Impianto di array di elettrocorticografia morbida subdurale (ECoG) e registrazione corticale a lungo termine nei minipig

Le procedure chirurgiche e comportamentali sono state approvate dal comitato etico locale in conformità con le linee guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e approvate dalle autorità veterinarie locali (Cantone di Ginevra) e federali (Svizzera) con numero di autorizzazione GE11120A. In questo studio sono state utilizzate femmine di maialini di Göttingen (n = 7) di 2-6 mesi di età (5-8 kg). 1. Pianificazione prechirurgica Caratterizzazione in vitro del sistema implantare morbidoCronoamperometria: Registrare la caduta di tensione all’iniezione di un’evoluzione dell’impulso di corrente bifasica (cioè il transitorio di tensione [VT]) utilizzando un oscilloscopio collegato in parallelo a un generatore di impulsi. Collegare il generatore di impulsi in sequenza a ciascun elettrodo e a un contatore di platino in soluzione salina (soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] 1x). Fare riferimento al passaggio 3.1 per le impostazioni. Spettrogramma di impedenza elettrochimica: misura l’impedenza elettrochimica a diverse frequenze utilizzando un potenziometro. Collegare il potenziometro in sequenza a ciascun elettrodo utilizzando il contatore di platino e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl in soluzione salina (PBS 1x). Fare riferimento al passaggio 3.2 per le impostazioni. Resistenza intercanale: nello stato a secco, misurare la resistenza in corrente continua (CC) tra canali adiacenti utilizzando un multimetro portatile. Selezione dell’impianto: Dopo le tre misurazioni sopra citate, selezionare l’impianto con i seguenti criteri: impedenza a 1 kHz inferiore a 100 kΩ e nessuna resistenza intercanale inferiore a 1 MΩ. SterilizzazioneSterilizzazione dell’impianto: Posizionare gli impianti selezionati singolarmente in sacchetti di sterilizzazione insieme a un marcatore di sterilizzazione e sigillarli. Utilizzare un doppio imballaggio per garantire la sterilità durante l’intervento chirurgico.NOTA: In questo caso, viene utilizzata la sterilizzazione con gas a perossido di idrogeno (H 2 O2) a causa del breve ciclo di tempo e della bassa temperatura (55 °C). Le alternative sono il gas di ossido di etilene (ETO) o la sterilizzazione in autoclave, ma deve essere garantita la compatibilità con il sistema implantare. Sterilizzazione degli strumenti: Mettere gli strumenti puliti in doppi sacchetti di sterilizzazione o scatole sterili per strumenti insieme ai marcatori di sterilizzazione. La sterilizzazione in autoclave è più comune per gli strumenti, ma H 2 O2o ETO sono possibili alternative. 2. Impianto chirurgico di matrici morbide di ECoG AnestesiaPremedicazione: Isolare l’animale e digiunarlo durante la notte. Iniettare una miscela di midazolam a 0,75 mg/kg, atropina a 0,25 μg/kg e haldol a 0,1 mg/kg per via intradermica e attendere che l’animale sia sedato. Pesare l’animale prima di procedere. Installazione dell’elettrocatetere endovenoso (IV):Posizionare l’animale sul tavolo operatorio su un termoforo. Indurre l’anestesia posizionando una maschera facciale sull’animale, utilizzando sevoflurano al 3%-3,5%. Posizionare gli elettrocardiogrammi sull’addome, un sensore di saturazione del sangue sulla coda e un sensore di temperatura nella narice. Posizionare un elettrocatetere endovenoso su una vena dell’orecchio e confermare l’accesso al sangue utilizzando una siringa riempita di soluzione fisiologica. Assicurati che gli occhi siano mantenuti idratati usando un unguento. Intubazione: iniettare un bolo di atracurio a 0,5 mg/kg, ketamina a 1 mg/kg e fentanil a 1-2 μg/kg. Posizionare l’animale sulla schiena per l’intubazione. Inserire un tubo da 4,5 mm. Farmaci: Dopo l’intubazione, interrompere