Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.
Die Aktivierung von Cysteinproteasen, sogenannten Caspasen, bleibt ein wichtiger Prozess bei multiplen Formen des Zelltods. Caspasen sind wichtige Initiatoren und Vollstrecker der Apoptose, der am besten untersuchten Form des programmierten Zelltods. Apoptose tritt während Entwicklungsprozessen auf und ist ein notwendiges Ereignis in der Gewebehomöostase. Pyroptose ist eine andere Form des Zelltods, die Caspasen nutzt und ein kritischer Prozess bei der Aktivierung des Immunsystems durch die Aktivierung des Inflammasoms ist, was zur Freisetzung von Mitgliedern der Interleukin-1 (IL-1) -Familie führt. Um die Caspase-Aktivität zu beurteilen, können Zielsubstrate bewertet werden. Die Empfindlichkeit kann jedoch ein Problem sein, wenn einzelne Zellen oder eine geringe Aktivität untersucht werden. Wir zeigen, wie ein fluorogenes Substrat mit einem populationsbasierten Assay oder Einzelzellassay mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann. Mit der richtigen Kontrolle können verschiedene Aminosäuresequenzen verwendet werden, um zu identifizieren, welche Caspasen aktiv sind. Mit diesen Assays wurde der gleichzeitige Verlust der Inhibitoren von Apoptoseproteinen bei der Stimulation des Tumornekrosefaktors (TNF) identifiziert, der in erster Linie die Apoptose in Makrophagen und nicht andere Formen des Zelltods induziert.
Caspasen sind an verschiedenen Formen des programmierten Zelltods beteiligt. Apoptose ist die am besten untersuchte Form des programmierten Zelltods und ist mit der Caspase-Aktivität1 verbunden. Alle Caspasen besitzen eine große und eine kleine katalytische Untereinheit. Caspase-1, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-9 und Caspase-11 besitzen eine Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD), und Caspase-8 und Caspase-10 enthalten Death-Effektor-Domänen (DED)2,3,4,5 (Tabelle 1). Apoptose kann durch zwei Hauptwege initiiert werden: den extrinsischen Weg und den intrinsischen Weg. Der extrinsische apoptotische Signalweg wird durch Todesrezeptoren ausgelöst, die Teil der Tumornekrosefaktor-Superfamilie (TNFSF) sind. Todesrezeptoren besitzen DED-Domänen, die die Caspase-8-Aktivitäterleichtern 6. Der intrinsische apoptotische Weg beinhaltet die Aktivierung von Caspase-9 nach der Bildung des Apoptosoms, was die Freisetzung von Cytochrom c und Apaf-17 erfordert. Die Aktivierung des Initiators Caspase, Caspase-8 oder Caspase-9, führt zur Spaltung und anschließenden Aktivierung der Henker-Caspasen, die Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 sind. Die Identifikation, dass die Henkerskaspasen aktiv sind, deutet darauf hin, dass die Zellen Apoptose durchlaufen, und diese Aktivierung wird als wichtiger Faktor bei der Definition der Art des Zelltods angesehen.
Die Caspase-Aktivierung ist auch ein kritischer Punkt für die Regulierung von Entzündungen und die Induktion alternativer Formen des programmierten Zelltods. Zum Beispiel führt die Caspase-1-Aktivierung zur Reifung von proinflammatorischen Zytokinen der Interleukin-1-Familie8. Die Freisetzung und Aktivierung von Zytokinen aus dieser Familie, insbesondere IL-1β und IL-18, resultieren aus der Gasdermin-D-Spaltung und Porenbildung an der Plasmamembran 9,10. Eine unzureichende Membranreparatur der Gasdermin-D-Poren kann zu einer Art Zelltod führen, der als Pyroptose11 bekannt ist. Darüber hinaus führt die Caspase-8-Aktivität zur Hemmung eines Caspase-unabhängigen Zelltods, der als Nekroptose12 bekannt ist. Die mit Rezeptoren interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1) ist einer der kritischen Faktoren bei der Nekroptose und bei der Förderung von Entzündungen, die durch NF-kB reguliert werden. Modelle haben gezeigt, dass RIPK1 von Caspase-8 gespalten wird, was zu einer Einschränkung der NF-kB-Signalisierung, Apoptose und Nekroptose führt13,14. Daher kann die Identifizierung der Aktivität verschiedener Caspasen helfen, die daraus resultierende Entzündung und die Zelltodmodalität zu verstehen.
Unabhängig von der Funktion der Caspasen bei der Regulierung der Zelltodmodalitäten kann die Caspase-Aktivität auch andere Zytokinfamilien wie Interferon (IFN) als Reaktion auf eine Infektion regulieren15,16. Darüber hinaus sind Caspasen an Nicht-Zelltod-Funktionen beteiligt, einschließlich Zellschicksalsentscheidungen, Gewebereparatur und -regeneration, Tumorentstehung durch DNA-Reparatur und neuronale Synapsenfunktion. Es wird angenommen, dass die Aktivität von Caspasen in diesen nicht-tödlichen Rollen durch die zelluläre Lokalisation und die Anzahl der Caspasen begrenzt ist. Daher kann die Quantifizierung des Niveaus der Caspase-Aktivität durchaus bestimmen, ob eine Zelle einen Zelltod erfährt oder ob die Caspase eine Rolle bei einer Nicht-Zelltod-Funktion spielt 4,17,18.
