Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu çalışma, Zürih Üniversitesi hayvan etik komitesinin onayı ve yönergeleri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir (#ZH149/19). Bu çalışmada 8-16 haftalık erkek C57Bl/6J fareleri, spesifik patojensiz (SPF) koşullarda yetiştirilmiş ve barındırılmıştır. Bozulmamış kemikler, steril Hank’in tamponlanmış salin çözeltisinde (HBSS) buz üzerinde tutulabilir ve %2 ısı ile inaktive fetal sığır serumu (FBS) elde edilebilir. Kemik iliği, farklılaşma gününde fare25’in femur ve tibiasından toplandı. Kaspaz aktivitesini değerlendirmek için her iki yöntem de hem birincil hem de dönüştürülmüş dahil olmak üzere diğer hücre tipleri için kullanılabilir. 1. Kemik iliği kaynaklı makrofajları (BMDM’ler) ayırt etme NOT: Bir doku kültürü laminer akış başlığındaki tüm adımları uygulayın ve steril aseptik teknikler kullanın. 21 G iğne ile 1 mL’lik bir şırınga hazırlayın. 15 mL’lik bir tüpe 5 mL HBSS + %2 FBS ekleyin. Steril forseps kullanarak, eksize edilmiş bir femur alın ve iğneyi femur açıklığına yerleştirin. Femuru HBSS +% 2 FBS’de tutarak, kemik iliğini kemik beyaz olana kadar yıkayın. Tibianı aynı şekilde yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için çözeltiyi yıkamaya devam edin. Tek hücreli süspansiyonu oda sıcaklığında (RT) 4 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj yapın. Bir vakum aspiratörü kullanarak süpernatantı çıkarın. Peleti nazikçe askıya almak için tüpe dokunun. 1 mL kırmızı hücre lizis tamponu ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve bir P1.000 pipetle nazikçe karıştırın. RT’de 1 dakika boyunca inkübe edin. 10 mL HBSS + %2 FBS ekleyin ve RT’de 4 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkarın ve 10 mL kemik iliği kaynaklı makrofaj (BMDM) kültür ortamında yeniden askıya alın.NOT: BMDM kültür ortamı,% 10 FBS, 20 ng / ml M-CSF, penisilin (50 U / mL) ve streptomisin (50 μg / mL) ilavesiyle düşük glikozlu DMEM’den oluşur (bkz. Alternatif olarak, M-CSF yerine L929 şartlandırılmış ortam kullanılabilir. İki adet 15 cm’lik Petri kabına 15 mL BMDM kültür ortamı ekleyin. Her plakaya 5 mL tek hücreli çözelti ekleyin.NOT: Doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar kullanmayın. Doku kültürü ile tedavi edilen plakalar farklılaşmayı sınırlar. Bulaşıkları 6 gün boyunca 37 °C, % 5 CO2’ye yerleştirin.NOT: BMDM’ler 5-7 gün sonra hasat edilebilir. Farklılaşma için daha uzun inkübasyon süreleri, anti-apoptotik protein ekspresyonunun artmasına neden olur26. 2. Hücrelerin toplanması, tohumlanması ve işlenmesi NOT: Bir doku kültürü laminer akış başlığındaki tüm adımları uygulayın ve steril aseptik teknikler kullanın. Tamamen farklılaşmış makrofajlar plakaya yapışır ve kolay ayrılmaya izin verirken, yüzen hücreler atılabilir. Fosfat tamponlu salin (PBS), Ca 2+ve Mg 2+ ile birlikte veya bunlar olmadan kullanılabilir. 6 günlük inkübasyondan sonra, yüzen hücreleri ve ortamı bir aspiratör kullanarak plakadan çıkarın. Her 15 cm’lik plakaya 5 mL PBS ekleyin. PBS’yi bir aspiratör kullanarak plakadan çıkarın. Her plakaya 2 mL tripsin ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Plakanın hafifçe dokunulması hücreleri yerinden çıkarana kadar plakayı inkübe edin. 5 mL BMDM kültür ortamı alın ve hücreleri plakadan toplayın.İkinci 15 cm’lik plakaya aktarın ve hücreleri plakadan toplayın. Hücre süspansiyonunu plakadan 50 mL’lik bir tüpe çıkarın. Ek olarak 5 mL BMDM kültür ortamı alın ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için her iki plakayı da yıkayın. Hücre süspansiyonunu aynı 50 mL tüpe yerleştirin. Hücre süspansiyonunun 10 μL’sini alın ve tripan mavisi ile 1: 1 seyreltme kullanarak bir hemasitometre kullanarak sayın.NOT: Otomatik hücre sayaçları, makrofajların boyutuna göre kalibre edildiğinde de kullanılabilir. Makrofajları 1 x 106 hücre / mL yoğunlukta tohumlayın. 