ミニブタにおける硬膜下軟性皮質電図(ECoG)アレイ移植と長期皮質記録

外科的および行動的処置は、実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従って地元の倫理委員会によって承認され、地方(ジュネーブ州)および連邦(スイス)の獣医当局によって承認番号GE11120Aで承認されました。この研究では、生後2〜6か月(5〜8 kg)のメスのゲッティンゲンミニブタ(n = 7)を使用しました。 1.術前計画 ソフトインプラントシステムのin vitro特性評価クロノアンペロメトリー:パルス発生器に並列に接続されたオシロスコープを使用して、二相性電流パルス発生(つまり、電圧過渡[VT])の注入時の電圧降下を記録します。パルス発生器を各電極と生理食塩水中の白金カウンターに順次接続します(リン酸緩衝生理食塩水[PBS] 1x)。設定については、手順3.1を参照してください。 電気化学インピーダンススペクトログラム:ポテンショメータを使用して、さまざまな周波数で電気化学インピーダンスを測定します。生理食塩水(PBS 1x)中の白金カウンターとAg/AgCl参照電極を使用して、ポテンショメータを各電極に順次接続します。設定については、手順3.2を参照してください。 チャネル間抵抗:ドライ状態で、ハンドヘルドマルチメータを使用して隣接するチャネル間の直流(DC)抵抗を測定します。 インプラントの選択:上記の3つの測定の後、100kΩ未満の1kHzでのインピーダンスと1MΩ未満のチャネル間抵抗なしの基準とともにインプラントを選択します。 殺菌インプラント滅菌:選択したインプラントを滅菌マーカーと一緒に滅菌バッグに個別に入れ、密封します。手術中の無菌性を確保するために、二重包装を採用してください。注:この場合、タイムサイクルが短く、低温(55°C)であるため、過酸化水素(H2O2)ガス滅菌が使用されます。代替案は、エチレンオキシド(ETO)ガスまたはオートクレーブ滅菌ですが、インプラントシステムとの互換性を確保する必要があります。 器具の滅菌:洗浄した器具を、滅菌マーカーと一緒に二重滅菌バッグまたは滅菌器具ボックスに入れます。オートクレーブ滅菌は器具に最も一般的であるが、H2O2 またはETOが可能な代替手段である。 2. ソフトECoGアレイの外科的移植 麻酔前投薬:動物を隔離し、一晩絶食します。ミダゾラムを0.75 mg/kg、アトロピンを0.25 μg/kg、ハルドールを0.1 mg/kgの混合液を皮内に注射し、動物が鎮静するまで待ちます。先に進む前に動物の体重を量ってください。 静脈内(IV)リードの取り付け:動物を手術台の上に温熱パッドの上に置きます。3%〜3.5%のセボフルランを使用して、動物にフェイスマスクを置き、麻酔を誘発します。. 腹部に心電図のリード線を、尾部に血中飽和度センサーを、鼻孔に温度センサーを配置します。 点滴リード線を耳静脈に装着し、生理食塩水で満たされた注射器を使用して血液へのアクセスを確認します。軟膏を使用して、目の潤いが保たれていることを確認してください。 挿管:0.5 mg / kgのアトラクリウム、1 mg / kgのケタミン、1〜2 μg / kgのフェンタニルのボーラスを注射します。挿管のために動物を仰向けに置きます。4.5mmチューブを挿入します。 投薬:挿管後、セボフルラン麻酔を中止し、10 mg / kg / hのプロポフォール注入、2 μg / kg / hのフェンタニル、0.2〜0.5 mg / kg / hのアトラクリウム、4〜7 mg / kg / hの生理食塩水を設置します。.手術中の脳の腫れを軽減するために、1 g / kg / hでマンニトールの注入を開始します。注:集学的鎮痛レジメンは、地元の動物倫理委員会によって推奨されている場合、使用できます。 術前X線動物をスフィンクスの位置で腹部に置きます。