Implantation d’un réseau d’électrocorticographie molle sous-durale (ECoG) et enregistrement cortical à long terme chez les miniporcs

Les procédures chirurgicales et comportementales ont été approuvées par le comité d’éthique local conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par les autorités vétérinaires locales (canton de Genève) et fédérales (suisses) avec le numéro d’autorisation GE11120A. Des miniporcs femelles de Göttingen (n = 7) âgés de 2 à 6 mois (5 à 8 kg) ont été utilisés dans cette étude. 1. Planification préopératoire Caractérisation in vitro du système d’implants souplesChronoampérométrie : Enregistrez la chute de tension lors de l’injection d’une évolution d’impulsion de courant biphasique (c’est-à-dire le transitoire de tension [VT]) à l’aide d’un oscilloscope connecté en parallèle à un générateur d’impulsions. Connectez le générateur d’impulsions de manière séquentielle à chaque électrode et à un compteur de platine en solution saline (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] 1x). Reportez-vous à l’étape 3.1 pour les paramètres. Spectrogramme d’impédance électrochimique : Mesurez l’impédance électrochimique à différentes fréquences à l’aide d’un potentiomètre. Connectez le potentiomètre séquentiellement à chaque électrode à l’aide du compteur de platine et d’une électrode de référence Ag/AgCl en solution saline (PBS 1x). Reportez-vous à l’étape 3.2 pour les paramètres. Résistance intercanal : à l’état sec, mesurez la résistance au courant continu (CC) entre les canaux adjacents à l’aide d’un multimètre portatif. Sélection de l’implant : Après les trois mesures citées ci-dessus, sélectionnez l’implant avec les critères suivants : impédance à 1 kHz en dessous de 100 kΩ et pas de résistance intercanal en dessous de 1 MΩ. StérilisationStérilisation des implants : Placez les implants sélectionnés individuellement dans des sacs de stérilisation avec un marqueur de stérilisation et scellez-les. Utilisez un double emballage pour assurer la stérilité pendant la chirurgie.REMARQUE : Dans ce cas, la stérilisation au peroxyde d’hydrogène (H 2 O2) est utilisée en raison du cycle court et de la basse température (55 °C). Les alternatives sont la stérilisation à l’oxyde d’éthylène gazeux (ETO) ou à l’autoclave, mais la compatibilité avec le système d’implant doit être assurée. Stérilisation des instruments : Placez les instruments nettoyés dans des sacs de stérilisation doubles ou des boîtes à instruments stériles avec des marqueurs de stérilisation. La stérilisation en autoclave est la plus courante pour les instruments, mais H 2 O2ou ETO sont des alternatives possibles. 2. Implantation chirurgicale de puces ECoG souples AnesthésiePrémédication : Isolez l’animal et faites-le jeûner toute la nuit. Injecter un mélange de midazolam à 0,75 mg/kg, d’atropine à 0,25 μg/kg et d’haldol à 0,1 mg/kg par voie intradermique, et attendre que l’animal soit sous sédatif. Pesez l’animal avant de continuer. Mise en place d’une sonde intraveineuse (IV) :Placez l’animal sur la table d’opération sur un coussin chauffant. Induire l’anesthésie en plaçant un masque facial sur l’animal, en utilisant du sévoflurane à 3 % à 3,5 %. Placez des sondes d’électrocardiogramme sur l’abdomen, un capteur de saturation sanguine sur la queue et un capteur de température dans la narine. Placez une sonde intraveineuse sur une veine de l’oreille et confirmez l’accès au sang à l’aide d’une seringue remplie de solution saline. Assurez-vous que les yeux sont maintenus hydratés en utilisant une pommade. Intubation : Injecter un bolus d’atracurium à 0,5 mg/kg, de kétamine à 1 mg/kg et de fentanyl à 1-2 μg/kg. Placez l’animal sur le dos pour l’intubation. Insérez un tube de 4,5 mm. Médicaments : Après l’intubation, arrêter l’anesthésie au sévoflurane et installer une perfusion