6 kuyucuklu bir plakada 2 x 106 hücre / kuyucukta tohumlanan BMDM’ler yaklaşık 2 mg / mL toplam protein sağlar. Hücrelerin tedaviden önce plakaya en az 6 saat yapışmasına izin verin.NOT: Diğer hücre tipleri için optimum konsantrasyon belirlenmelidir. Makrofajları 250 nM’de Smac mimetik (Bileşik A, bakınız Malzeme Tablosu)22 ve 16 saat boyunca 500 nM ile tedavi edin.NOT: Tahlilin çalıştığından emin olmak için apoptozu ve kaspaz-3 bölünmesini indüklemek için pozitif bir kontrol ekleyin. Yaygın apoptoz indükleyicileri arasında staurosporin ve etoposid bulunur. Birçok hücre hattının apoptoza uğraması için, 16 saatlik stimülasyon için 0.1-10 μM yeterlidir. 3. Tedavi edilen hücrelerden hücre lizatlarının hazırlanması NOT: Bu adım buz üzerinde yapılmalı ve reaktifler ve malzemeler önceden soğutulmalıdır. İşlem görmüş hücreleri içeren plakaları buzun üzerine aktarın. Ortamı hücre kültüründen 1,5 mL’lik bir tüpe toplayın, 4 ° C’de 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın, ortamı aspire edin ve tüpü buz üzerine koyun. Bu, plakadan ayrılan hücrelerin toplanmasını sağlar. Hücreleri yıkamak için hücre kültürü plakasına 1 mL soğuk PBS ekleyin ve tüm PBS’yi aspire edin. Hücrelere 100 μL tripsin ekleyin (6 kuyucuklu bir tabakla çalışıyorsanız). Tripsinin hücreleri plakadan kaldırmasına izin verin ve bunları 1,5 mL tüpe toplayın. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için 1 mL soğuk PBS kullanın.NOT: Süspansiyon hücreleriyle çalışıyorsanız, ortamı ve hücreleri nazikçe 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 300 x g’de 4 ° C’de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL DISC lizis tamponunda yeniden askıya alın (150 mM sodyum klorür, 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100,% 10 gliserol, 20 mM Tris, pH 7.5, Malzeme Tablosuna bakınız). Örnekleri 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Çözünmeyen fraksiyonu pelet etmek için lizatları ~ 12.000 x g’de 4 ° C’de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Lizatın 25 μL’sini, kaspaz-3 / kaspaz-7 aktivite testi için beyaz düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın (adım 5).NOT: Pelet’i rahatsız etmeyin. Bu, hücre lizatının çözünmeyen fraksiyonudur. Kalan lizatın 10 μL’sini, bisinkoninik asit (BCA) testi için şeffaf düz tabanlı 96 delikli bir plakaya aktarın (adım 4). Bu, numunelerin normalleştirilmesi için kullanılacaktır. Daha fazla işlem için her iki plakayı da buz üzerinde tutun.NOT: Bu aşamada, plakalar yapışkan bir kapakla kapatılabilir ve yaklaşık 4 hafta boyunca -20 ° C’de saklanabilir. 4. BCA tahlili kullanılarak protein niceliği NOT: Her numunedeki protein miktarını ölçmek için diğer reaktifler veya testler kullanılabilir. Popülasyon bazlı tahlilde, numuneler tahlilde kullanılan protein miktarını normalleştirerek karşılaştırılabilir. Sığır serum albümini (BSA) ile 0 μg/mL ile 2.000 μg/mL (0 μg/mL, 25 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL, 100 μg/mL, 1.500 μg/mL, 2.000 μg/mL) arasında standart protein konsantrasyonları hazırlayın. Boşlukları sadece lizis tamponu ile hazırlayın. Adım 3.7’de belirtilen numuneleri içeren düz tabanlı 96 delikli plakaya her standardın 10 μL’sini ekleyin. BCA reaktifi 1 ile BCA reaktifi 2’yi 50:1 oranında karıştırın (bkz. Her numuneye ve standarda 200 μL karışık BCA reaktifi ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Florometrik bir cihazda 562 nm’deki absorbansı ölçün ve protein konsantrasyonunu standart eğri ile ölçün. 5. Kaspaz-3/kaspaz-7 aktivitesi için popülasyona dayalı tahlil NOT: Plakadaki hücre lizatlarının buz üzerinde 3 saatten fazla oturmasına izin vermeyin. Kaspaz aktivitesi varsa, numunenin buz üzerinde olmasına rağmen bu zamanla artar. Numuneler dondurulmuşsa, onları buz üzerinde çözün ve lizatlar çözüldükten hemen sonra devam edin. Florometrik cihazı çalıştırın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve makineyi 37 °C’ye ısıtın. Senaryoyu belirtildiği gibi hazırlayın:Reaksiyonun kinetiğini belirlemek için 40 dakika boyunca her dakika bireysel okumalar yapın. Uyarımı 360 nm’ye ve emisyonu 465 nm’ye ayarlayın. Kuyu başına on flaş yeterlidir. Rekombinant kaspaz-3’ün pozitif kontrolünü hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu). Rekombinant kaspaz-3 enziminin 1 U’sunu 50 μL lizis tamponunda (tüp 1) karıştırın. Ek üç tüpe 25 μL lizis tamponu ekleyin. Tüp 1’den tüp 2’ye 25 μL aktarın. Pipetleme ile karıştırın.Tüp 3 ve tüp 4 için tekrarlayın. Tüp 5 sadece 50 μL lizis tamponu içerecektir. Adım 3.6’da belirtilen kaspaz-3 aktivite testi için beyaz düz tabanlı 96 delikli plakaya her standardın 25 μL’sini ekleyin. Buz üzerinde kaspaz aktivitesi testi için bir ana reaksiyon karışımı hazırlayın. Bir reaksiyon için, 50 μL 2x kaspaz bölünme tamponu (0.2M HEPES pH 7.5; % 20 sakkaroz veya PEG; % 0.2 CHAPS), 5 μL 1 mM DEVD-AMC (kaspaz-3 tetrapeptid substratı), 2 μL 500 mM DTT ve 18 μL deiyonize su karıştırın (bkz. Toplam 100 μL’lik bir reaksiyon hacmi elde etmek için her numuneye ve standarda 75 μL reaksiyon karışımı ekleyin. Adım 5.1’de ayarlanan florometrik cihazı kullanarak floresanı hemen ölçün. Her floresan ölçümü için, boşluğun floresan okumasını (yalnızca lizis tamponu) numunenin floresansından çıkarın. Numunenin protein konsantrasyonuna bölerek okumayı normalleştirin (adım 4.5’te hesaplanmıştır)27: Y eksenindeki normalleştirilmiş floresanın eğimini ve x eksenindeki zamanı belirleyerek kaspaz aktivitesinin oranını hesaplayın. 6. Kaspaz-3/kaspaz-7 aktivitesi için tek hücreli tahlil (akış sitometri analizi) Hücreleri bölüm 2’de açıklandığı gibi tohumlayın. Hücreleri 5 mL’lik bir polistiren tüpe toplayın. Yapışkan hücrelerle çalışıyorsanız, ortamı 5 mL tüpe toplayın. Hücre kültürü plakasına 1 mL soğuk PBS ekleyin ve PBS’yi 5 mL tüpe toplayın. Hücrelere tripsin ekleyin (6 kuyucuklu bulaşıklarla çalışıyorsanız 100 μL). Tripsinin hücreleri plakadan kaldırmasına izin verin ve 5 mL tüpe toplayın. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için 1 mL soğuk PBS kullanın.NOT: Süspansiyon hücreleriyle çalışıyorsanız, ortamı ve hücreleri yavaşça 5 mL’lik bir tüpe aktarın. Numuneleri 5 dakika, 4 ° C boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Bir vakum aspiratörü kullanarak süpernatantı çıkarın. Boyama karışımını hazırlayın. Optimum boyama konsantrasyonu, 50 μL’de 1 x 106-2 x 106 hücredir. Florojenik substratı üreticinin talimatlarına göre seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu, akış sitometrisi). Stok substratından 1 μL alın ve 150 μL PBS içinde seyreltin. Örnek başına 50 uL ekleyin. Numuneleri ışıktan korunarak 37 °C’de 30 dakika boyunca inkübe edin ve her 15 dakikada bir karıştırın. Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi ile kırmızı lazeri 640 nm’de kullanın ve 675/25 nm kullanarak tespit edin. Önce lekesiz kontrol örneğini çalıştırın ve istenen popülasyondan en az 10.000 olay elde edin. FSC-A ve SSC-A nokta grafiğinde bir kapı (P1) kullanarak kalıntıları hariç tutun.P1 kapısındaki olayları görüntüleyen bir histogram kullanın ve medyan floresan yoğunluğunu (MFI) belirlemek için kaspaz substratı (y ekseni) için algılama kullanın.NOT: Bu yöntemde açıklanan kaspaz substratı, 590 nm’de bir uyarma gerektirir ve 628 nm’de yayılır.