動物の脳や頭蓋骨の近くにある金属製の物体(鼻孔の鉛など)を一時的に取り除きます。 骨のコントラストで軸面と矢状面のX線を取得します。矢状取得フィールドに既知の寸法の金属物体を配置し、脳の前部と後部の頭蓋骨の厚さを測定するためのスケールとして機能します。 前頭洞の位置(頭蓋骨の下の空洞で見える)を特定し、油性マーカーを使用して動物の頭の最も後方の位置をマークします。これは、以下に説明する外科的アプローチで開頭術またはスクリュー配置を行うことができる最も遠いポイントを示します。 無菌フィールドと皮膚の準備:手術野を超えて頭の表面全体を剃ります。滅菌パッドを使用して、ベタジンで頭を徹底的にこすります。次に、器具台と動物の上に滅菌ドレープを置き、手術窓だけが見えるようにします。最後に、ベタジンを使用して滅菌パッドで頭をもう一度こすります。 開頭術と硬膜切開術皮膚の切り傷:正中線に沿ってメスナイフで皮膚を切開します。筋肉と骨膜(両側のブレグマから横方向に25 mm、ブレグマから前方と後方に40 mm)をラスパトリーを使用して骨から分離し、スプレッダーを配置して、後の掘削に最適なアクセスを確保します。 測定とマーキング:ブレグマとラムダを識別し、滅菌手術用ペンでマーキングします(図2A、B)。滅菌定規を使用して、両半球の移植ターゲットを中心に骨皮弁の輪郭を定義します。この特定のケースでは、聴覚皮質が選択され、ブレグマからの座標は-5mmから-15mm、横方向の座標は-4mmから-20mmでした。次に、開頭手術をインプラントのサイズと解剖学的ランドマークに合わせて調整し、開口部のサイズを制限します。 開頭術:丸いカッティングビット付きの骨ドリルを使用して、ステップ2.2で測定した頭蓋骨の厚さを考慮して、開頭術の輪郭をドリルで開けます。骨の過熱を防ぐために、掘削場所を生理食塩水で灌漑します。 硬膜に達するまで、輪郭を均一に慎重にドリルで開けます。最初のブレークスルーでは、アウトラインがほぼ突き抜けるほど薄くなるまで穴あけを終了します。次に、平らなスパチュラ(正中線側または外側のいずれか)を使用して、開頭術の縁をテコにして、骨皮弁を1つに分解します。抵抗が大きすぎる場合は、骨を薄くし続けます。 骨片を滅菌生理食塩水に入れます。 骨皮弁が取り除かれたら、鋭利な骨の縁が硬膜に食い込まないようにケリソンを使用して、開頭術の端を慎重に削り取ります。 硬膜または骨に過度の出血が発生した場合は、それぞれゲルフォームまたは骨ワックスを使用してください。開頭術に湿布(滅菌生理食塩水の標準パッド)を置き、もう一方の半球でこの手順を繰り返します(図2B)。 硬膜切開術:6-0縫合キットの針を使用して、開頭術の前端または後端の内側と外側の中間にある硬膜を慎重に突き刺して持ち上げ、スタブナイフで切開の始まりを作成します。 次に、硬膜下腔に挿入された小さな平らなヘラを切断ベースとして使用して皮質を保護し、両方のツールを同時に進めることで硬膜に前後スリットを作成します。スリットがインプラントの幅よりわずかに大きいことを確認します(図2C)。このステップで出血や損傷が発生した場合は、ジェルフォームで覆い、止まるまで待ちます。注:スリットの軌跡は、出血を避けるために硬膜に大きな血管が存在する場合に適合させる必要があります。 移植デバイスの挿入:インプラント(補足図1A)の両側に生理食塩水を灌漑し、硬膜下腔に滑り込みやすくします。硬膜スリットの上にインプラントを配置し、小さな鉗子を使用して、デバイスを各端で順番にスライドさせて硬膜下に挿入します。 デバイスの台座の端を慎重に保持し、挿入を妨げる張力を発生させないようにインプラントを前進させます。コネクタの端がスリットの上に来たら、挿入を停止します。 インプラントを固定する:インプラントを所定の位置に固定するには、開頭術の端またはアンカーウィングのケーブルの上にチタン製のブリッジを置き、適切なドライバーを使用して1本または2本のチタン製ネジで固定します(図2D)。 