de propofol à 10 mg/kg/h, de fentanyl à 2 μg/kg/h, d’atracurium à 0,2-0,5 mg/kg/h et de solution saline à 4-7 mg/kg/h. Commencez une perfusion de mannitol à raison de 1 g/kg/h pour réduire le gonflement du cerveau pendant la chirurgie.REMARQUE : Un régime d’analgésie multimodale peut être utilisé si recommandé par le comité local d’éthique animale. Radiographie préopératoirePlacez l’animal sur son abdomen en position de sphinx. Retirez temporairement tout objet métallique à proximité du cerveau et du crâne de l’animal (p. ex., plomb de température dans la narine). Acquérir une radiographie axiale et sagittale avec un contraste de l’os. Placez un objet métallique de dimensions connues dans le champ d’acquisition sagittale pour servir d’échelle afin de mesurer l’épaisseur du crâne à l’avant et à l’arrière du cerveau. Identifiez l’emplacement des sinus frontaux (visibles par des vides sous le crâne) et marquez l’emplacement le plus postérieur sur la tête de l’animal à l’aide d’un marqueur permanent. Cela indiquera le point le plus éloigné où une craniotomie ou la pose d’une vis peut être effectuée dans l’approche chirurgicale décrite ci-dessous. Champ aseptique et préparation de la peau : Rasez toute la surface de la tête au-delà du champ chirurgical. À l’aide d’un tampon stérile, frottez soigneusement la tête avec de la bétadine. Ensuite, placez des champs stériles sur la table d’instrumentation et sur l’animal pour ne révéler que la fenêtre chirurgicale. Enfin, frottez à nouveau la tête avec un tampon stérile à base de bétadine. Craniotomie et durotomieCoupe de la peau : Inciser la peau avec un couteau scalpel le long de la ligne médiane. Séparez le muscle et le périoste (25 mm latéralement du bregma des deux côtés et 40 mm avant et postérieur au bregma) de l’os à l’aide d’une râpe et placez des écarteurs pour obtenir un accès optimal pour un perçage ultérieur. Mesures et marquage : Identifiez le bregma et le lambda et marquez-les à l’aide d’un stylo chirurgical stérile (Figure 2A, B). À l’aide d’une règle stérile, définissez le contour du lambeau osseux centré autour de la cible d’implantation sur les deux hémisphères. Dans ce cas précis, le cortex auditif a été choisi, avec des coordonnées -5 mm à -15 mm à partir de bregma et -4 mm à -20 mm latéralement. Ensuite, ajustez la craniotomie à la taille de l’implant et aux repères anatomiques, en limitant la taille de l’ouverture. Craniotomie:À l’aide d’une perceuse à os munie d’une mèche à coupe ronde, percez le contour de la craniotomie, en tenant compte de l’épaisseur du crâne mesurée à l’étape 2.2. Irriguer l’emplacement de forage avec une solution saline pour éviter la surchauffe de l’os. Percez soigneusement le contour de manière homogène jusqu’à ce qu’il atteigne la dure-mère. À la première percée, terminez de percer le contour jusqu’à ce qu’il soit suffisamment aminci pour presque percer. Ensuite, utilisez une spatule plate (soit sur le côté de la ligne médiane, soit sur le côté latéral) pour détacher le lambeau osseux en un seul morceau, en utilisant le bord de la craniotomie comme levier. Si vous rencontrez trop de résistance, continuez à amincir l’os. Placez le morceau d’os dans une solution saline stérile. Une fois le lambeau osseux retiré, ébréchez soigneusement le bord de la craniotomie, à l’aide d’un Kerison pour éviter que le bord osseux tranchant ne coupe la dure-mère. Si un saignement excessif est observé sur la dure-mère ou l’os, utilisez de la mousse de gel ou de la cire d’os, respectivement. Placez une compresse humide (tampon standard dans une solution saline stérile) dans la craniotomie et répétez cette étape sur l’autre hémisphère (Figure 2B). Durotomie :À l’aide de l’aiguille d’un kit de suture 6-0, percez et soulevez soigneusement la dure-mère à l’extrémité antérieure ou postérieure de la