l’anestesia con sevoflurano e installare un’infusione di propofol a 10 mg/kg/h, fentanil a 2 μg/kg/h, atracurio a 0,2-0,5 mg/kg/h e soluzione fisiologica a 4-7 mg/kg/h. Iniziare un’infusione di mannitolo a 1 g/kg/h per ridurre il gonfiore cerebrale durante l’intervento.NOTA: Un regime di analgesia multimodale può essere utilizzato se raccomandato dal comitato etico animale locale. Radiografia preoperatoriaPosiziona l’animale sull’addome nella posizione della sfinge. Rimuovere temporaneamente qualsiasi oggetto metallico in prossimità del cervello e del cranio dell’animale (ad esempio, piombo della temperatura nella narice). Acquisire una radiografia del piano assiale e sagittale con un contrasto dell’osso. Posizionare un oggetto metallico di dimensioni note nel campo di acquisizione sagittale che funga da scala per misurare lo spessore del cranio nella parte anteriore e posteriore del cervello. Identificare la posizione dei seni frontali (visibili dai vuoti sotto il cranio) e segnare la posizione più posteriore sulla testa dell’animale utilizzando un pennarello indelebile. Questo indicherà il punto più lontano in cui è possibile eseguire qualsiasi craniotomia o posizionamento di viti nell’approccio chirurgico descritto di seguito. Campo asettico e preparazione della pelle: radere l’intera superficie della testa oltre il campo operatorio. Usando un tampone sterile, strofinare accuratamente la testa con betadine. Successivamente, posizionare teli sterili sul tavolo della strumentazione e sull’animale per rivelare solo la finestra chirurgica. Infine, strofinare nuovamente la testa con un tampone sterile utilizzando betadine. Craniotomia e durotomiaTaglio della pelle: incidi la pelle con un bisturi lungo la linea mediana. Separare il muscolo e il periostio (25 mm lateralmente dal bregma su entrambi i lati e 40 mm anteriormente e posteriormente al bregma) dall’osso utilizzando un raspatore e posizionare i divaricatori per ottenere un accesso ottimale per la successiva perforazione. Misurazioni e marcatura: Identificare bregma e lambda e contrassegnarli con una penna chirurgica sterile (Figura 2A, B). Utilizzando un righello sterile, definire il contorno del lembo osseo centrato attorno al bersaglio dell’impianto su entrambi gli emisferi. In questo caso specifico, è stata scelta la corteccia uditiva, con coordinate da -5 mm a -15 mm dal bregma e da -4 mm a -20 mm lateralmente. Quindi, regolare la craniotomia in base alle dimensioni dell’impianto e ai punti di riferimento anatomici, limitando la dimensione dell’apertura. Craniotomia:Utilizzando un trapano per ossa con una punta da taglio rotonda, praticare il contorno della craniotomia, tenendo conto dello spessore del cranio misurato al punto 2.2. Irrigare il punto di perforazione con soluzione salina per evitare il surriscaldamento dell’osso. Forare con cura il contorno in modo omogeneo fino a raggiungere la dura madre. Alla prima apertura, finisci di forare il contorno fino a quando non si è assottigliato abbastanza da quasi sfondare. Quindi, utilizzare una spatola piatta (sul lato della linea mediana o sul lato laterale) per staccare il lembo osseo in un unico pezzo, usando il bordo della craniotomia come leva. Se si incontra troppa resistenza, continuare ad assottigliare l’osso. Mettere il pezzo di osso in soluzione fisiologica sterile. Una volta rimosso il lembo osseo, scheggiare con cautela il bordo della craniotomia, utilizzando un Kerison per evitare che il bordo osseo affilato tagli la dura madre. Se si riscontra un sanguinamento eccessivo sulla dura madre o sull’osso, utilizzare rispettivamente Gelfoam o cera ossea. Posizionare un impacco umido (tampone standard in soluzione salina sterile) nella craniotomia e ripetere questo passaggio sull’altro emisfero (Figura 