接地配置:接地線の絶縁体を1cm慎重に取り除き、開頭術の後端(または目的の皮質または太い血管から遠く離れた硬膜外の位置)に硬膜外に挿入します( 図2Eのワイヤー) 手順 2.4.4 を繰り返します。および2.5.1.-2.5.3対側半球。 配置を確認するための術中X線:ウェットパッド(滅菌生理食塩水の標準パッド)を手術部位に置き、組織の水分補給を保ちます。次に、動物の頭を覆うように滅菌手術用ドレープを置きます。 X線マーカーを指標として使用して、インプラントが適切に配置され、折りたたまれていないことを確認するために、平面X線画像(軸方向および矢状)を撮影します。そうでない場合は、ドレープを取り外し、デバイスを外植して再度挿入します(手順2.4.4.および2.5.1.-2.5.3を再度実行します)。 硬膜閉鎖:3-0吸収性縫合糸と小さなニードルホルダーを使用して、インプラントケーブルの周囲に硬膜を慎重に縫合します。縫合ワイヤーで薄い膜を引き裂くことなく、2つの硬膜の縁をできるだけ一緒にします(図2D、E)。 骨フラップの配置:チタン製のネジを使用して、各骨フラップの前部と後部にチタン製のブリッジを固定します。次のステップでは、フットプレートの脚の配置に関してTiブリッジの位置を計画するように注意してください。チタン製ブリッジの端を頭蓋骨にねじ込みます(図2F、G)。 台座とフットプレートの配置位置決め:この構成では、フットプレートにはそれぞれ2つのネジ穴が付いた6本の脚があります(補足図1B)。頭蓋骨へのフットプレートの配置を計画して、ネジの位置を最適化します(開頭術の端や側頭筋に配置することは避けてください)。脚の穴をねじ込めない場合はスキップします。 フットプレートの固定:フットプレートのチタン製ネジをしっかりと所定の位置に収まるまでねじ込みます( 図2Hを参照)。 ペデスタルの配置:接続ケーブルの上にあるチタンブリッジを取り外し、ペデスタルを裏返してフットプレートに着陸させます。台座をフットプレートにねじ込みます。台座がしっかりと固定されていることを確認します(図2I)。 縫合と閉鎖創傷の洗浄:生理食塩水で洗い流して、骨やその他の破片の皮下空間をきれいにします。台座の端の周りの皮膚を切り取り、円柱に続く丸い縁を作成します。 皮下縫合:スプレッダーを取り外し、皮膚フラップを一緒に折ります。単純な断続縫合糸または単純な連続縫合糸を使用して、4-0の非吸収性縫合糸ワイヤーを3mm離して皮下縫合糸を作成します。台座から離れ、切開の両側で台座に向かって移動します。 皮膚縫合糸:6-0の非吸収性縫合糸ワイヤーを使用して皮膚を縫合し、縫合糸を5mm離して縫合します。台座から離れ、切開の両側で台座に向かって移動します。空隙を避けるために、2つの皮膚フラップの間とペデスタルエッジの近くで良好な組織配置を実現するように注意してください(図2J)。 創傷被覆材:滅菌パッドとベタジンで創傷領域を再度清掃します。創傷の上に粘着性の滅菌包帯を貼ります。 in vivo 測定:in vivo 測定については、セクション 3、4、5 に従ってください。 覚醒:すべての測定が行われた後、動物をすべての麻酔薬から外し、換気を保ちます。鎮痛剤の場合は、ブプレノルフィンパッチ(25 mg / h)を24時間塗布します。.ドレープで覆われた温熱パッドの上に動物を置き、起床時間を早めます。自発呼吸が回復したら、動物を抜管し、意識が回復するまで酸素フェイスマスクの下に置いてください(1〜4時間かかる場合があります)。 術後の動物のケア:5日間、動物を綿密な監視下に置きます。75mgのセファレキシンを1日2回、他の動物から分離して食物と一緒に投与します。浸した滅菌パッドで大量のベタジンを塗布することにより、毎日創傷の消毒を行います(給餌中に行うのが最適です)。