte um pouco de pele ao redor das bordas do pedestal para criar uma borda redonda seguindo o cilindro. Suturas subcutâneas: Remova os espalhadores e dobre os retalhos de pele. Criar suturas subcutâneas com fio de sutura 4-0 não reabsorvível, com 3 mm de distância usando suturas simples interrompidas ou suturas contínuas simples. Comece longe do pedestal, movendo-se em direção a ele em ambos os lados da incisão. Suturas dérmicas: Sutura da pele com fio de sutura 6-0 não reabsorvível, com suturas separadas por 5 mm. Comece longe do pedestal, movendo-se em direção a ele em ambos os lados da incisão. Tome o cuidado de conseguir uma boa aposição tecidual entre os dois retalhos cutâneos e próximo à borda do pedestal para evitar um vazio (Figura 2J). Curativo: Limpe a área da ferida novamente com uma almofada estéril e betadina. Aplique uma bandagem estéril autoadesiva sobre a ferida. Medições in vivo: Para medições in vivo , siga as seções 3, 4 e 5. Despertar: Após todas as medidas terem sido realizadas, retirar o animal de todos os anestésicos, mas manter sob ventilação. Para analgesia, aplicar um adesivo de buprenorfina (25 mg/h) por 24 h. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento coberta com cortinas para acelerar o tempo de despertar. Quando a respiração espontânea for recuperada, extube o animal e coloque sob uma máscara facial de oxigênio até que a consciência seja recuperada (o que pode levar de 1 a 4 h). Cuidados pós-operatórios com o animal: Durante 5 dias, mantenha o animal sob estreita vigilância. Dê uma dose de cefalexina a 75 mg duas vezes por dia com alimentos, separados de outros animais. Realizar a desinfecção da ferida diariamente, aplicando quantidades abundantes de betadina com almofadas estéreis embebidas (melhor feito durante a alimentação).OBS: Cuidados prolongados e alojamento: O animal operado é mantido isolado por 24 horas. Ele é colocado de volta em seu grupo social original se o animal estiver bem o suficiente para interagir socialmente com seus pares. A observação diária do pedestal e da abertura da pele precisa ser realizada para acompanhar a integração do dispositivo na cabeça. Quando apropriado, limpe o local ao redor do pedestal com quantidades abundantes de betadina. 3. Caracterização in vivo do implante mole Cronoamperometria: Registra a queda de tensão após a injeção de uma evolução de pulso de corrente bifásica (i.e., o VT) usando um osciloscópio conectado em paralelo a um gerador de pulsos. Conecte o gerador de pulsos sequencialmente a cada eletrodo e ao fio terra. Realizar o pulso de estimulação a 100 μA com largura de pulso de 300 μs a 100 Hz. Espectroscopia de impedância eletroquímica: Mede a impedância eletroquímica em diferentes frequências usando um potenciômetro. Conecte o gerador de pulsos sequencialmente a cada eletrodo, usando o fio terra como contra-eletrodo e terra. Ajuste a tensão de excitação para 200 mV e a faixa de frequência de 1 Hz a 1 MHz, com três pontos por década. Medições curtas entre canais: Meça a resistência DC entre canais adjacentes usando um multímetro portátil. In vivo, a resistência DC intercanal só é medida para verificar se não há escassez abaixo de 1 kΩ, indicando falha total do encapsulamento. 4. Registro eletrofisiológico Atividade espontânea: Conecte o sistema de gravação sem fio através do pedestal e registre a atividade basal por 2-3 min. Estes registros servirão como controle para análise dos potenciais evocados auditivos. Potenciais evocados auditivos: Além do sistema sem fio, inserir alto-falantes em campo fechado nas orelhas dos animais. Play tone burst estimulação acústica em diferentes frequências (variando de 200-20.000 Hz) em torno de 70 dB nível de pressão sonora (NPS) ao longo de 120 repetições. Em seguida, faça a média dos registros e alinhe-os ao longo do período de estímulo para análise. Potenciais evocados sensoriais: Coloque as agulhas no focinho em três posições diferentes. Evocar potenciais sensoriais estimulando o focinho por ~30 s com o gerador de pulsos em diferentes amplitudes para obtenção das curvas de recrutamento. 