2B). Durotomia:Utilizzando l’ago di un kit di sutura 6-0, perforare e sollevare con cautela la dura madre all’estremità anteriore o posteriore della craniotomia a metà strada tra il lato mediale e laterale e creare l’inizio di un’incisione con il coltello da taglio. Quindi, utilizzando una piccola spatola piatta inserita nello spazio subdurale che funge da base di taglio per proteggere la corteccia, creare una fessura anteroposteriore nella dura madre avanzando contemporaneamente con entrambi gli strumenti. Assicurarsi che la fessura sia leggermente più grande della larghezza dell’impianto (Figura 2C). Se si verifica un’emorragia o un danno in questa fase, coprirlo con schiuma di gel e attendere che si fermi.NOTA: La traiettoria della fessura deve essere adattata se sono presenti grandi vasi sanguigni nella dura madre per evitare sanguinamento. ImpiantoInserimento del dispositivo:Irrigare l’impianto (Figura supplementare 1A) con soluzione fisiologica su entrambi i lati in modo che scivoli più facilmente nello spazio subdurale. Posizionare l’impianto sopra la fessura della dura madre e, con una piccola pinza, inserire subduralmente il dispositivo facendolo scorrere in sequenza su ciascun bordo. Tenere con cura l’estremità del piedistallo del dispositivo e avanzare con l’impianto per non creare tensioni che ne impediscano l’inserimento. Quando il bordo del connettore si trova sulla parte superiore della fessura, interrompere l’inserimento. Fissare l’impianto: Per fissare l’impianto in posizione, posizionare un ponte in titanio sul cavo dopo il bordo della craniotomia o nelle alette di ancoraggio e fissarlo con una o due viti in titanio utilizzando l’apposito cacciavite (Figura 2D). Posizionamento a terra: rimuovere con cautela 1 cm di isolamento dei fili di terra e inserirlo epidurale all’estremità posteriore della craniotomia (o in qualsiasi posizione epidurale lontana dalla corteccia di interesse o dai grandi vasi sanguigni) (filo nella Figura 2E) Ripetere i passaggi 2.4.4. e 2.5.1.-2.5.3 sull’emisfero controlaterale. Radiografia intraoperatoria per confermare il posizionamento:Posizionare un tampone umido (tampone standard in soluzione salina sterile) sul luogo dell’intervento chirurgico per mantenere il tessuto idratato. Successivamente, posiziona un telo chirurgico sterile per coprire la testa dell’animale. Eseguire immagini radiografiche piane (assiali e sagittali) per assicurarsi che gli impianti siano ben posizionati e non piegati, utilizzando i marcatori radiografici come indicatori. In caso contrario, rimuovere il telo ed espiantare il dispositivo per inserirlo nuovamente (seguire nuovamente i passaggi 2.4.4. e 2.5.1.-2.5.3). Chiusura della dura madre: suturare con cura la dura madre attorno al cavo dell’impianto utilizzando una sutura riassorbibile 3-0 e un piccolo portaaghi. Avvicinare il più possibile i due bordi della dura madre senza strappare la sottile membrana con il filo di sutura (Figura 2D, E). Posizionamento del lembo osseo: fissare un ponte in titanio sulla parte anteriore e posteriore di ciascun lembo osseo utilizzando una vite in titanio. Fare attenzione a pianificare il posizionamento dei ponti a Ti rispetto al posizionamento delle gambe della pedana nei passaggi successivi. Avvitare l’estremità dei ponti in titanio al cranio (Figura 2F, G). Posizionamento del piedistallo e della pedanaPosizionamento: In questa configurazione, la pedana ha sei gambe con due fori per le viti ciascuna (Figura supplementare 1B). Pianificare il posizionamento della pedana sul cranio per ottimizzare la posizione delle viti (evitare di posizionarle sul bordo della craniotomia o nel muscolo temporale). Salta i fori nelle gambe se non possono essere avvitati. Fissaggio della pedana: Avvitare le viti in titanio della pedana finché non è