Implantación de matrices de electrocorticografía blanda subdural (ECoG) y registro cortical a largo plazo en minipigs

Los procedimientos quirúrgicos y conductuales fueron aprobados por el comité de ética local de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por las autoridades veterinarias locales (Cantón de Ginebra) y federales (Suiza) con el número de autorización GE11120A. En este estudio se utilizaron minicerdos hembra de Göttingen (n = 7) de 2-6 meses de edad (5-8 kg). 1. Planificación prequirúrgica Caracterización in vitro del sistema de implantes blandosCronoamperometría: Registre la caída de voltaje tras la inyección de una evolución de pulso de corriente bifásica (es decir, el transitorio de voltaje [VT]) utilizando un osciloscopio conectado en paralelo a un generador de pulsos. Conecte el generador de impulsos secuencialmente a cada electrodo y a un contador de platino en solución salina (solución salina tamponada con fosfato [PBS] 1x). Consulte el paso 3.1 para conocer la configuración. Espectrograma de impedancia electroquímica: Mide la impedancia electroquímica a diferentes frecuencias utilizando un potenciómetro. Conecte el potenciómetro secuencialmente a cada electrodo utilizando el contador de platino y un electrodo de referencia Ag/AgCl en solución salina (PBS 1x). Consulte el paso 3.2 para conocer los ajustes. Resistencia entre canales: En estado seco, mida la resistencia de corriente continua (CC) entre canales adyacentes con un multímetro de mano. Selección del implante: Después de las tres mediciones citadas anteriormente, seleccione el implante junto con los siguientes criterios: impedancia a 1 kHz por debajo de 100 kΩ y sin resistencia entre canales por debajo de 1 MΩ. EsterilizaciónEsterilización de implantes: Coloque los implantes seleccionados individualmente en bolsas de esterilización junto con un marcador de esterilización y séllelos. Emplee doble embalaje para garantizar la esterilidad durante la cirugía.NOTA: En este caso, se utiliza la esterilización con gas peróxido de hidrógeno (H2O2) debido al corto ciclo de tiempo y a la baja temperatura (55 °C). Las alternativas son el gas óxido de etileno (ETO) o la esterilización en autoclave, pero debe garantizarse la compatibilidad con el sistema de implantes. Esterilización de instrumentos: Coloque los instrumentos limpios en bolsas de esterilización dobles o cajas de instrumentos estériles junto con marcadores de esterilización. La esterilización en autoclave es más común para los instrumentos,pero H 2 O2 o ETO son alternativas posibles. 2. Implantación quirúrgica de matrices ECoG blandas AnestesiaPremedicación: Aislar al animal y ayunarlo durante la noche. Inyectar una mezcla de midazolam a 0,75 mg/kg, atropina a 0,25 μg/kg y haldol a 0,1 mg/kg por vía intradérmica, y esperar hasta que el animal esté sedado. Pesa al animal antes de continuar. Instalación de electrodo intravenoso (IV):Coloque al animal en la mesa de cirugía sobre una almohadilla térmica. Inducir la anestesia colocando una mascarilla en el animal, utilizando sevoflurano al 3%-3,5%. Coloque electrocardiogramas en el abdomen, un sensor de saturación de sangre en la cola y un sensor de temperatura en la fosa nasal. Coloque un cable intravenoso en una vena del oído y confirme el acceso a la sangre con una jeringa llena de solución salina. Asegúrese de que los ojos se mantengan hidratados con un ungüento. Intubación: Inyectar un bolo de atracurio a 0,5 mg/kg, ketamina a 1 mg/kg y fentanilo a 1-2 μg/kg. Coloque al animal boca arriba para la intubación. Inserte un tubo de 4,5 mm. Medicación: Después de la intubación, suspender la anestesia con sevoflurano e instalar una infusión de propofol a 10 mg/kg/h, fentanilo a 2 μg/kg/h, atracurio a 0,2-0,5 mg/kg/h y solución salina a 4-7 mg/kg/h. Iniciar una infusión de manitol a 1 g/kg/h para reducir la inflamación cerebral durante la cirugía.NOTA: Se puede utilizar un régimen de analgesia multimodal si lo recomienda el comité local de ética animal. Radiografía preoperatoriaColoca al animal sobre su abdomen en la posición de la esfinge. Retire temporalmente cualquier objeto metálico que se encuentre cerca del cerebro y el cráneo del animal (p. ej., la temperatura de la fosa nasal). Adquirir una radiografía de plano axial y sagital con contraste del hueso. Coloque un objeto metálico con dimensiones