craniotomie à mi-chemin entre le côté médial et latéral et créez le début d’une incision avec le couteau à couteau. Ensuite, à l’aide d’une petite spatule plate insérée dans l’espace sous-dural agissant comme une base de coupe pour protéger le cortex, créez une fente antéropostérieure dans la dure-mère en avançant simultanément avec les deux outils. Assurez-vous que la fente est légèrement plus grande que la largeur de l’implant (Figure 2C). Si un saignement ou des dommages se produisent à cette étape, couvrez-le de mousse de gel et attendez qu’il s’arrête.REMARQUE : La trajectoire de la fente doit être adaptée si de gros vaisseaux sanguins sont présents dans la dure-mère pour éviter les saignements. ImplantationInsertion de l’appareil :Irriguez l’implant (figure supplémentaire 1A) avec du sérum physiologique des deux côtés afin qu’il glisse plus facilement dans l’espace sous-dural. Placez l’implant au-dessus de la fente de la dure-mère et, à l’aide d’une petite pince, insérez le dispositif sous-duralement en le faisant glisser séquentiellement sur chaque bord. Tenez soigneusement l’extrémité du piédestal de l’appareil et avancez avec l’implant afin de ne pas créer de tension gênant l’insertion. Lorsque le bord du connecteur est situé au-dessus de la fente, arrêtez l’insertion. Fixez l’implant : Pour fixer l’implant en place, placez un pont en titane sur le câble après le bord de la craniotomie ou dans les ailes d’ancrage et fixez-le avec une ou deux vis en titane à l’aide du tournevis approprié (Figure 2D). Mise en place au sol : Retirez délicatement 1 cm de l’isolant des fils de terre et insérez-le par voie péridurale à l’extrémité postérieure de la craniotomie (ou à tout endroit péridural éloigné du cortex d’intérêt ou des gros vaisseaux sanguins) (fil de la figure 2E) Répétez les étapes 2.4.4. et 2.5.1.-2.5.3 sur l’hémisphère controlatéral. Radiographie peropératoire pour confirmer la mise en place :Placez un tampon humide (tampon standard dans une solution saline stérile) sur l’emplacement de la chirurgie pour garder les tissus hydratés. Ensuite, placez un champ chirurgical stérile pour couvrir la tête de l’animal. Prenez des radiographies planes (axiales et sagittales) pour vous assurer que les implants sont bien placés et ne sont pas pliés, en utilisant les marqueurs radiographiques comme indicateurs. Si ce n’est pas le cas, retirez le champ et explantez l’appareil pour l’insérer à nouveau (suivez à nouveau les étapes 2.4.4 et 2.5.1.-2.5.3). Fermeture de la dure-mère : Suturez soigneusement la dure-mère autour du câble de l’implant à l’aide d’une suture résorbable 3-0 et d’un petit porte-aiguille. Rapprochez les deux bords de la dure-mère autant que possible sans déchirer la fine membrane avec le fil de suture (Figure 2D, E). Mise en place du lambeau osseux : Fixez un pont en titane sur la partie antérieure et postérieure de chaque lambeau osseux à l’aide d’une vis en titane. Attention à bien planifier le positionnement des Ti-bridges par rapport au placement des pieds de repose-pieds dans les étapes suivantes. Vissez l’extrémité des bridges en titane sur le crâne (Figure 2F, G). Placement du piédestal et du repose-piedsPositionnement : Dans cette configuration, le repose-pieds comporte six pieds avec deux trous de vis chacun (figure supplémentaire 1B). Prévoyez le placement du repose-pieds sur le crâne pour optimiser l’emplacement des vis (évitez de les placer en bordure de la craniotomie ou dans le muscle temporal). Sautez les trous dans les pieds s’ils ne peuvent pas être vissés. Fixation de la plaque de pied : Vissez les vis en titane de la plaque de base jusqu’à ce qu’elle soit fermement en place (voir Figure 2H). Placement du piédestal : Retirez les ponts en titane sur les câbles de connexion et retournez le piédestal pour atterrir sur le repose-pieds. Vissez