saldamente in posizione (vedere la Figura 2H). Posizionamento del piedistallo: rimuovere i ponti in titanio sui cavi di collegamento e capovolgere il piedistallo per atterrare sulla pedana. Avvitare il piedistallo sulla pedana. Verificare che il piedistallo sia saldamente in posizione (Figura 2I). Sutura e chiusuraPulizia della ferita: pulire lo spazio sottocutaneo da eventuali ossa o altri detriti sciacquando con soluzione fisiologica. Taglia via un po’ di pelle intorno ai bordi del piedistallo per creare un bordo arrotondato che segua il cilindro. Suture sottocutanee: rimuovere i divaricatori e piegare insieme i lembi cutanei. Crea suture sottocutanee con un filo di sutura 4-0 non riassorbibile, a 3 mm di distanza l’una dall’altra, utilizzando semplici suture interrotte o semplici suture continue. Inizia lontano dal piedistallo, muovendoti verso di esso su entrambi i lati dell’incisione. Suture dermiche: suturare la pelle utilizzando un filo di sutura 6-0 non riassorbibile, con punti di sutura distanti 5 mm. Inizia lontano dal piedistallo, muovendoti verso di esso su entrambi i lati dell’incisione. Fare attenzione a ottenere una buona apposizione del tessuto tra i due lembi cutanei e vicino al bordo del piedistallo per evitare un vuoto (Figura 2J). Medicazione della ferita: pulire nuovamente l’area della ferita con un tampone sterile e betadine. Applicare una benda sterile autoadesiva sulla ferita. Misurazioni in vivo: Per le misurazioni in vivo , seguire le sezioni 3, 4 e 5. Risveglio: Dopo aver eseguito tutte le misurazioni, togliere all’animale tutti gli anestetici ma tenerlo sotto ventilazione. Per l’analgesia, applicare un cerotto a base di buprenorfina (25 mg/h) per 24 ore. Posiziona l’animale su un termoforo coperto da tende per accelerare l’orario di sveglia. Quando viene recuperata la respirazione spontanea, estubare l’animale e metterlo sotto una maschera facciale di ossigeno fino a quando non viene ripreso conoscenza (che può richiedere da 1 a 4 ore). Cura dell’animale dopo l’intervento: per 5 giorni, tenere l’animale sotto stretta sorveglianza. Somministrare una dose di cefalexina alla dose di 75 mg due volte al giorno con il cibo, separatamente dagli altri animali. Effettuare quotidianamente la disinfezione della ferita applicando abbondanti quantità di betadine con tamponi sterili imbevuti (meglio durante l’alimentazione).NOTA: Assistenza a lungo termine e stabulazione: l’animale operato viene tenuto isolato per 24 ore. Viene reinserito nel suo gruppo sociale originario se l’animale sta abbastanza bene da interagire socialmente con i suoi simili. È necessario condurre un’osservazione quotidiana del piedistallo e dell’apertura della pelle per seguire l’integrazione del dispositivo sulla testa. Quando appropriato, pulire la posizione intorno al piedistallo con abbondanti quantità di betadine. 3. Caratterizzazione in vivo dell’impianto soft Cronoamperometria: Registra la caduta di tensione all’iniezione di un’evoluzione dell’impulso di corrente bifasica (cioè il VT) utilizzando un oscilloscopio collegato in parallelo a un generatore di impulsi. Collegare il generatore di impulsi in sequenza a ciascun elettrodo e al filo di terra. Eseguire l’impulso di stimolazione a 100 μA con un’ampiezza dell’impulso di 300 μs a 100 Hz. Spettroscopia di impedenza elettrochimica: misura l’impedenza elettrochimica a diverse frequenze utilizzando un potenziometro. Collegare il generatore di impulsi in sequenza a ciascun elettrodo, utilizzando il filo di terra sia come controelettrodo che come massa. Impostare la tensione di eccitazione a 200 mV e l’intervallo di frequenza da 1 Hz a 1 MHz, con tre punti per decennio. Brevi misurazioni intercanale: misurare la resistenza CC tra canali adiacenti utilizzando un multimetro portatile. In vivo, la resistenza c.c. intercanale viene misurata solo per verificare che non si verifichino carenze inferiori a 1 kΩ, indicando un fallimento totale dell’incapsulamento. 