Die Caspase-Aktivität kann mit mehreren Methoden bewertet werden. Western Blotting für gespaltene Caspasen und ihre Substrate wurde als Indikator für die Aktivität verwendet, aber diese Assays sind bestenfalls qualitativ. Um festzustellen, ob die Caspase-Aktivität mit dem Zelltod einhergeht, ist eine quantitative Messung ideal. Da Caspasen Substrate an einer Erkennungsstelle spalten, die aus vier Aminosäuren besteht, wurden kolorimetrische, Lumineszenz- oder fluorometrische Methoden entwickelt. Caspasen scheinen jedoch Plastizität in ihrer Substraterkennung zu haben 19,20. Die Erkennungssequenz ist nicht mit den Proteindomänen assoziiert (Tabelle 1). Die Tetrapeptidsequenz DEVD kann jedoch verwendet werden, um Caspase-3 und Caspase-7 Aktivität20,21 nachzuweisen.
Smac-Mimetika sind Verbindungen, die auf die Inhibitoren von Apoptoseproteinen (IAPs) abzielen. Die Verwendung von Smac-Mimetika in einer Untergruppe von Krebszellen führt dazu, dass die Zellen empfindlich auf den TNF-induzierten Zelltod reagieren22. In primären Makrophagen verursachen Smac-Mimetika den Zelltod ohne die exogene Zugabe von TNF23,24. Der Verlust von cIAP1 durch Smac-Mimetika-induzierte Degradation führt zur Produktion von TNF. Wenn Caspase-Aktivität nachgewiesen wird, bedeutet dies, dass die Zellen nicht durch Nekroptose, sondern apoptotisch abgestorben sind. Bei dieser Methode wird der Nachweis von gespaltenem DEVD-Substrat verwendet, um die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität zu identifizieren. Weitere Experimente, um den apoptotischen Zelltod zu bestätigen, wurden zuvorveröffentlicht 24.
Bei dieser Methode wird ein fluorogenes Substrat in einem populationsbasierten Assay oder einer Einzelzellanalyse verwendet, um die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität zu messen. Beide Methoden messen die Caspase-Aktivität quantitativ anhand der Spaltung eines Substrats. Ein Vorteil ist die Möglichkeit, diese Methoden für eine Vielzahl von Proben zu verwenden. Mit diesen Methoden wird die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität in primären Makrophagen nachgewiesen, die mit Smac-Mimetika behandelt wurden.
Ein kritischer Aspekt des populationsbasierten fluorometrischen Assays ist die Zeit von der Lyse bis zum Ablesen der Fluoreszenz. Die Proben müssen während des gesamten Verfahrens auf Eis gehalten werden, insbesondere vor dem “Ablesen” des Assays. Dies verhindert eine vorzeitige Spaltung und Fluoreszenz des Substrats. Bei Verwendung des populationsbasierten Assays ist möglicherweise weniger Optimierung erforderlich. Die Menge an Protein, die im Assay verwendet wird, wird normalisiert, so dass die Proben direkt verglichen werden können. Ein Nachteil ist, dass in einem späten Stadium des apoptotischen Zelltods die Gesamtproteinmenge reduziert wird; Daher ist der Nachweis der Caspase-Aktivität möglicherweise nicht möglich. Um dieses Problem zu umgehen, werden unterschiedliche Kinetik oder unterschiedliche Behandlungsdosen empfohlen. Darüber hinaus kann neben der in dieser Methode beschriebenen Software auch andere Software verwendet werden, um die Rate der Caspase-Aktivität genau zu bewerten.
Für den durchflusszytometrischen Assay sind genügend Ereignisse oder Zellen erforderlich, um die Populationen sicher zu steuern. Darüber hinaus kann eine weitere Optimierung des flussbasierten Assays erforderlich sein, um das optimale Verhältnis von Substrat zu Zellzahl zu erreichen. Mit der Durchflusszytometrie bietet sich diese Methode jedoch an, um zusätzliche Parameter zu messen, wie z.B. Zelloberflächenmarker zur Zelltypidentifikation.
Sowohl die Populations- als auch die Einzelzellmethode könnten für andere Caspasen verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erkennungssequenz für andere Caspasen weniger diskriminiert wird. Daher müssen andere Methoden für die Caspase-Aktivität verwendet werden. Dazu gehören die Hemmung der Caspase-Aktivität, CRISPR oder Knock-down bestimmter Caspasen und Western Blotting, um die Spaltung bekannter Substrate zu erkennen.
Eine alternative Methode zur Detektion der Caspase-Aktivität ist die Zeitrafferaufnahme. Das gleiche permeable Caspase-Substrat könnte zusammen mit anderen Lebensfähigkeitsmarkern wie Annexin V verwendet werden, um Informationen über die Kinetik des Zelltods zu liefern. Die Bildgebung würde auch die Caspase-Aktivität und das Zellüberleben trennen, was den Nachweis subletaler Mengen an Caspase-Aktivität in einer Zellpopulation ermöglicht. Die nicht-letalen Funktionen von Caspase-3/Caspase-7 sind mit der antiviralen Regulation in angeborenen Immunzellen29 verbunden, insbesondere mit der Aktivierung von Typ-I-IFN über die mitochondriale DNA-Freisetzung15,16. Daher sind diese Assays zur Messung der Caspase-Aktivität entscheidend für die Identifizierung verschiedener Arten des Zelltods und können bei der Beurteilung von Nicht-Zelltodfunktionen nützlich sein.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. wird durch das Clöetta Medical Research Fellow Stipendium unterstützt, S.R. wird vom CanDoc UZH Forschungskredit unterstützt und J.T. wird vom Chinese Scholarship Council unterstützt.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |