Subdurale weiche Elektrokortikographie (ECoG) Array-Implantation und Langzeit-Kortikalableitung bei Minischweinen
Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur langfristigen Leistungs- und Sicherheitsbewertung von weichen subduralen Elektrodenarrays in einem Minipig-Modell vor, die chirurgische Methoden und Werkzeuge, postoperative Magnetresonanztomographie, Elektrophysiologie des auditorischen Kortex, elektrochemische Eigenschaften des Implantats und postmortale Immunchemie beschreibt.
Abstract
Neurologische Beeinträchtigungen und Erkrankungen können mit Hilfe der Elektrokortikographie (ECoG) diagnostiziert oder behandelt werden. Bei medikamentenresistenter Epilepsie helfen diese bei der Abgrenzung der epileptischen Region, die reseziert werden soll. In Langzeitanwendungen wie Gehirn-Computer-Schnittstellen werden diese epikortikalen Elektroden verwendet, um die Bewegungsabsicht des Gehirns aufzuzeichnen, um die Robotergliedmaßen von gelähmten Patienten zu steuern. Derzeitige steife Elektrodengitter erfüllen jedoch nicht den Bedarf an hochauflösenden Gehirnaufzeichnungen und langfristiger Biointegration. In jüngster Zeit wurden anpassungsfähige Elektrodenarrays vorgeschlagen, um eine langfristige Implantatstabilität bei hoher Leistung zu erreichen. Präklinische Studien für diese neuen Implantattechnologien sind jedoch erforderlich, um ihre langfristige Funktionalität und ihr Sicherheitsprofil für ihre Übertragung auf menschliche Patienten zu validieren. In diesem Zusammenhang werden Schweinemodelle aufgrund ihrer großen Organgröße und der einfachen Handhabung von Tieren routinemäßig bei der Entwicklung von Medizinprodukten eingesetzt. In der Literatur werden jedoch nur wenige Anwendungen für das Gehirn beschrieben, meist aufgrund von chirurgischen Einschränkungen und der Integration des Implantatsystems am lebenden Tier.
Hier berichten wir über die Methode zur Langzeitimplantation (6 Monate) und Evaluierung von weichen ECoG-Arrays im Minipig-Modell. In der Studie wird zunächst das Implantatsystem vorgestellt, das aus einem weichen, mikrofabrizierten Elektrodenarray besteht, das in einen mit Magnetresonanztomographie (MRT) kompatiblen transdermalen Polymerport integriert ist, der Instrumentierungsanschlüsse für elektrophysiologische Aufzeichnungen enthält. Anschließend beschreibt die Studie den chirurgischen Eingriff, von der subduralen Implantation bis zur Genesung des Tieres. Wir konzentrieren uns auf den auditorischen Kortex als beispielhaftes Zielgebiet, in dem evozierte Potentiale durch akustische Stimulation induziert werden. Schließlich beschreiben wir eine Datenerfassungssequenz, die MRT des gesamten Gehirns, elektrochemische Charakterisierung von Implantaten, intraoperative und sich frei bewegende Elektrophysiologie und immunhistochemische Färbung der extrahierten Gehirne umfasst.
Dieses Modell kann verwendet werden, um die Sicherheit und Funktion eines neuartigen Designs kortikaler Prothesen zu untersuchen. obligatorische präklinische Studie, um eine Translation auf menschliche Patienten zu ermöglichen.
Introduction
Neurologische Beeinträchtigungen und Erkrankungen können mit Hilfe der Elektrokortikographie (ECoG) diagnostiziert oder behandelt werden. Diese Elektrodengitter werden an der Oberfläche des Gehirns implantiert und ermöglichen die Aufzeichnung oder Stimulation des menschlichen Kortex1. Bei medikamentenresistenter Epilepsie helfen sie beispielsweise, die epileptische Region abzugrenzen, um2 zu resezieren. In Langzeitanwendungen wie Gehirn-Computer-Schnittstellen werden diese epikortikalen Elektroden verwendet, um die Bewegungsabsicht des Gehirns aufzuzeichnen, um die Robotergliedmaßen von gelähmten Patienten zu steuern3. Derzeitige Elektrodengitter bestehen jedoch aus steifen Metallblöcken, die in starre polymere Substrate eingebettet sind, und erfüllen nicht den Bedarf an hochauflösenden Gehirnaufzeichnungen und langfristiger subduraler Biointegration (>30 Tage). Vielmehr erzeugen sie lokale Gewebereaktionen, die zu einer fibrotischen Verkapselung des implantierten Geräts führen, was im Laufe der Zeit zu einer schlechteren Leistung führt. In jüngster Zeit wurden flexible oder dehnbare Elektrodenarrays unter Verwendung dünner polymerer Substrate, die durch Mikrofabrikationstechniken hergestellt werden, vorgeschlagen, um eine hohe Leistung bei Langzeitimplantationen zu erzielen, indem sie die Gewebereaktion begrenzen 4,5. Präklinische Studien für diese neuen Implantattechnologien sind jedoch erforderlich, um ihre langfristige Funktionalität und ihr Sicherheitsprofil zu validieren, so dass eine Übertragung auf menschliche Patienten in Betracht gezogen werden kann. In diesem Zusammenhang werden Minischwein- und Schweinemodelle aufgrund ihrer großen Organgröße und der einfachen Handhabung von Tieren routinemäßig bei der Entwicklung von Geräten in anderen medizinischen Kontexten (z. B. im Herz-Kreislauf-, Skelett- oder Magensystem) eingesetzt 6,7,8. In der Literatur werden jedoch nur wenige Anwendungen beschrieben, die auf das Gehirn für die Neurophysiologie abzielen, hauptsächlich aufgrund von Einschränkungen des chirurgischen Zugangs und der Integration des Implantatsystems an einem lebenden Tier 9,10,11,12. Diese sind oft nicht mit der chronischen Implantation bei lebenden Tieren vereinbar, da sie beispielsweise die Entwicklung komplexer Hardware wie implantierbarer eingebetteter Elektronik erfordern würden. Darüber hinaus untersuchen sie nicht den Einfluss des Implantatsystems auf das Zielgewebe, der für den Aspekt der Biosicherheit in translationalen Studien entscheidend ist. Das Schweinemodell kommt der menschlichen Anatomie in Bezug auf kortikale Struktur, Schädelknochen und Hautdicke nahe13. Darüber hinaus macht ihre Fähigkeit, Verhaltensaufgaben zu erlernen, sie zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung funktioneller Rehabilitationsstrategien oder sensorischer Wahrnehmungen14.
Die Übertragung neuer Technologien und Therapien auf den Menschen erfordert eine Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit, wie sie von den zuständigen medizinischen Behörden gefordert wird. Diese werden in der Regel in technischen Dokumenten und Normen15 beschrieben, erfordern jedoch nur das Bestehen dieser Tests und untersuchen nicht die tatsächliche Wirkung der Implantation des Produkts oder die Erhebung anderer nützlicher Daten parallel zur Sicherheitsstudie. Für eine vollständige Biosicherheits- und Leistungsstudie am Gehirn präsentieren wir hier eine longitudinale und systematische Sammlung von Bildgebungsdaten des Gehirns, elektrophysiologische Messungen, die Beurteilung der elektrochemischen Eigenschaften der implantierten Elektroden und die postmortale Histologie in einem Schweinemodell. Um dies zu erreichen, müssen mehrere Aspekte berücksichtigt werden, um ein vollständiges experimentelles Modell zu erstellen: (i) minimalinvasiver chirurgischer Zugang für die Implantation zusammen mit einem mechanisch stabilen transdermalen Port zur Verbindung mit den Elektroden, (ii) ein robustes elektrophysiologisches Aufzeichnungsparadigma, das als Leistungsabgabe für die implantierten Elektroden sowohl unter Anästhesie als auch unter frei beweglichen Bedingungen dient, (iii) In-vivo-Bildgebung (Computertomographie [CT] und/oder Magnetresonanztomographie [MRT]) zu verschiedenen Zeitpunkten, um die Entwicklung des Gehirns und des Implantats sowie die Kompatibilität des implantierten Systems mit den Bildgebungsgeräten zu verfolgen, und (iv) eine Gewebevorbereitungspipeline zur Entnahme des Gehirns für die histologische Analyse.
Hier berichten wir über die Methode zur Langzeitimplantation (6 Monate) und Evaluierung von weichen ECoG-Arrays im Minipig-Modell (schematisch dargestellt in Abbildung 1). Die weichen Elektrodenarrays, die in unseren früheren Berichten vorgestellt wurden, bestehen aus dünnen Silikonmembranen, die elastische Golddünnschichten einbetten, die als elektrische Spuren verwendet werden16,17. Der Kontakt mit dem Gewebe erfolgt durch eine Mischung aus Platinnanopartikeln, die in eine Silikonmatrix eingebettet sind, um eine weiche und effiziente elektrochemische Schnittstelle zum Gehirngewebe zu schaffen18. Die Implantate werden über ein flexibles Kabel, das subdural durch den Schädel und die Haut getunnelt wird, mit einem transdermalen Port verbunden, der die Konnektoren am Kopf des Tieres beherbergt. Die Größe und Form des Implantats kann je nach Ziel und den Bedürfnissen der Studie angepasst werden. Die aktuellen Elektrodenstreifen in dieser Studie spiegeln die tatsächliche Größe der klinischen Streifen wider. Klinisch verfügbare subdurale Streifen und Gitter wurden mit dem gleichen Ansatz als Komparatoren verwendet. Der polymere MRT-kompatible transdermale Port wird mit einem Fußplattensystem auf dem Schädel platziert, das ihn fest im Schädel verankert. Hier beschreiben wir detailliert den chirurgischen Eingriff, von der subduralen Implantation beider Hemisphären bis zur Genesung des Tieres. Wir konzentrieren uns auf den auditorischen Kortex als beispielhaftes Zielgebiet, in dem evozierte Potentiale durch akustische Stimulation sowohl in anästhesierten als auch in frei beweglichen Bedingungen induziert werden. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird das Gehirn des Tieres im MRT (oder CT für die klinischen Elektroden) unter Narkose abgebildet und die elektrochemischen Eigenschaften der Elektroden gemessen. Methoden zur Elektrodencharakterisierung werden verwendet, um die Entwicklung des Implantats und der Elektroden-Gewebe-Schnittstelle zu verfolgen (siehe Schiavone et al.19 für weitere Details). Dazu gehören die Chronoamperometrie zur Untersuchung der Stimulationsfähigkeiten des Elektrodenkontakts, die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS), die die Entwicklung der resistiven und kapazitiven Komponenten der Elektrode anzeigen kann, und die Widerstandsmessungen zwischen den Kanälen, um hermetische Verkapselungsfehler zu untersuchen. Schließlich haben wir eine Gewebeextraktionspipeline entwickelt, um das Gehirn nach der Euthanasie zu perfundieren, es mit den Elektroden zu explantieren, es zu schneiden und eine histologische Analyse mit verschiedenen Entzündungsmarkern durchzuführen. Insgesamt wird diese Methode präklinische Studien mit robuster multimodaler Datenerfassung für die zukünftige klinische Translation neuer Technologien und Therapien im Gehirn ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichten hier über eine Methode zur Langzeitimplantation und Evaluierung von weichen ECoG-Arrays. In dieser Studie haben wir einen konsistenten, minimal-invasiven chirurgischen Ansatz für die bilaterale Implantation von funktionellen Elektrodengittern über den Temporallappen (hier auf den auditorischen Kortex abzielend) entwickelt. Wir evaluierten zunächst die Funktionalität des Gitters, indem wir die evozierten Potentiale über den Zeitraum der Studie (6 Monate) erfolgreich aufzeichneten und die elektrochemischen Eigenschaften der Elektroden verfolgten (siehe Abbildung 6). Zweitens bewerteten wir die Biosicherheit der Gitter, in vivo durch MRT und die Etablierung eines vollständig MRT-kompatiblen Systems und postmortal durch die Entwicklung eines Protokolls für die Gewebeentnahme und Immunfärbung.
Um die Invasivität zu minimieren, haben wir die Größe des Kraniotomiefensters optimiert. Um den auditorischen Kortex im Temporallappen zu erreichen und eine Resektion des Schläfenmuskels zu vermeiden, haben wir eine Technik entwickelt, bei der das Implantat unter die Dura geschoben wird. Diese Technik ermöglicht es, die Oberfläche des exponierten Gehirns drastisch zu verkleinern und dennoch weit entfernte Ziele zu erreichen. Während diese Art der Implantation blind erscheinen mag, ermöglicht die Implementierung von röntgendichten Markern auf den Geräten, die im Röntgenbild der intraoperativen Ebene visualisiert werden, die Überprüfung der Positionierung und stellt sicher, dass das Array nicht unter die Dura mater gefaltet wird. Das subdurale Gleiten hat sich bei den meisten Wiederholungen, die wir durchgeführt haben, als sicher erwiesen. Darüber hinaus minimiert die Durotomie in einem Schlitzzugang die Vorwölbung des Gehirns während der Zeit, in der die Kraniotomie geöffnet ist, und erleichtert den Verschluss um das Implantat herum, ohne dass zusätzliches Material wie künstliche Dura mater erforderlich ist, die die Entzündungsreaktion verzerren könnten. Schließlich liegt die Stärke dieses chirurgischen Ansatzes in seiner Fähigkeit, auf verschiedene kortikale Regionen übertragen zu werden. Das Spiel mit Koordinaten, der Kraniotomieposition und der Gerätegröße, die alle angepasst werden können, ermöglicht es dieser Methode, den größten Teil des Kortexbereichs anzuvisieren.
Die hier vorgestellte Operationsmethode, zusammen mit der funktionellen Bewertung und der Untersuchung der Biointegration über die Zeit, ist nicht auf die in diesem Bericht verwendete Softelektrodentechnologie beschränkt. Andere subdurale Elektroden, die für die menschliche Translation entwickelt werden, könnten mit dem gleichen Protokoll ausgewertet werden. Die Stärke dieser Methode beruht auf der Tatsache, dass die meisten Teile, wie z. B. das Kabel und der Sockel, modular und personalisierbar sind und an das jeweilige Prüfgerät angepasst werden können. Darüber hinaus können auch intrakortikale oder tief eindringende Sonden anstelle oder in Kombination mit den subduralen Elektroden verwendet werden, da hierfür nur die Kraniotomie- und Durotomiegeometrie angepasst werden muss. Die Langzeitergebnisse können dann mit ihren klinischen Pendants verglichen werden, wie wir es hier getan haben.
Eine der Haupteinschränkungen der vorgestellten Methode ist das Vorhandensein von Schädelhöhlen bei Minischweinen, die sich im Laufe des ersten Lebensjahres entwickeln12. Wichtige Aspekte, die in diesem Zusammenhang zu berücksichtigen sind, sind das Alter der Einnistung und auch die Größe des Tieres. Die Durchführung von Kraniotomien im Schädel eines Erwachsenen zerstört die Integrität der Nasennebenhöhlen und führt zu einem hohen Risiko für schwere Infektionen in chronischen Situationen. Solche Nasennebenhöhlen sind präoperativ im ebenen Röntgen- und CT-Scan sichtbar. Auf der anderen Seite ist eine zu frühe chronische Implantation bei einem zu kleinen Tier auch nicht optimal, wenn der Schädel massiv wächst und umgebaut wird. Wir stellten die Hypothese auf, dass diese “Schädelbewegungen” nach der Operation dazu führen könnten, dass sich das Implantat bewegt und faltet, was letztendlich für das Experiment nachteilig ist. Wir haben hier festgestellt, dass Göttinger Minischweine, die zum Zeitpunkt der Implantation etwa 5-6 Monate alt (und 8 kg) sind, die besten Ergebnisse liefern sollten.
Um die Leistung des implantierten ECoG für elektrophysiologische Aufzeichnungen zu bewerten, haben wir ein Schnellprotokoll für die Aufzeichnung des auditiv evozierten Potentials (AEP) erstellt, das bei sich frei bewegenden Tieren und unter Sedierung verwendet werden kann. Es besteht darin, eine Reihe von akustischen Tonausbrüchen bei bestimmten Frequenzen im Laufe einiger Minuten zu präsentieren. Der Vorteil eines solchen Protokolls besteht darin, dass es auf die verfügbare Aufnahmelänge abgestimmt werden kann, indem die Anzahl der abgetasteten Frequenzen reduziert wird. Eine Herausforderung bei der Aufzeichnung kortikaler Signale unter Narkose besteht darin, dass bei der Analyse und dem Vergleich der Daten der Bewusstseinszustand des Tieres berücksichtigt werden sollte.
Das Protokoll für die Perfusion wurde im Laufe der Zeit durch Beobachtung der Qualität des extrahierten Gehirns angepasst. In der Tat fanden wir es einfacher, nur die Halsschlagader und nicht die Halsschlagader zu katheterisieren. In der Literatur werden zunächst Methoden vorgestellt, bei denen die Halsvene katheterisiert wird, um Abfall abzuleiten20. In der Praxis schränkt dies den Abfluss aus dem Gehirn ein und führt zu einer schlechteren Blutentnahme und einer schlechteren Durchblutungsqualität. Durch das Durchtrennen der Halsschlagader und das Entweichen der Flüssigkeit in einem großen Behälter, in dem das Tier liegt, erhöht sich die Effizienz der Durchblutung.
Wir haben eine robuste Methode zur Gewebepräparation entwickelt, die mit Antikörpern arbeitet, die routinemäßig zur Entzündungsverfolgung verwendet werden. Wir haben die beiden Hemisphären aus praktischen Gründen getrennt, da die Hälfte des Schweinegehirns auf Standard-Objektträger passt und somit mit den meisten bildgebenden Geräten kompatibel ist, die in histologischen Labors erhältlich sind. Durch das Schneiden des Gehirns in Blöcke wird ein direkter Zugang zur interessierenden Zone ermöglicht, ohne dass das gesamte Gehirn weiter durchtrennt oder große Teile des Gewebes gekürzt werden müssen. Die Gehirnschnitte bei 40 μm können in Standard-Well-Platten gepoolt und frei schwebend gefärbt werden, ohne dass sich das Protokoll durch die Immunfärbungen anderer Spezies grundlegend ändert. Eine vollständige Immunfärbung des Gehirns könnte auch durch die Verwendung von z. B. CLARITY-Methoden21 in Betracht gezogen werden.
Insgesamt ist dieses Protokoll, das das personalisierte Implantatdesign bis hin zur Implantation, der Funktionsüberwachung und der Bewertung der biologischen Sicherheit abdeckt, robust und konsistent. Wir haben hier gezeigt, dass es möglich ist, das auditorische System zu untersuchen, aber es kann auch auf andere physiologische Funktionen übertragen werden. Darüber hinaus liegt die Stärke unserer Methode in der Tatsache, dass sie nicht auf Minischweine beschränkt ist, sondern vollständig auf andere Arten wie Schafe, Ziegen oder nichtmenschliche Primaten übertragbar ist. Bis zu einem gewissen Grad lässt es sich auch leicht an Ratten anpassen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autorinnen und Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch die Bertarelli-Stiftung und das SNF-Stipendium Sinergia CRSII5_183519. Die Autoren danken auch Katia Galan von der EPFL für ihre Hilfe bei der Entwicklung des Färbeprotokolls für die Histologie, den Mitarbeitern der Neural Microsystems Platform des Wyss Center for Bio and Neuroengineering in Genf für ihre Hilfe bei den Herstellungsprozessen, den Mitarbeitern der Tierplattform im University Medical Center (CMU) der Universität Genf (UNIGE) für die Tierpflege, chirurgische Assistenz und postoperatives Management des Minischweins (John Diaper, Xavier Belin, Fabienne Fontao und Walid Habre), der Teammitglieder des Zentrums für Biomedizinische Bildgebung (CIBM) der Universität Genf (Julien Songeon, François Lazeyras und Rares Salomir), der Mitarbeiter der Pathologie des Universitätsspitals Genf (HUG) (Sami Schranz, Francesca Versili, Ruben Soto und Coraline Egger) und Blaise Yvert von der Université Grenobles-Alpes für seinen Input und Austausch über chronische Minischwein-Experimente. Die Autoren danken den Mitarbeitern von Neurosoft Bioelectronics SA für ihre Hilfe beim Herstellungsprozess und für ihre Hilfe bei den Minipig-Experimenten (Benoit Huguet und Margaux Roulet).
Materials
| Bone drill | BBraun | Elan 4 with GA861 handpiece | |
| Bone drill bit | BBraun | Neurocutter GP204R | |
| Bonewax | Ethicon | W31G | |
| Catheter | Venisystems | Abbocath 14G | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Gelfoam | Pfizer | Gelfoam | |
| Insert speakers | Etymotic | Etymotic ER2 insert Earphones | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 1700 | |
| Oscilloscope | Tektronix | MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope | |
| Perfusion pump | Shenzen | LabS3/UD15 | |
| Potentiostat | Gamry Instruments | Reference 600 | |
| Primary Antibody Anti-GFAP | Thermofischer | Anti-GFAP, Rat, # 13-0300 | |
| Primary Antibody Anti-Iba1 | Fujifilm | Anti Iba1, Rabbit, 019-19741 | |
| Primary Antibody Anti-NeuN | SigmaAldrich | Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90 | |
| Pulse Generator | AM Systems | Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | |
| Recording headstage | Multichannel systems | W2100-HS32 | |
| Recording system | Multichannel systems | W2100 | |
| Screwdriver | Medtronic | Handle: 001201, Shaft: 8001205 | |
| Secondary Antibody 488 | Thermofischer | Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006 | |
| Secondary Antibody 555 | Thermofischer | Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435 | |
| Secondary Antibody 647 | Thermofischer | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245 | |
| Slide Scanner | Olympus | VS120 | |
| Snapfrost | Excilone | Excilone Snapfrost | |
| Stab knife | Fine Science Tools | 10316-14 | |
| Suture wire dermal | Ethicon | Vicryl 2-0 | |
| Suture wire dura mater | Ethicon | Mersilk 5-0 | |
| Suture wire for catheter | Ethicon | Vycril 3-0 without needle | |
| Suture wire for lifting dura | Ethicon | Prolene 6-0 with BV-1 needle | |
| Suture wire subcutaneous | Ethicon | Vicryl 4-0 | |
| Titanium bridge | Medtronic | TiMesh 015-2001-4 | Cut out the required size |
| Titanium screws | Medtronic | 9001635, 9001640 | |
| X-ray system | GE | GE OEC 9800 Plus C-Arm |
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