5. Imagem in vivo Transporte do animal: Manter o animal sob anestesia com propofol, conforme descrito no passo 2.1. Use um carrinho de transporte que abriga um ventilador, bomba de seringa e monitor de sinais vitais para transportar o animal da sala de cirurgia para as instalações de imagem e de volta. Tomografia computadorizada de raios-x: Coloque o animal sobre a mesa do scanner e remova qualquer objeto metálico ao redor da cabeça (por exemplo, o sensor de temperatura). Adquira uma tomografia computadorizada na menor resolução (espessura de corte de 0,4 mm) usando aquisição isométrica com seleção automática de corrente e tensão para contraste ósseo. Imagem por ressonância magnética: Remova todos os equipamentos que contenham metal do animal (use eletrodos intravenosos compatíveis com ressonância magnética e tubo de intubação). Manter o animal ventilado e anestesiado sob sevoflurano a 3%-3,5%, utilizando ventilador situado fora da câmara de RM e ligado através de um tubo longo ao animal. Antes da primeira sequência, injetar um bolus de fentanil a 1-2 μg/kg. Use três sequências isométricas na menor resolução: sequências ponderadas em T1, T2 e TSE (turbo spin echo) (parâmetros mostrados no Arquivo Suplementar 1). 6. Gravação em movimento livre Siga o mesmo procedimento descrito na secção 4 para registar sinais de vigília do cérebro. Conecte o headstage sem fio segurando o animal nos braços do experimentador ou alimentando-o com guloseimas para distraí-lo. Proporcionar a estimulação acústica utilizando alto-falantes externos colocados próximos ao animal. 7. Perfusão e preparo tecidual OPCIONAL: Se o animal ainda não estiver sob anestesia, siga o passo 2.1 para o protocolo de anestesia. Inserção de cateter na artéria carótida para perfusão (Figura 2 Suplementar)Dissecção da artéria carótida e veia jugular: Cortar a garganta na linha média usando um cauterizador/cortador. Cortar primeiro a pele e depois o músculo seguindo a linha branca média (sem vasos por baixo) (Figura 2A suplementar). Abra mais, usando os dedos para abrir espaço ao redor da traqueia e sob o músculo. Procure a artéria carótida (batendo e rosada); O nervo vago às vezes também está ao redor (branco), e a veia jugular pode estar embaixo ou na lateral (vermelho). Coloque os espalhadores (ver Figura 2B Suplementar). Iniciar a dissecção da artéria carótida com pinça fina e tesoura redonda. Use tesoura para abrir o tecido conjuntivo. Se não houver vasos sanguíneos, corte; se houver vasos sanguíneos, cauterizar e avançar (Figura 2C Suplementar, D). Quando dissecado o suficiente, utilizar uma pinça para passar por baixo da artéria carótida para que fique completamente isolada (Figura 2E suplementar). Repetir a mesma operação com a veia jugular (Figura 2F Suplementar). Quando ambos os vasos estiverem totalmente dissecados e isolados, colocar fio de sutura ao redor deles. Não os feche ainda. Duas suturas ao redor da carótida, uma na própria base (sutura 1-lado do coração para perfusão cerebral) e outra no outro lado (sutura 2), são mostradas na Figura 2G Suplementar. Colocar uma sutura ao redor da veia jugular (sutura 3), não fechada; Marque os fios com fita adesiva para posterior seccionamento da veia. Feche a sutura 1 com muita firmeza, caso contrário irá sangrar (Figura 2H Suplementar). Amarre três nós. Coloque uma braçadeira no fio para engordar e criar tensão na artéria carótida. Apertar a artéria carótida usando uma pinça de vaso no lado oposto da dissecção da artéria carótida (lado cerebral para perfusão cerebral; Figura Suplementar 2I). A sutura 2 está no meio, ainda não fechada. Use pinças pretas para pegar e puxar a artéria carótida. Com tesoura fina, seccionou-se metade da artéria carótida próximo à base da dissecção (próximo à sutura 1, lado do coração; ver Figura 2J Suplementar). Certifique-se de que a seção seja a mais limpa possível e atinja o próprio vaso, não apenas a “bainha”; caso contrário, o cateter não passará. Insira o cateter conforme mostrado na Figura 2K Suplementar. Lave e preencha o cateter, primeiro com PBS, para que não haja mais ar no cateter (Figura Suplementar 2K inset). Fechar a sutura 2 com firmeza suficiente para que não desapareça, mas não muito para que o cateter ainda possa se mover um pouco (Figura 2L Suplementar). Em seguida, remova a pinça do vaso, termine de inserir o cateter na medida do possível e finalize o fechamento da sutura 2 (fechar firmemente). Se desejar, use fios de sutura na sutura 1 para fixar a base do cateter à pele na saída da ferida como um passo extra de segurança. Em seguida, transferir o animal para a zona de perfusão e conectá-lo ao PBS/heparina. Quando a perfusão se iniciar, puxar a sutura 3 e cortar a veia jugular Eutanásia: Administrar pentobarbital (90 mg/kg) por via intravenosa e lavar a linha com soro fisiológico para garantir que a dose completa seja administrada com sucesso. Perfusão: Com bomba de perfusão (200 mL/min), conectar o cateter carotídeo em PBS/heparina (1 L para um porco de 15 kg) e, em seguida, em PBS contendo paraformaldeído (PFA) a 4% (5 L para um porco de 15 kg). Quando a perfusão se iniciar, puxe a sutura 3 e corte a veia jugular. Coleta de tecidosDecapitação: Quando a perfusão terminar, desprenda a cabeça do animal do corpo usando um bisturi, cortando a pele e o músculo e inserindo a lâmina entre a primeira e a segunda vértebras. Pós-fixação: Mergulhar a cabeça em PFA a 4% em PBS por mais 48 h a 4 °C e depois transferir para PBS antes da extração cerebral. Extração de cérebro e implante:Retire a pele usando um bisturi e comece a cortar o osso cuidadosamente usando um rongeur a partir das primeiras vértebras, seguindo a medula espinhal até o cerebelo. Uma vez exposto o cerebelo, remova cuidadosamente os ossos temporais e exponha os lobos parietal e frontal. Neste ponto, rosqueie o pedestal da platina e corte os pés da platina com um alicate. Remova o osso perto da entrada do cabo no crânio para liberar o sistema de implante do osso, sem puxar os implantes para fora da saída da dura-máter. Se os cabos do implante estiverem embutidos no osso, corte o cabo o mais próximo possível da saída. Uma vez que a superfície cerebral suficiente é exposta, corte cuidadosamente a dura-máter seguindo a linha média usando pequenas tesouras. Liberte os cabos do implante da saída da dura-máter. Tire fotografias da colocação do implante no cérebro. Em seguida, use uma colher pequena para separar o cérebro dos nervos cranianos abaixo. Extraia cuidadosamente o cérebro. Remova os implantes do cérebro. Pós-fixação do cérebro: Dependendo da qualidade da perfusão, pós-fixar o cérebro extraído novamente por 24 h em PFA a 4% em PBS a 4 °C. Manter em 0,1 M PBS a 4 °C até que o cérebro seja cortado. Corte cerebral: Separe os dois hemisférios usando uma lâmina de barbear. Em seguida, corte o cérebro ortogonalmente em quatro pedaços diferentes. Corte a zona implantada ao meio para obter dois blocos contendo a zona implantada e uma área de controle. Armazene os outros dois blocos se mais slides de controle forem necessários. Crioproteção e congelamento cerebral: Transfira os blocos cerebrais para uma solução de 15% de sacarose primeiro e depois 30% de sacarose a 4 °C até que o cérebro mergulhe e atinja o equilíbrio. Em seguida, congelar o tecido em isopentano a -55 °C em um sistema de congelamento de tecido. 8. Histologia Secção tecidualCriostat: Coloque o cérebro congelado em um criostato e corte até que seções completas sejam alcançadas. Em seguida, corte o cérebro em seções de 40 μm e mergulhe em grupos de três em PBS 0,1 M em placas de poço. Observe cuidadosamente a ordem das placas. Seleção de seções: Selecione as seções dependendo da zona a ser analisada (região implantada ou zona de controle). Retire as seções sequencialmente das placas do poço, usando uma escova fina para inspecioná-las em busca de danos. Coloque-os em novas placas de poço preenchidas com PBS 0,1 M para coloração adicional. Imuno-histoquímicaPreparo: Incubar os cortes em Triton X/PBS a 0,3% por 15 min, seguido de albumina de soro bovino (BSA)/PBS a 3% por 1 h à temperatura ambiente (TR). Anticorpos primários: Incubar os tecidos com anticorpos primários por 48 h na RT (anti-GFAP, rato, diluído a 1/300; anti Iba1, coelho, diluído a 1/400; anti-NeuN, cobaia, diluído a 1/1.000; tudo em 1% BSA/PBS). Cubra as placas do poço com papel alumínio. Lavagem: Lave os poços com PBS 0,1 M três vezes por 5 min. Anticorpos secundários: Incubar os tecidos com anticorpos secundários por 2 h na RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; todos diluídos a 1/400 em 1% BSA/PBS). DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol): Incubar os tecidos com DAPI por 15 min (1/1.000 em 1% BSA/PBS). Lavagem: Lave os poços com PBS 0,1 M cinco vezes por 15 min. Montagem: Monte as corrediças usando mídia de montagem e uma lamínula. Mantenha as lâminas no escuro num frigorífico a 4 °C. ImagiologiaImagem de lâminas inteiras: Obtenha imagens das lâminas em aumento de 10x (valor da distância objetiva de trabalho = 3.100 μm) usando um microscópio de scanner de lâminas em três comprimentos de onda diferentes (640 nm, 560 nm, 485 nm). Todas as informações de poder e ganho podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 2. Imagem microscópica: Imagem da região de interesse em aumento de 20x (apocromático 20x/0,8 M27) usando um microscópio confocal em quatro comprimentos de onda (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Todas as informações de poder e ganho podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 3.