4. Registrazione elettrofisiologica Attività spontanea: collegare il sistema di registrazione wireless attraverso il piedistallo e registrare l’attività di base per 2-3 minuti. Queste registrazioni serviranno come controllo per analizzare i potenziali evocati uditivi. Potenziali evocati uditivi: oltre al sistema wireless, inserire gli altoparlanti in un campo chiuso nelle orecchie degli animali. Riproduci la stimolazione acustica a raffica di toni a diverse frequenze (comprese tra 200 e 20.000 Hz) a un livello di pressione sonora (SPL) di circa 70 dB su 120 ripetizioni. Quindi, calcola la media delle registrazioni e allineale sul periodo di stimolo per l’analisi. Potenziali evocati sensoriali: Posizionare gli aghi nel muso in tre posizioni diverse. Evocare potenziali sensoriali stimolando il muso per ~30 s con il generatore di impulsi a diverse ampiezze per ottenere le curve di reclutamento. 5. Imaging in vivo Trasporto dell’animale: Tenere l’animale sotto anestesia con propofol, come descritto al punto 2.1. Utilizzare un carrello di trasporto che ospita un ventilatore, una pompa a siringa e un monitor dei segni vitali per trasportare l’animale dalla sala operatoria alle strutture di imaging e viceversa. Tomografia computerizzata a raggi X: posizionare l’animale sul tavolo dello scanner e rimuovere qualsiasi oggetto metallico intorno alla testa (ad es. il sensore di temperatura). Acquisisci una TAC alla risoluzione più piccola (0,4 mm di spessore della fetta) utilizzando l’acquisizione isometrica con selezione automatica di corrente e tensione per il contrasto osseo. Risonanza magnetica: rimuovere tutte le apparecchiature contenenti metallo dall’animale (utilizzare elettrocateteri per flebo e tubo di intubazione compatibili con la risonanza magnetica). Mantenere l’animale ventilato e anestetizzato sotto sevoflurano al 3%-3,5%, utilizzando un ventilatore situato all’esterno della camera di risonanza magnetica e collegato all’animale attraverso un lungo tubo. Prima della prima sequenza, iniettare un bolo di fentanil a 1-2 μg/kg. Utilizzare tre sequenze isometriche alla risoluzione più piccola: sequenze pesate in T1, T2 e turbo spin echo (TSE) (parametri mostrati nel file supplementare 1). 6. Registrazione in movimento libero Seguire la stessa procedura descritta nel paragrafo 4 per registrare i segnali di veglia provenienti dal cervello. Collega l’headstage wireless tenendo l’animale tra le braccia dello sperimentatore o nutrendolo con dolcetti per distrarlo. Fornire la stimolazione acustica utilizzando altoparlanti esterni posti vicino all’animale. 7. Perfusione e preparazione dei tessuti FACOLTATIVO: Se l’animale non è già sotto anestesia, seguire il passaggio 2.1 per il protocollo di anestesia. Inserimento di un catetere nell’arteria carotide per la perfusione (Figura 2 supplementare)Dissezione dell’arteria carotide e della vena giugulare: tagliare la gola sulla linea mediana utilizzando un cauterizzatore/taglierino. Tagliare prima la pelle e poi il muscolo seguendo la linea bianca centrale (senza vasi sotto) (Figura supplementare 2A). Aprire ulteriormente, usando le dita per fare spazio intorno alla trachea e sotto il muscolo. Cerca l’arteria carotide (battente e rosata); A volte anche il nervo vagale è intorno (bianco) e la vena giugulare può essere sotto o di lato (rossa). Posizionare gli spandiconcime (vedere la Figura 2B supplementare). Iniziare la dissezione dell’arteria carotide utilizzando pinze sottili e forbici rotonde. Usa le forbici per aprire il tessuto congiuntivo. Se non ci sono vasi sanguigni, tagliare; se ci sono vasi sanguigni, cauterizzare e andare avanti (Figura supplementare 2C, D). Una volta sezionata a sufficienza, utilizzare una pinza per passare sotto l’arteria carotide in modo che sia completamente isolata (Figura 2E supplementare). Ripetere la stessa operazione con la vena giugulare (Figura 2F supplementare). Quando entrambi i vasi sono completamente sezionati e isolati, posizionare il filo di sutura attorno ad essi. Non chiuderli ancora. Due punti di sutura intorno alla carotide, uno alla base (sutura 1-lato cuore per la perfusione cerebrale) e uno sull’altro lato (sutura 2), sono mostrati nella Figura 2G supplementare. Posizionare una sutura attorno alla vena giugulare (sutura 3), non chiusa; Contrassegnare i fili con del nastro adesivo per sezionare la vena in un secondo momento. Chiudere la sutura 1 molto saldamente, altrimenti sanguinerà (Figura supplementare 2H). Fai tre nodi. Posiziona un morsetto sul filo per mettere peso e creare tensione nell’arteria carotide. Clamp l’arteria carotide utilizzando una pinza vascolare sul lato opposto della dissezione dell’arteria carotide (lato cervello per la perfusione cerebrale; Figura 2I supplementare). La sutura 2 è al centro, non ancora chiusa. Usa una pinza nera per afferrare e tirare l’arteria carotide. Usando delle forbici sottili, sezionare metà dell’arteria carotide vicino alla base della dissezione (vicino alla sutura 1, lato cuore; vedere la Figura 2J supplementare). Assicurarsi che la sezione sia il più ordinata possibile e raggiunga l’imbarcazione stessa, non solo la “guaina”; in caso contrario, il catetere non passerà. Inserire il catetere come mostrato nella Figura supplementare 2K. Sciacquare e riempire il catetere, prima con PBS, in modo che non rimanga aria nel catetere (riquadro della Figura 2K supplementare ). Chiudere la sutura 2 con sufficiente fermezza in modo che non scompaia, ma non troppo in modo che il catetere possa ancora muoversi un po’ (Figura supplementare 2L). Quindi, rimuovere il morsetto vascolare, completare l’inserimento del catetere il più possibile e finalizzare la chiusura della sutura 2 (chiudere saldamente). Se lo si desidera, utilizzare i fili di sutura in corrispondenza della sutura 1 per fissare la base del catetere alla pelle all’uscita della ferita come ulteriore misura di sicurezza. Quindi, trasferisci l’animale nella zona di perfusione e collegalo al PBS/eparina. Quando inizia la perfusione, tirare la sutura 3 e tagliare la vena giugulare Eutanasia: somministrare pentobarbital (90 mg/kg) per via endovenosa e lavare la linea con soluzione fisiologica per garantire che l’intera dose venga somministrata con successo. Perfusione: Utilizzando una pompa di perfusione (200 mL/min) collegare il catetere carotideo al PBS/eparina (1 L per un suino di 15 kg) e poi al PBS contenente il 4% di paraformaldeide (PFA) (5 L per un suino di 15 kg). Quando inizia la perfusione, tirare la sutura 3 e tagliare la vena giugulare. Raccolta di tessutiDecapitazione: Terminata la perfusione, staccare la testa dell’animale dal corpo con un bisturi, tagliando la pelle e il muscolo e inserendo la lama tra la prima e la seconda vertebra. Postfissazione: immergere la testa in PFA al 4% in PBS per altre 48 ore a 4 °C e poi trasferire in PBS prima dell’estrazione cerebrale. Estrazione del cervello e dell’impianto:Rimuovere la pelle con un bisturi e iniziare a tagliare con cura l’osso utilizzando un rongeur partendo dalle prime vertebre, seguendo il midollo spinale fino al cervelletto. Una volta che il cervelletto è esposto, rimuovere con cura le ossa temporali ed esporre i lobi parietali e frontali. A questo punto, svitare il piedistallo dalla pedana e tagliare i piedini della pedana con una pinza. Rimuovere l’osso vicino all’ingresso del cavo nel cranio per liberare il sistema implantare dall’osso, senza estrarre