conocidas en el campo de adquisición sagital para que sirva como escala para medir el grosor del cráneo en la parte delantera y posterior del cerebro. Identifique la ubicación de los senos frontales (visibles por los huecos debajo del cráneo) y marque la ubicación más posterior en la cabeza del animal con un marcador permanente. Esto indicará el punto más lejano donde se puede realizar cualquier craneotomía o colocación de tornillos en el abordaje quirúrgico que se describe a continuación. Campo aséptico y preparación de la piel: Afeitar toda la superficie de la cabeza más allá del campo quirúrgico. Con una almohadilla estéril, frote bien la cabeza con betadine. A continuación, coloque paños estériles en la mesa de instrumentación y en el animal para revelar solo la ventana quirúrgica. Por último, vuelva a frotar la cabeza con una almohadilla estéril con betadine. Craneotomía y durotomíaCorte en la piel: Incida la piel con un bisturí a lo largo de la línea media. Separe el músculo y el periostio (25 mm lateralmente del bregma en ambos lados y 40 mm anterior y posterior al bregma) del hueso con un raspador y coloque separadores para obtener un acceso óptimo para la perforación posterior. Medidas y marcado: Identifique bregma y lambda, y márquelos con una pluma quirúrgica estéril (Figura 2A, B). Con una regla estéril, defina el contorno del colgajo óseo centrado alrededor del objetivo de implantación en ambos hemisferios. En este caso específico, se eligió la corteza auditiva, con coordenadas de -5 mm a -15 mm del bregma y de -4 mm a -20 mm lateralmente. A continuación, ajuste la craneotomía al tamaño del implante y a los puntos de referencia anatómicos, limitando el tamaño de la abertura. Craneotomía:Con un taladro de hueso con una broca de corte redonda, taladre el contorno de la craneotomía, teniendo en cuenta el grosor del cráneo medido en el paso 2.2. Riegue el lugar de perforación con solución salina para evitar el sobrecalentamiento del hueso. Taladre con cuidado el contorno de manera homogénea hasta llegar a la duramadre. En el primer avance, termine de perforar el contorno hasta que se haya adelgazado lo suficiente como para casi romperse. Luego, use una espátula plana (ya sea en el lado de la línea media o en el lado lateral) para romper el colgajo óseo en una sola pieza, usando el borde de la craneotomía como palanca. Si se encuentra demasiada resistencia, continúe adelgazando el hueso. Coloque la pieza de hueso en solución salina estéril. Una vez que se retira el colgajo óseo, corte con cuidado el borde de la craneotomía, usando un Kerison para evitar que el borde afilado del hueso corte la duramadre. Si se encuentra un sangrado excesivo en la duramadre o en el hueso, use Gelfoam o cera para huesos, respectivamente. Coloque una compresa húmeda (almohadilla estándar en solución salina estéril) en la craneotomía y repita este paso en el otro hemisferio (Figura 2B). Durotomía:Con la aguja de un kit de sutura 6-0, perfore y levante con cuidado la duramadre en el extremo anterior o posterior de la craneotomía a medio camino entre el lado medial y lateral y cree el comienzo de una incisión con el cuchillo punzante. Luego, usando una pequeña espátula plana insertada en el espacio subdural que actúa como base de corte para proteger la corteza, crea una hendidura anteroposterior en la duramadre avanzando simultáneamente con ambas herramientas. Asegúrese de que la hendidura sea ligeramente más grande que el ancho del implante (Figura 2C). Si se produce algún sangrado o daño en este paso, cúbralo con espuma de gel y espere hasta que se detenga.NOTA: La trayectoria de la hendidura debe adaptarse si hay vasos sanguíneos grandes en la duramadre para evitar el sangrado. ImplantaciónInserción del dispositivo:Irrigar el implante (Figura complementaria 1A) con solución salina en ambos lados para que se deslice más fácilmente en el espacio subdural. Coloque el implante por encima de la hendidura de la duramadre y, con pinzas pequeñas, inserte subduralmente el dispositivo deslizándolo secuencialmente en cada borde. Sujete con cuidado el extremo del pedestal del dispositivo y avance con el implante para no crear tensión que dificulte la inserción. Cuando el borde del conector esté ubicado en la parte superior de la ranura, detenga la inserción. Asegure el implante: Para asegurar el implante en su lugar, coloque un puente de titanio sobre el cable después del borde de la craneotomía o en las alas de anclaje y asegúrelo con uno o dos tornillos de titanio con el destornillador adecuado (Figura 2D). Colocación en el suelo: Retire con cuidado 1 cm del aislamiento de los cables de tierra e insértelo por vía epidural en el extremo posterior de la craneotomía (o en cualquier ubicación epidural lejos de la corteza de interés o de los vasos sanguíneos grandes) (alambre en la Figura 2E) Repita los pasos 2.4.4. y 2.5.1.