le piédestal sur le repose-pieds. Vérifiez que le piédestal est bien en place (Figure 2I). Suture et fermetureNettoyage de la plaie : Nettoyez l’espace sous-cutané de tout os ou autre débris en rinçant avec une solution saline. Découpez un peu de peau autour des bords du piédestal pour créer un bord arrondi suivant le cylindre. Sutures sous-cutanées : Retirez les écarteurs et repliez les lambeaux de peau ensemble. Créez des sutures sous-cutanées avec un fil de suture non résorbable 4-0, espacé de 3 mm à l’aide de sutures interrompues simples ou de sutures continues simples. Commencez par vous éloigner du piédestal, en vous déplaçant vers lui des deux côtés de l’incision. Sutures dermiques : Suturez la peau à l’aide d’un fil de suture non résorbable 6-0, avec des sutures espacées de 5 mm. Commencez par vous éloigner du piédestal, en vous déplaçant vers lui des deux côtés de l’incision. Veillez à obtenir une bonne apposition tissulaire entre les deux lambeaux de peau et près du bord du piédestal pour éviter un vide (Figure 2J). Pansement : Nettoyez à nouveau la zone de la plaie avec un tampon stérile et de la bétadine. Appliquez un pansement stérile auto-adhésif sur la plaie. Mesures in vivo : Pour les mesures in vivo, suivez les sections 3, 4 et 5. Réveil : Une fois que toutes les mesures ont été effectuées, retirez l’animal de tous les anesthésiques mais gardez-le sous ventilation. Pour l’analgésie, appliquer un patch de buprénorphine (25 mg/h) pendant 24 h. Placez l’animal sur un coussin chauffant recouvert de rideaux pour accélérer le réveil. Lorsque la respiration spontanée est rétablie, extubez l’animal et mettez-le sous un masque à oxygène jusqu’à ce qu’il reprenne conscience (ce qui peut prendre de 1 à 4 h). Soins postopératoires de l’animal : Pendant 5 jours, gardez l’animal sous étroite surveillance. Donnez une dose de céphalexine à 75 mg deux fois par jour avec de la nourriture, séparée des autres animaux. Effectuez une désinfection quotidienne de la plaie en appliquant de grandes quantités de bétadine avec des tampons stériles imbibés (il est préférable de le faire pendant la tétée).REMARQUE : Soins de longue durée et hébergement : L’animal opéré est maintenu isolé pendant 24 h. Il est remis dans son groupe social d’origine si l’animal est assez bien pour interagir socialement avec ses congénères. L’observation quotidienne du piédestal et de l’ouverture de la peau doit être effectuée pour suivre l’intégration de l’appareil sur la tête. Le cas échéant, nettoyez l’emplacement autour du piédestal avec de grandes quantités de bétadine. 3. Caractérisation in vivo de l’implant souple Chronoampérométrie : Enregistrez la chute de tension lors de l’injection d’une évolution d’impulsion de courant biphasique (c’est-à-dire le VT) à l’aide d’un oscilloscope connecté en parallèle à un générateur d’impulsions. Connectez le générateur d’impulsions séquentiellement à chaque électrode et au fil de terre. Effectuez l’impulsion de stimulation à 100 μA avec une largeur d’impulsion de 300 μs à 100 Hz. Spectroscopie d’impédance électrochimique : Mesurez l’impédance électrochimique à différentes fréquences à l’aide d’un potentiomètre. Connectez le générateur d’impulsions séquentiellement à chaque électrode, en utilisant le fil de terre comme contre-électrode et comme terre. Réglez la tension d’excitation à 200 mV et la plage de fréquences de 1 Hz à 1 MHz, avec trois points par décade. Mesures de court-circuit entre canaux : mesurez la résistance CC entre les canaux adjacents à l’aide d’un multimètre portatif. In vivo, la résistance CC intercanal n’est mesurée que pour vérifier qu’aucun déficit inférieur à 1 kΩ n’apparaît, indiquant une défaillance totale de l’encapsulation. 4. Enregistrement électrophysiologique Activité spontanée : Branchez le système d’enregistrement sans fil à travers le piédestal et enregistrez l’activité de base pendant 2 à 3 minutes. Ces enregistrements serviront de contrôle pour analyser les potentiels évoqués auditifs. Potentiels évoqués auditifs : En plus du système sans fil, insérez des haut-parleurs dans un champ fermé dans les oreilles des animaux. Stimulation acoustique en rafale à différentes fréquences (allant de 200 à 20 000 Hz) à un niveau de pression acoustique (SPL) d’environ 70 dB sur 120 répétitions. Ensuite, faites la moyenne des enregistrements et alignez-les sur la période de stimulus pour l’analyse. Potentiels évoqués sensoriels : Placez les aiguilles dans le museau à trois positions différentes. Evoquer les potentiels sensoriels en stimulant le museau pendant ~30 s avec le générateur d’impulsions à différentes amplitudes pour obtenir les courbes de recrutement. 5. Imagerie in vivo Transport de l’animal : Garder l’animal sous anesthésie au propofol, comme décrit à l’étape 2.1. Utilisez un chariot de transport qui abrite un ventilateur, un pousse-seringue et un moniteur de signes vitaux pour transporter l’animal de la salle d’opération aux installations d’imagerie et vice-versa. Tomodensitométrie : Placez l’animal sur la table du scanner et retirez tout objet métallique autour de la tête (p. ex., le capteur de température). Acquisition d’une tomodensitométrie à la plus petite résolution (0,4 mm d’épaisseur de tranche) à l’aide de l’acquisition isométrique avec sélection automatique du courant et de la tension pour le contraste osseux. Imagerie par résonance magnétique : Retirez tout l’équipement contenant du métal de l’animal (utilisez des sondes intraveineuses compatibles avec l’IRM et un tube d’intubation). Maintenir l’animal ventilé et anesthésié sous sévoflurane à 3 % à 3,5 %, à l’aide d’un ventilateur situé à l’extérieur de la chambre d’IRM et relié à l’animal par un long tube. Avant la première séquence, injecter un bolus de fentanyl à raison de 1 à 2 μg/kg. Utilisez trois séquences isométriques à la plus petite résolution : séquences pondérées en T1, T2 et en écho de spin turbo (TSE) (paramètres indiqués dans le fichier supplémentaire 1). 6. Enregistrement en mouvement libre Suivez la même procédure que celle décrite à la rubrique 4 pour l’enregistrement des signaux d’éveil du cerveau. Branchez la tête sans fil en tenant l’animal dans les bras de l’expérimentateur ou en le nourrissant avec des friandises pour le distraire. Fournir la stimulation acoustique à l’aide de haut-parleurs externes placés à proximité de l’animal. 7. Perfusion et préparation des tissus FACULTATIF : Si l’animal n’est pas déjà sous anesthésie, suivez l’étape 2.1 pour le protocole d’anesthésie. Insertion d’un cathéter dans l’artère carotide pour la perfusion (Figure supplémentaire 2)Dissection de l’artère carotide et de la veine jugulaire : Coupez la gorge au niveau de la ligne médiane à l’aide d’un cautériseur/coupe-bordure. Coupez d’abord la peau, puis le muscle en suivant la ligne blanche du milieu (pas de vaisseaux en dessous) (figure supplémentaire 2A). Ouvrez davantage, en utilisant les doigts pour faire de l’espace autour de la trachée et sous le muscle. Recherchez l’artère carotide (battante et rosâtre) ; Le nerf vagal est parfois aussi autour (blanc), et la veine jugulaire peut être en dessous ou sur le côté (rouge). Placez les épandeurs (voir la figure supplémentaire 2B). Commencez la dissection de l’artère carotide à l’aide d’une pince fine et de ciseaux ronds. Utilisez des ciseaux pour ouvrir le tissu conjonctif. S’il n’y a pas de vaisseaux sanguins, coupez ; s’il y a des vaisseaux sanguins, cautériser et aller de l’avant (figures supplémentaires 2C, D). Lorsqu’il est suffisamment disséqué, utilisez une pince pour passer sous l’artère carotide afin qu’elle soit complètement isolée (figure