gli impianti dall’uscita della dura madre. Se i cavi dell’impianto sono incorporati nell’osso, tagliare il cavo il più vicino possibile all’uscita. Una volta che la superficie cerebrale è sufficientemente esposta, taglia con cura la dura seguendo la linea mediana usando piccole forbici. Liberare i cavi dell’impianto dall’uscita della dura madre. Scatta fotografie dal posizionamento dell’impianto sul cervello. Quindi, usa un cucchiaino per staccare il cervello dai nervi cranici sottostanti. Estrai con cura il cervello. Rimuovere gli impianti dal cervello. Postfissazione del cervello: A seconda della qualità della perfusione, postfissare nuovamente il cervello estratto per 24 ore in PFA al 4% in PBS a 4 °C. Tenere in PBS 0,1 M a 4 °C fino a quando il cervello non viene tagliato. Taglio del cervello: separare i due emisferi usando una lametta da barba. Quindi, taglia il cervello ortogonalmente in quattro pezzi diversi. Tagliare a metà la zona impiantata per ottenere due blocchi contenenti la zona impiantata e un’area di controllo. Conservare gli altri due blocchi se sono necessari più vetrini di controllo. Crioprotezione cerebrale e congelamento: trasferire i blocchi cerebrali in una soluzione di saccarosio prima al 15% e poi al 30% di saccarosio a 4 °C fino a quando il cervello si immerge e raggiunge l’equilibrio. Quindi, congelare il tessuto in isopentano a -55 °C in un sistema di congelamento dei tessuti. 8. Istologia Sezionamento dei tessutiCriostato: Posizionare il cervello congelato in un criostato e tagliare fino a ottenere sezioni complete. Quindi, tagliare il cervello in sezioni di 40 μm e immergerlo in gruppi di tre in PBS da 0,1 M in piastre a pozzetti. Annotare attentamente l’ordine delle piastre. Selezione delle sezioni: selezionare le sezioni in base alla zona da analizzare (regione impiantata o zona di controllo). Estrarre le sezioni in sequenza dalle piastre dei pozzetti, utilizzando una spazzola fine per ispezionarle per verificare che non siano danneggiate. Metterli in nuove piastre a pozzetti riempite con PBS da 0,1 M per un’ulteriore colorazione. ImmunoistochimicaPreparazione: Incubare le sezioni in Triton X/PBS allo 0,3% per 15 minuti, seguito da albumina sierica bovina (BSA)/PBS al 3% per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Anticorpi primari: incubare i tessuti con anticorpi primari per 48 ore a RT (anti-GFAP, ratto, diluito a 1/300; anti Iba1, coniglio, diluito a 1/400; anti-NeuN, cavia, diluito a 1/1.000; tutti in BSA/PBS all’1%). Coprire le piastre del pozzetto con un foglio di alluminio. Lavaggio: Lavare i pozzetti con PBS 0,1 M tre volte per 5 min. Anticorpi secondari: incubare i tessuti con anticorpi secondari per 2 ore a RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; tutti diluiti a 1/400 in 1% BSA/PBS). DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo): Incubare i tessuti con DAPI per 15 minuti (1/1.000 in 1% BSA/PBS). Lavaggio: lavare i pozzetti con PBS 0,1 M cinque volte per 15 min. Montaggio: Montare le guide utilizzando un supporto di montaggio e un vetrino coprioggetti. Conservare i vetrini al buio in frigorifero a 4 °C. ImagingImaging dell’intero vetrino: Immagine dei vetrini con un ingrandimento 10x (valore della distanza di lavoro oggettiva = 3.100 μm) utilizzando un microscopio scanner per vetrini a tre diverse lunghezze d’onda (640 nm, 560 nm, 485 nm). Tutte le informazioni sulla potenza e sul guadagno sono disponibili nel file supplementare 2. Imaging microscopico: Immagine della regione di interesse con un ingrandimento di 20x (apocromatico 20x/0,8 M27) utilizzando un microscopio confocale a quattro lunghezze d’onda (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Tutte le informazioni sulla potenza e sul guadagno sono disponibili nel file supplementare 3.