-2.5.3 en el hemisferio contralateral. Radiografía intraoperatoria para confirmar la colocación:Coloque una almohadilla húmeda (almohadilla estándar en solución salina estéril) sobre el lugar de la cirugía para mantener el tejido hidratado. A continuación, coloque un paño quirúrgico estéril para cubrir la cabeza del animal. Tome imágenes de rayos X planos (axiales y sagitales) para asegurarse de que los implantes estén bien colocados y no estén doblados, utilizando los marcadores de rayos X como indicadores. Si no es así, retire el paño y explante el dispositivo para volver a insertarlo (siga los pasos 2.4.4. y 2.5.1.-2.5.3 nuevamente). Cierre de la duramadre: Sutura la duramadre con cuidado alrededor del cable del implante utilizando una sutura reabsorbible 3-0 y un pequeño portaagujas. Junte los dos bordes de la duramadre tanto como sea posible sin rasgar la membrana delgada con el alambre de sutura (Figura 2D, E). Colocación del colgajo óseo: Fije un puente de titanio en la parte anterior y posterior de cada colgajo óseo con un tornillo de titanio. Tenga cuidado de planificar la colocación de los puentes en Ti con respecto a la colocación de las patas del reposapiés en los siguientes pasos. Atornille el extremo de los puentes de titanio al cráneo (Figura 2F, G). Colocación del pedestal y del reposapiésPosicionamiento: En esta configuración, el reposapiés tiene seis patas con dos orificios para tornillos cada una (Figura complementaria 1B). Planifique la colocación del reposapiés en el cráneo para optimizar la ubicación de los tornillos (evite colocarlos en el borde de la craneotomía o en el músculo temporal). Omita los agujeros en las patas si no se pueden atornillar. Fijación del reposapiés: Atornille los tornillos de titanio del reposapiés hasta que esté firmemente en su lugar (consulte la Figura 2H). Colocación del pedestal: Retire los puentes de titanio sobre los cables de conexión y voltee el pedestal para aterrizar en el reposapiés. Atornille el pedestal en el reposapiés. Verifique que el pedestal esté firmemente en su lugar (Figura 2I). Sutura y cierreLimpieza de la herida: Limpie el espacio subcutáneo de cualquier hueso u otros desechos enjuagando con solución salina. Corta un poco de piel alrededor de los bordes del pedestal para crear un borde redondo siguiendo el cilindro. Suturas subcutáneas: Retire los separadores y doble los colgajos de piel juntos. Cree suturas subcutáneas con un alambre de sutura 4-0 no reabsorbible, a 3 mm de distancia, utilizando suturas interrumpidas simples o suturas continuas simples. Comience alejándose del pedestal, moviéndose hacia él a ambos lados de la incisión. Suturas dérmicas: Suturar la piel con un alambre de sutura 6-0 no reabsorbible, con suturas separadas por 5 mm. Comience alejándose del pedestal, moviéndose hacia él a ambos lados de la incisión. Tenga cuidado de lograr una buena aposición del tejido entre los dos colgajos de piel y cerca del borde del pedestal para evitar un vacío (Figura 2J). Apósito para heridas: Limpie el área de la herida nuevamente con una almohadilla estéril y betadine. Aplique un vendaje estéril autoadhesivo sobre la herida. Mediciones in vivo: Para mediciones in vivo , siga las secciones 3, 4 y 5. Despertar: Después de que se hayan realizado todas las mediciones, retire al animal de todos los anestésicos, pero manténgalo bajo ventilación. Para la analgesia, aplicar un parche de buprenorfina (25 mg/h) durante 24 h. Coloque al animal en una almohadilla térmica cubierta con cortinas para acelerar la hora de despertarse. Cuando se recupere la respiración espontánea, extubar al animal y ponerlo bajo una máscara facial de oxígeno hasta que se recupere la conciencia (lo que puede tardar de 1 a 4 h). Cuidados postoperatorios del animal: Durante 5 días, mantenga al animal bajo