supplémentaire 2E). Répétez la même opération avec la veine jugulaire (Figure supplémentaire 2F). Lorsque les deux vaisseaux sont complètement disséqués et isolés, placez du fil de suture autour d’eux. Ne les fermez pas encore. Deux sutures autour de la carotide, l’une à la base (suture 1 côté cœur pour la perfusion cérébrale) et l’autre côté (suture 2), sont représentées à la figure supplémentaire 2G. Placez une suture autour de la veine jugulaire (suture 3), non fermée ; Marquez les fils avec du ruban adhésif pour sectionner la veine plus tard. Fermez très fermement la suture 1, sinon elle saignera (Figure supplémentaire 2H). Faites trois nœuds. Placez une pince sur le fil pour mettre du poids et créer une tension dans l’artère carotide. Clamper l’artère carotide à l’aide d’une pince vasculaire du côté opposé de la dissection de l’artère carotide (côté cerveau pour la perfusion cérébrale ; Figure 2I supplémentaire). La suture 2 est au milieu, pas encore fermée. Utilisez une pince noire pour attraper et tirer l’artère carotide. À l’aide de ciseaux fins, sectionner la moitié de l’artère carotide près de la base de la dissection (près de la suture 1, côté cœur ; voir la figure supplémentaire 2J). Assurez-vous que la section est aussi propre que possible et qu’elle atteint le navire lui-même, et pas seulement la « gaine » ; sinon, le cathéter ne passera pas. Insérez le cathéter comme indiqué à la figure supplémentaire 2K. Rincez et remplissez le cathéter, d’abord avec du PBS, afin qu’il n’y ait plus d’air dans le cathéter (encadré supplémentaire de la figure 2K ). Fermez la suture 2 assez fermement pour qu’elle ne disparaisse pas, mais pas trop pour que le cathéter puisse encore bouger un peu (figure supplémentaire 2L). Ensuite, retirez la pince du vaisseau, terminez l’insertion du cathéter aussi loin que possible et finalisez la fermeture de la suture 2 (fermez fermement). Si vous le souhaitez, utilisez des fils de suture à la suture 1 pour fixer la base du cathéter à la peau à la sortie de la plaie comme mesure de sécurité supplémentaire. Ensuite, transférez l’animal dans la zone de perfusion et branchez-le sur le PBS/héparine. Lorsque la perfusion commence, prélevez la suture 3 et coupez la veine jugulaire Euthanasie : Administrer du pentobarbital (90 mg/kg) par voie intraveineuse et rincer la ligne avec une solution saline pour s’assurer que la dose complète est administrée avec succès. Perfusion : À l’aide d’une pompe à perfusion (200 ml/min), brancher le cathéter carotidien dans du PBS/héparine (1 L pour un porc de 15 kg), puis dans du PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA) (5 L pour un porc de 15 kg). Lorsque la perfusion commence, tirez sur la suture 3 et coupez la veine jugulaire. Prélèvement de tissusDécapitation : Lorsque la perfusion est terminée, détachez la tête de l’animal du corps à l’aide d’un scalpel, en coupant la peau et les muscles et en insérant la lame entre la première et la deuxième vertèbre. Postfixation : Plonger la tête dans 4% de PFA dans du PBS pendant encore 48 h à 4 °C, puis transférer dans du PBS avant l’extraction du cerveau. Extraction du cerveau et de l’implant :Retirez la peau à l’aide d’un scalpel et commencez à couper soigneusement l’os à l’aide d’un rongeur en commençant par les premières vertèbres, en suivant la moelle épinière jusqu’au cervelet. Une fois le cervelet exposé, retirez soigneusement les os temporaux et exposez les lobes pariétaux et frontaux. À ce stade, vissez le piédestal du repose-pieds et coupez les pieds du repose-pieds avec une pince. Retirez l’os près de l’entrée du câble dans le crâne pour libérer le système d’implant de l’os, sans retirer les implants de la sortie de la dure-mère. Si les câbles de l’implant sont enfoncés dans l’os, coupez le câble le plus près possible de la sortie. Une