注:長期ケアと飼育:手術を受けた動物は24時間隔離されます。動物が仲間と社会的に交流するのに十分な健康状態であれば、元の社会集団に戻されます。台座と皮膚の開口部を毎日観察して、頭部へのデバイスの統合を追跡する必要があります。必要に応じて、台座の周りの場所を大量のベタジンで清掃します。 3. 軟部インプラントの in vivo 特性評価 クロノアンペロメトリー:パルス発生器に並列に接続されたオシロスコープを使用して、二相性電流パルス発生(VT)の注入時の電圧降下を記録します。パルス発生器を各電極とアース線に順次接続します。100Hzで300μsのパルス幅で100μAの刺激パルスを実行します。 電気化学インピーダンス分光法:ポテンショメータを使用して、さまざまな周波数で電気化学インピーダンスを測定します。パルス発生器を各電極に順次接続し、アース線を対向電極とアースの両方として使用します。励起電圧を 200 mV、周波数範囲を 1 Hz から 1 MHz に設定し、ディケードごとに 3 ポイントに設定します。 チャンネル間短絡測定:ハンドヘルドマルチメータを使用して、隣接するチャンネル間のDC抵抗を測定します。 In vivoでは、チャンネル間DC抵抗は、1kΩ未満の不足が発生しないことを確認するためにのみ測定され、完全な封止不良を示します。 4.電気生理学的記録 自発的な活動:ワイヤレス録音システムを台座に差し込み、ベースライン活動を2〜3分間記録します。これらの記録は、聴覚誘発電位を分析するためのコントロールとして機能します。 聴覚誘発電位:ワイヤレスシステムに加えて、動物の耳の閉音場にスピーカーを挿入します。さまざまな周波数(200〜20,000 Hzの範囲)で、約70dBの音圧レベル(SPL)で120回の繰り返しでトーンバースト音響刺激を再生します。次に、記録を平均化し、分析のために刺激期間にわたってそれらを調整します。 感覚誘発電位:針を鼻の3つの異なる位置に置きます。異なる振幅のパルス発生器で鼻を~30秒間刺激することにより、感覚電位を呼び起こし、動員曲線を取得します。 5. 生体内 イメージング 動物の輸送:ステップ2.1で説明したように、動物をプロポフォール麻酔下に置いてください。人工呼吸器、シリンジポンプ、バイタルサインモニターを収納した搬送カートを使用して、手術室から画像診断施設まで動物を輸送します。 コンピュータ断層撮影X線スキャン:動物をスキャナーテーブルの上に置き、頭の周りの金属物(温度センサーなど)をすべて取り除きます。骨造影のための自動電流および電圧選択を備えたアイソメトリック取得を使用して、最小の解像度(スライス厚さ0.4mm)でCTスキャンを取得します。 磁気共鳴画像法:動物から金属を含むすべての機器を取り除きます(MRI互換のIVリード線と挿管チューブを使用してください)。MRIチャンバーの外側にあり、長いチューブを介して動物にリンクされている人工呼吸器を使用して、3%〜3.5%のセボフルラン下で動物を換気および麻酔します。.最初のシーケンスの前に、フェンタニルのボーラスを1〜2 μg / kgで注射します。.最小分解能で 3 つのアイソメトリック配列 (T1、T2、ターボスピンエコー (TSE) 加重配列) を使用します (パラメーターは 補足ファイル 1 に示されています)。 6.自由に動く録音 脳からの覚醒信号を記録するために、セクション4で説明したのと同じ手順に従います。動物を実験者の腕に抱きかかえるか、動物におやつを与えて気をそらすことで、ワイヤレスヘッドステージを接続します。動物の近くに設置した外部スピーカーを使って音響刺激を与えます。 7. 灌流および組織調製 オプション:動物がまだ麻酔を受けていない場合は、麻酔プロトコルのステップ2.1に従います。 灌流のための頸動脈へのカテーテルの挿入(補足図2)頸動脈および頸静脈解離:焼灼器/カッターを使用して正中線で喉を切断します。最初に皮膚を切開し、次に真ん中の白い線(下に血管がない)に続く筋肉を切開します(補足図2A)。 さらに開き、指を使って気管の周りと筋肉の下にスペースを作ります。頸動脈(鼓動とピンクがかった)を探します。迷走神経も時々周り(白)にあり、頸静脈は下または横(赤)にあることがあります。スプレッダーを配置します( 補足図2Bを参照)。 細かい鉗子と丸いハサミを使用して頸動脈の解剖を開始します。はさみを使用して結膜組織を開きます。血管がない場合は、切ります。血管がある場合は、焼灼して前進します(補足図2C、D)。十分に解剖したら、クランプを使用して頸動脈の下をくぐり、完全に分離します(補足図2E)。 頸静脈でも同じ操作を繰り返します(補足図2F)。 両方の血管が完全に解剖され、隔離されたら、それらの周りに縫合糸を配置します。まだ閉じないでください。頸動脈の周囲に2本の縫合糸があり、1本は基部(脳灌流用の縫合糸1-心臓側)ともう片側(縫合糸2)に1本は、 補足図2Gに示されている。 頸静脈(縫合糸3)の周りに1本の縫合糸を置き、閉じないようにします。後で静脈を切片化するために、ワイヤーにテープで印を付けます。 縫合糸1を非常にしっかりと閉じないと、出血します(補足図2H)。3つの結び目を作ります。ワイヤーにクランプをかけて体重をかけ、頸動脈に緊張をかけます。 頸動脈解離の反対側(脳灌流の場合は脳側)の血管クランプを使用して頸動脈をクランプします。 補足図2I)。縫合糸2は真ん中にあり、まだ閉じていません。 黒い鉗子を使用して頸動脈を引っ張ってください。細いハサミを使用して、解剖の基部近くの頸動脈の半分を切片(縫合糸1の近く、心臓側; 補足図2Jを参照)。セクションができるだけきれいで、「シース」だけでなく容器自体にも届いていることを確認してください。そうしないと、カテーテルが通過しません。 補足図2Kに示すようにカテーテルを挿入します。 カテーテルを洗い流して満たし、まずPBSで満たし、カテーテル内に空気が残らないようにします(補足図2K挿入図 )。 縫合糸2が離れないように十分にしっかりと閉じますが、カテーテルがまだ少し動くことができるようにしすぎないようにします(補足図2L)。次に、血管クランプを取り外し、カテーテルの挿入を可能な限り終了し、縫合糸2の閉鎖を確定します(しっかりと閉じます)。 必要に応じて、縫合糸1で縫合ワイヤーを使用して、追加のセキュリティステップとして、カテーテルの基部を創傷出口の皮膚に取り付けます。次に、動物を灌流ゾーンに移し、PBS/ヘパリンに差し込みます。灌流が始まったら、縫合糸3を引っ張り、頸静脈を切断します 安楽死:ペントバルビタール(90 mg / kg)を静脈内投与し、生理食塩水でラインを洗い流して、全用量が正常に投与されるようにします。. 灌流:灌流ポンプ(200 mL / min)を使用して、頸動脈カテーテルをPBS/ヘパリン(15 kgのブタの場合は1 L)に差し込み、次に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含むPBS(15 kgのブタの場合は5 L)に差し込みます。灌流が始まったら、縫合糸3を引っ張り、頸静脈を切断します。 組織採取斬首:灌流が終わったら、メスを使って皮膚と筋肉を切り裂き、第1椎骨と第2椎骨の間に刃を挿入して、動物の頭を体から切り離します。 固定後:頭部をPBS中の4%PFAに4°Cでさらに48時間浸し、脳摘出前にPBSに移します。 脳とインプラントの摘出:メスを使って皮膚を取り除き、脊髄から小脳まで、最初の椎骨から始めてロンジュールを使用して慎重に骨を切り始めます。小脳が露出したら、側頭骨を慎重に除去し、頭頂葉と前頭葉を露出させます。 この時点で、台座をフットプレートからねじ込み、フットプレートの足をペンチで切断します。頭蓋骨へのケーブル入口付近の骨を取り除き、インプラントを硬膜出口から引き抜くことなく、インプラントシステムを骨から解放します。 インプラントケーブルが骨に埋め込まれている場合は、ケーブルをできるだけ出口の近くで切断します。脳表面が十分に露出したら、小さなハサミを使用して正中線に沿って硬膜を慎重に切ります。 インプラントケーブルを硬膜出口から解放します。脳へのインプラント埋入から写真を撮ります。次に、小さなスプーンを使用して、脳を下の脳神経から切り離します。脳を慎重に抽出します。脳からインプラントを取り除きます。 脳の事後固定:灌流の質に応じて、摘出した脳を4°CのPBS中の4%PFAで24時間再度後付けします。 脳が切断されるまで、0.1 M PBSを4°Cで保持します。 脳の切断:カミソリの刃を使用して2つの半球を分離します。次に、脳を直交して4つの異なる部分に切ります。植込みゾーンを半分に切断して、植込みゾーンとコントロールエリアを含む2つのブロックを取得します。他の 2 つのブロックは、さらにコントロール スライドが必要な場合は保管します。 脳の凍結保護と凍結:脳ブロックを最初に15%のショ糖の溶液に移し、次に4°Cで30%のスクロースの溶液に移し、脳が急降下して平衡に達するまで加熱します。次に、組織凍結システムで-55°Cのイソペンタンで組織を凍結します。 8.組織学 組織切片化クライオスタット:凍結した脳をクライオスタットに入れ、完全な切片が得られるまでトリミングします。次に、脳を40 μmの切片にスライスし、ウェルプレートの0.1 M PBSに3つのグループで浸します。プレートの順序に注意してください。 セクションの選択:分析するゾーン(埋め込み領域またはコントロールゾーン)に応じてセクションを選択します。ウェルプレートから切片を順番に取り出し、細いブラシを使用して損傷がないか検査します。0.1 M PBSで満たされた新しいウェルプレートに入れ、さらに染色します。 免疫組織化学調製:切片を0.3% Triton X/PBSで15分間インキュベートし、続いて3%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBSで室温(RT)で1時間インキュベートします。 一次抗体:一次抗体とともに組織を室温で48時間インキュベートします(抗GFAP、ラット、1/300に希釈、抗Iba1、ウサギ、1/400に希釈、抗NeuN、モルモット、1/1,000に希釈、すべて1%BSA/PBS中)。ウェルプレートをアルミホイルで覆います。 洗浄:ウェルを0.1 M PBSで5分間3回洗浄します。 二次抗体:二次抗体(Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 555、すべて1% BSA/PBSで1/400に希釈)で2時間インキュベートします。 DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール):組織をDAPIで15分間インキュベートします(1%BSA/PBS中1/1,000)。 洗浄:ウェルを0.1 M PBSで15分間5回洗浄します。 取り付け:封入剤とカバーガラスを使用してスライドを取り付けます。スライドは暗所で4°Cの冷蔵庫で保管してください。 イメージングホールスライドイメージング:3つの異なる波長(640 nm、560 nm、485 nm)のスライドスキャナー顕微鏡を使用して、10倍の倍率(対物レンズ作動距離値=3,100 μm)でスライドをイメージングします。すべての電力とゲインの情報は、 補足ファイル2に記載されています。 顕微鏡イメージング:共焦点顕微鏡を用いて、4波長(Alexa Fluor 647、DAPI、Cy3、EGFP)で20倍の倍率(アポクロマート20x/0.8 M27)で関心領域をイメージングします。すべての電力とゲインの情報は、 補足ファイル3に記載されています。