estrecha vigilancia. Administre una dosis de cefalexina de 75 mg dos veces al día con alimentos, separados de otros animales. Lleve a cabo la desinfección de la herida diariamente aplicando grandes cantidades de betadine con almohadillas estériles empapadas (es mejor hacerlo durante la alimentación).NOTA: Cuidados y alojamiento a largo plazo: El animal operado se mantiene aislado durante 24 h. Se devuelve a su grupo social original si el animal está lo suficientemente bien como para interactuar socialmente con sus compañeros. Es necesario realizar una observación diaria del pedestal y de la abertura de la piel para seguir la integración del dispositivo en la cabeza. Cuando sea apropiado, limpie la ubicación alrededor del pedestal con grandes cantidades de betadine. 3. Caracterización in vivo del implante blando Cronoamperometría: Registre la caída de voltaje tras la inyección de una evolución de pulso de corriente bifásica (es decir, el VT) utilizando un osciloscopio conectado en paralelo a un generador de pulsos. Conecte el generador de pulsos secuencialmente a cada electrodo y al cable de tierra. Realice el pulso de estimulación a 100 μA con un ancho de pulso de 300 μs a 100 Hz. Espectroscopía de impedancia electroquímica: Mide la impedancia electroquímica a diferentes frecuencias utilizando un potenciómetro. Conecte el generador de pulsos secuencialmente a cada electrodo, utilizando el cable de tierra como contraelectrodo y tierra. Ajuste el voltaje de excitación a 200 mV y el rango de frecuencia de 1 Hz a 1 MHz, con tres puntos por década. Mediciones cortas entre canales: Mida la resistencia de CC entre canales adyacentes con un multímetro de mano. In vivo, la resistencia de CC entre canales solo se mide para verificar que no aparezcan faltantes por debajo de 1 kΩ, lo que indica una falla total de encapsulación. 4. Registro electrofisiológico Actividad espontánea: Conecte el sistema de grabación inalámbrico a través del pedestal y registre la actividad de referencia durante 2-3 minutos. Estas grabaciones servirán como control para analizar los potenciales evocados auditivos. Potenciales evocados auditivos: Además del sistema inalámbrico, inserte altavoces en un campo cerrado en los oídos de los animales. Estimulación acústica en ráfagas de tonos de reproducción a diferentes frecuencias (que van desde 200-20.000 Hz) a un nivel de presión sonora (SPL) de alrededor de 70 dB durante 120 repeticiones. Luego, promedie las grabaciones y alinéelas durante el período de estímulo para su análisis. Potenciales evocados sensoriales: Coloque las agujas en el hocico en tres posiciones diferentes. Evocar potenciales sensoriales estimulando el hocico durante ~30 s con el generador de pulsos a diferentes amplitudes para obtener las curvas de reclutamiento. 5. Imágenes in vivo Transporte de animales: Mantener al animal bajo anestesia con propofol, como se describe en el paso 2.1. Use un carro de transporte que contenga un ventilador, una bomba de jeringa y un monitor de signos vitales para transportar al animal desde la sala de cirugía hasta las instalaciones de diagnóstico por imágenes y viceversa. Tomografía computarizada de rayos X: Coloque al animal en la mesa del escáner y retire cualquier objeto metálico alrededor de la cabeza (por ejemplo, el sensor de temperatura). Adquiera una tomografía computarizada con la resolución más pequeña (0,4 mm de grosor de corte) mediante la adquisición isométrica con selección automática de corriente y voltaje para el contraste óseo. Imágenes por resonancia magnética: Retire todo el equipo que contenga metal del animal (use cables intravenosos y tubo de intubación compatibles con resonancia magnética). Mantener al animal ventilado y anestesiado bajo sevoflurano al 3%-3,5%, utilizando un ventilador situado fuera de la cámara de resonancia magnética y conectado al animal a través de un tubo largo. Antes de la primera secuencia, inyectar un bolo de fentanilo a 1-2 μg/kg. Utilice tres secuencias isométricas con la resolución más pequeña: secuencias ponderadas por T1, T2 y eco de espín turbo (TSE) (los parámetros se muestran en el Archivo Suplementario 1). 6. Grabación de movimiento libre Siga el mismo procedimiento descrito en la sección 4 para registrar las señales de vigilia del cerebro. Conecte el headstage inalámbrico sosteniendo al animal en los brazos del experimentador o alimentándolo con golosinas para distraerlo. Proporcionar la estimulación acústica mediante altavoces externos colocados cerca del animal. 7. Perfusión y preparación de tejidos OPCIONAL: Si el animal aún no está bajo anestesia, siga el paso 2.1 para el protocolo de anestesia. Inserción de un catéter en la arteria carótida para perfusión (Figura complementaria 2)Disección de la arteria carótida y la vena yugular: corte la garganta en la línea media con un cauterizador/cortador. Cortar primero la piel y luego el músculo siguiendo la línea blanca media (sin vasos debajo) (Figura complementaria 2A). Ábralo más, usando los dedos para hacer espacio alrededor de la tráquea y debajo del músculo. Busca la arteria carótida (latiendo y rosada); El nervio vago a veces también está alrededor (blanco), y la vena yugular puede estar debajo o a un lado (rojo). Coloque los esparcidores (ver Figura complementaria 2B). Comience la disección de la arteria carótida con pinzas finas y tijeras redondas. Use tijeras para abrir el tejido conjuntivo. Si no hay vasos sanguíneos, cortar; si hay vasos sanguíneos, cauterizar y avanzar (Figura suplementaria 2C, D). Cuando esté lo suficientemente diseccionado, use una pinza para pasar por debajo de la arteria carótida para que quede completamente aislada (Figura complementaria 2E). Repita la misma operación con la vena yugular (Figura complementaria 2F). Cuando ambos vasos estén completamente diseccionados y aislados, coloque alambre de sutura alrededor de ellos. No los cierres todavía. En la Figura complementaria 2G se muestran dos suturas alrededor de la carótida, una en la base (sutura 1 del lado del corazón para la perfusión cerebral) y otra en el otro lado (sutura 2). Coloque una sutura alrededor de la vena yugular (sutura 3), no cerrada; Marque los cables con cinta adhesiva para seccionar la vena más tarde. Cierre la sutura 1 con mucha firmeza, de lo contrario sangrará (Figura complementaria 2H). Haz tres nudos. Coloque una abrazadera en el alambre para poner peso y crear tensión en la arteria carótida. Pinzar la arteria carótida con una pinza vascular en el lado opuesto de la disección de la arteria carótida (lado del cerebro para la perfusión cerebral; Figura complementaria 2I). La sutura 2 está en el medio, aún no está cerrada. Use pinzas negras para atrapar y tirar de la arteria carótida. Con unas tijeras finas, corte la mitad de la arteria carótida cerca de la base de la disección (cerca de la sutura 1, lado del corazón; véase la figura complementaria 2J). Asegúrese de que la sección esté lo más ordenada posible y llegue a la embarcación en sí, no solo a la “funda”; de lo contrario, el catéter no pasará. Inserte el catéter como se muestra en la Figura complementaria 2K. Enjuague y llene el catéter, primero con PBS, para que no quede aire en el catéter (recuadro de la Figura 2K suplementaria ). Cierre la sutura 2 con la suficiente firmeza para que no desaparezca, pero no demasiado como para que el catéter aún pueda moverse un poco (Figura complementaria 2L). Luego, retire la pinza del vaso, termine de insertar el catéter lo más lejos posible y finalice el cierre de la sutura 2 (cierre firmemente). Si lo desea, use alambres de sutura en la sutura 1 para unir la base del catéter a la piel a la salida de la herida como un paso de seguridad adicional. Luego, transfiera al animal a la zona de perfusión y conéctelo a PBS/heparina. Cuando comience la perfusión, tire de la sutura 3 y corte la vena yugular Eutanasia: Administrar pentobarbital (90 mg/kg) por vía intravenosa y enjuagar la vía con solución salina para asegurarse de que la dosis completa se administra con éxito. Perfusión: Con una bomba de perfusión (200 ml/min) enchufe el catéter carotídeo en PBS/heparina (1 L para un cerdo de 15 kg) y luego en PBS que contenga un 4% de paraformaldehído (PFA) (5 L para un cerdo de 15 kg). Cuando comience la perfusión, tire de la sutura 3 y corte la vena yugular. Recolección de tejidosDecapitación: Una vez terminada la perfusión, separar la cabeza del animal del cuerpo con un bisturí, cortando la piel y el músculo e insertando la cuchilla entre la primera y la segunda vértebra. Postfijación: Sumergir la cabeza en PFA al 4% en PBS durante otras 48 h a 4 °C y luego transferir a PBS antes de la extracción cerebral. Extracción de cerebro e