fois que la surface du cerveau est suffisamment exposée, coupez soigneusement la dure-mère en suivant la ligne médiane à l’aide de petits ciseaux. Libérez les câbles de l’implant de la sortie de la dure-mère. Prenez des photos de la mise en place de l’implant sur le cerveau. Ensuite, utilisez une petite cuillère pour détacher le cerveau des nerfs crâniens en dessous. Extrayez soigneusement le cerveau. Retirez les implants du cerveau. Postfixation du cerveau : En fonction de la qualité de la perfusion, postfixer à nouveau le cerveau extrait pendant 24 h dans du PFA à 4 % dans du PBS à 4 °C. Conserver dans 0,1 M PBS à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau soit coupé. Coupe cérébrale : Séparez les deux hémisphères à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, coupez le cerveau orthogonalement en quatre morceaux différents. Coupez la zone implantée en deux pour obtenir deux blocs contenant la zone implantée et une zone témoin. Rangez les deux autres blocs si vous avez besoin de plus de diapositives de contrôle. Cryoprotection et congélation du cerveau : Transférer les blocs cérébraux dans une solution contenant d’abord 15 % de saccharose, puis 30 % de saccharose à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau plonge et atteigne l’équilibre. Ensuite, congelez le tissu dans de l’isopentane à -55 °C dans un système de congélation de tissus. 8. Histologie Coupe de tissusCryostat : Placez le cerveau congelé dans un cryostat et coupez-le jusqu’à ce que des sections complètes soient atteintes. Ensuite, coupez le cerveau en sections de 40 μm et plongez-les par groupes de trois dans du PBS de 0,1 M dans des plaques de puits. Notez soigneusement l’ordre des plaques. Sélection des sections : Sélectionnez les sections en fonction de la zone à analyser (région implantée ou zone de contrôle). Retirez les sections séquentiellement des plaques de puits, en utilisant une brosse fine pour les inspecter pour vérifier qu’elles ne sont pas endommagées. Placez-les dans de nouvelles plaques de puits remplies de 0,1 M de PBS pour une coloration supplémentaire. ImmunohistochimiePréparation : Incuber les coupes dans du Triton X/PBS à 0,3 % pendant 15 min, puis dans de l’albumine sérique bovine (BSA)/PBS à 3 % pendant 1 h à température ambiante (RT). Anticorps primaires : Incuber les tissus avec des anticorps primaires pendant 48 h à la RT (anti-GFAP, rat, dilué à 1/300 ; anti-Iba1, lapin, dilué à 1/400 ; anti-NeuN, cobaye, dilué à 1/1 000 ; le tout dans 1 % BSA/PBS). Recouvrez les plaques du puits de papier d’aluminium. Lavage : Lavez les puits avec 0,1 M PBS trois fois pendant 5 min. Anticorps secondaires : Incuber les tissus avec des anticorps secondaires pendant 2 h à RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555 ; tous dilués à 1/400 dans 1 % BSA/PBS). DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) : Incuber les tissus avec du DAPI pendant 15 min (1/1 000 dans 1 % de BSA/PBS). Lavage : Lavez les puits avec 0,1 M PBS cinq fois pendant 15 min. Montage : Montez les diapositives à l’aide d’un support de montage et d’une lamelle. Conservez les lames dans l’obscurité au réfrigérateur à 4 °C. ImagerieImagerie de lames entières : Imagez les lames à un grossissement de 10x (valeur de la distance de travail objective = 3 100 μm) à l’aide d’un microscope scanner de lames à trois longueurs d’onde différentes (640 nm, 560 nm, 485 nm). Toutes les informations sur la puissance et le gain se trouvent dans le fichier supplémentaire 2. Imagerie microscopique : Imagez la région d’intérêt à un grossissement de 20x (apochromat 20x/0,8 M27) à l’aide d’un microscope confocal à quatre longueurs d’onde (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Toutes les informations sur la puissance et le gain se trouvent dans le fichier supplémentaire 3.