implantes:Retire la piel con un bisturí y comience a cortar el hueso con cuidado con un rongeur comenzando desde las primeras vértebras, siguiendo la médula espinal hasta el cerebelo. Una vez que el cerebelo esté expuesto, retire con cuidado los huesos temporales y exponga los lóbulos parietal y frontal. En este punto, atornille el pedestal del reposapiés y corte los pies del reposapiés con unos alicates. Retire el hueso cerca de la entrada del cable en el cráneo para liberar el sistema de implantes del hueso, sin tirar de los implantes fuera de la salida de la duramadre. Si los cables del implante están incrustados en el hueso, corte el cable lo más cerca posible de la salida. Una vez que haya suficiente superficie cerebral expuesta, corte con cuidado la duramadre siguiendo la línea media con unas tijeras pequeñas. Libere los cables del implante de la salida de la duramadre. Tome fotografías de la colocación del implante en el cerebro. Luego, use una cuchara pequeña para separar el cerebro de los nervios craneales que se encuentran debajo. Extrae cuidadosamente el cerebro. Retirar los implantes del cerebro. Postfijación del cerebro: Dependiendo de la calidad de la perfusión, postfijar el cerebro extraído de nuevo durante 24 h en PFA al 4% en PBS a 4 °C. Mantener en 0,1 M PBS a 4 °C hasta que se corte el cerebro. Corte de cerebro: Separe los dos hemisferios con una cuchilla de afeitar. Luego, corta el cerebro ortogonalmente en cuatro piezas diferentes. Cortar la zona implantada por la mitad para obtener dos bloques que contengan la zona implantada y un área de control. Guarde los otros dos bloques si se necesitan más guías de control. Crioprotección y congelación cerebral: Transferir los bloques cerebrales a una solución de 15% de sacarosa primero y luego 30% de sacarosa a 4 °C hasta que el cerebro se sumerja y alcance el equilibrio. A continuación, congele el tejido en isopentano a -55 °C en un sistema de congelación de tejidos. 8. Histología Seccionamiento de tejidosCriostato: Coloque el cerebro congelado en un criostato y recorte hasta lograr secciones completas. A continuación, corte el cerebro en secciones de 40 μm y sumérjalo en grupos de tres en 0,1 M PBS en placas de pocillos. Observe cuidadosamente el orden de los platos. Selección de secciones: Seleccione las secciones en función de la zona a analizar (región implantada o zona de control). Saque las secciones secuencialmente de las placas de los pocillos, usando un cepillo fino para inspeccionarlas en busca de daños. Colóquelos en placas de pocillos nuevas llenas de 0,1 M de PBS para una mayor tinción. InmunohistoquímicaPreparación: Incubar las secciones en Triton X/PBS al 0,3% durante 15 min, seguido de albúmina sérica bovina (BSA)/PBS al 3% durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Anticuerpos primarios: Incubar los tejidos con anticuerpos primarios durante 48 h a RT (anti-GFAP, rata, diluido a 1/300; anti Iba1, conejo, diluido a 1/400; anti-NeuN, cobayo, diluido a 1/1.000; todo en BSA/PBS al 1%). Cubra las placas de los pocillos con papel de aluminio. Lavado: Lavar los pocillos con 0,1 M PBS tres veces durante 5 min. Anticuerpos secundarios: Incubar los tejidos con anticuerpos secundarios durante 2 h en RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; todos diluidos a 1/400 en BSA/PBS al 1%). DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol): Incubar los tejidos con DAPI durante 15 min (1/1.000 en BSA/PBS al 1%). Lavado: Lavar los pocillos con 0,1 M PBS cinco veces durante 15 min. Montaje: Monte las guías con medios de montaje y un cubreobjetos. Mantenga las diapositivas en la oscuridad en una nevera a 4 °C. ImagenológicoImágenes de portaobjetos completos: Visualice los portaobjetos con un aumento de 10x (valor de la distancia de trabajo objetiva = 3.100 μm) utilizando un microscopio de escáner de portaobjetos en tres longitudes de onda diferentes (640 nm, 560 nm, 485 nm). Toda la información sobre potencia y ganancia se puede encontrar en el Archivo Suplementario 2. Imágenes microscópicas: Obtenga imágenes de la región de interés con un aumento de 20x (apocromático 20x/0,8 M27) utilizando un microscopio confocal en cuatro longitudes de onda (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Toda la información sobre potencia y ganancia se puede encontrar en el Archivo Complementario 3.