El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.
La activación de las proteasas de cisteína, conocidas como caspasas, sigue siendo un proceso importante en múltiples formas de muerte celular. Las caspasas son iniciadores críticos y verdugos de la apoptosis, la forma más estudiada de muerte celular programada. La apoptosis ocurre durante los procesos de desarrollo y es un evento necesario en la homeostasis tisular. La piroptosis es otra forma de muerte celular que utiliza caspasas y es un proceso crítico en la activación del sistema inmune a través de la activación del inflamasoma, lo que resulta en la liberación de miembros de la familia de la interleucina-1 (IL-1). Para evaluar la actividad de las caspasas, se pueden evaluar los sustratos objetivo. Sin embargo, la sensibilidad puede ser un problema al examinar células individuales o actividad de bajo nivel. Demostramos cómo se puede usar un sustrato fluorogénico con un ensayo basado en la población o un ensayo de una sola célula mediante citometría de flujo. Con los controles adecuados, se pueden usar diferentes secuencias de aminoácidos para identificar qué caspasas están activas. Usando estos ensayos, se ha identificado la pérdida simultánea de los inhibidores de las proteínas de apoptosis en la estimulación del factor de necrosis tumoral (TNF), que induce principalmente la apoptosis en macrófagos en lugar de otras formas de muerte celular.
Las caspasas están involucradas en varias formas de muerte celular programada. La apoptosis es la forma más estudiada de muerte celular programada y está asociada a la actividad de la caspasa1. Todas las caspasas poseen una subunidad catalítica grande y pequeña. La caspasa-1, la caspasa-4, la caspasa-5, la caspasa-9 y la caspasa-11 poseen un dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD), y la caspasa-8 y la caspasa-10 contienen dominios efectores de muerte (DED)2,3,4,5 (Tabla 1). La apoptosis puede iniciarse por dos vías principales: la vía extrínseca y la vía intrínseca. La vía apoptótica extrínseca es desencadenada por los receptores de muerte, que forman parte de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF). Los receptores de muerte poseen dominios DED, facilitando la actividad de la caspasa-86. La vía apoptótica intrínseca implica la activación de la caspasa-9 después de la formación del apoptosoma, requiriendo la liberación del citocromo c y Apaf-17. La activación de cualquiera de las caspasas iniciadoras, caspasa-8 o caspasa-9, conduce a la escisión y posterior activación de las caspasas verdugo, que son caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7. La identificación de que las caspasas verdugos están activas indica que las células están sufriendo apoptosis, y esta activación se considera un factor importante en la definición del modo de muerte celular.
La activación de la caspasa también es una coyuntura crítica para regular la inflamación y la inducción de formas alternativas de muerte celular programada. Por ejemplo, la activación de la caspasa-1 conduce a la maduración de citoquinas proinflamatorias de la familia de la interleucina-18. La liberación y activación de citoquinas de esta familia, particularmente IL-1β e IL-18, resultan de la escisión de la gasdermina D y la formación de poros en la membrana plasmática 9,10. La reparación inadecuada de la membrana de los poros de la gasdermina D puede resultar en un tipo de muerte celular conocida como piroptosis11. Además, la actividad de la caspasa-8 resulta en la inhibición de una muerte celular independiente de la caspasa conocida como necroptosis12. La proteína quinasa 1 de serina/treonina que interactúa con el receptor (RIPK1) es uno de los factores críticos en la necroptosis y en la conducción de la inflamación regulada por NF-kB. Los modelos han demostrado que RIPK1 es escindido por caspasa-8, lo que resulta en la limitación de la señalización de NF-kB, la apoptosis y la necroptosis13,14. Por lo tanto, identificar la actividad de diferentes caspasas puede ayudar a comprender la modalidad resultante de inflamación y muerte celular.
Independientemente de la función de las caspasas en la regulación de las modalidades de muerte celular, la actividad de las caspasas también puede regular otras familias de citoquinas, como el interferón (IFN), en respuesta a la infección15,16. Además, las caspasas están involucradas en funciones de muerte no celular, incluidas las decisiones de destino celular, la reparación y regeneración de tejidos, la tumorigénesis a través de la reparación del ADN y la función de la sinapsis neuronal. Se cree que la actividad de las caspasas en estas funciones no letales está limitada por la localización celular y la cantidad de caspasas. Por lo tanto, la cuantificación del nivel de actividad de la caspasa bien puede definir si una célula sufre muerte celular o si la caspasa desempeña un papel en una función de muerte no celular 4,17,18.
La actividad de la caspasa se puede evaluar mediante múltiples métodos. La Western blot para caspasas hendidas y sus sustratos se ha utilizado como un indicador de actividad, pero estos ensayos son cualitativos en el mejor de los casos. Para determinar si la actividad de la caspasa está asociada con la muerte celular, una medición cuantitativa es ideal. Dado que las caspasas escinden sustratos en un sitio de reconocimiento que consta de cuatro aminoácidos, se han desarrollado métodos colorimétricos, luminiscentes o fluorométricos. Sin embargo, las caspasas parecen tener plasticidad en su reconocimiento de sustrato19,20. La secuencia de reconocimiento no está asociada a los dominios proteicos (Tabla 1). La secuencia tetrapeptídica DEVD, sin embargo, puede ser utilizada para detectar la actividad de caspasa-3 y caspasa-720,21.
Los miméticos de Smac son compuestos dirigidos a los inhibidores de las proteínas de apoptosis (PIA). El uso de miméticos de Smac en un subconjunto de células cancerosas hace que las células se vuelvan sensibles a la muerte celular inducida por TNF22. En macrófagos primarios, los miméticos de Smac causan la muerte celular sin la adición exógena de TNF23,24. La pérdida de cIAP1 por degradación inducida por mimética Smac da como resultado la producción de TNF. Si se detecta actividad de caspasa, esto significa que las células no murieron por necroptosis sino de manera apoptótica. En este método, la detección del sustrato DEVD escindido se utiliza para identificar la actividad de caspasa-3/caspasa-7. Otros experimentos para confirmar la muerte celular apoptótica se han publicado previamente24.
En este método, se utiliza un sustrato fluorogénico en un ensayo poblacional o análisis unicelular para medir la actividad de la caspasa-3/caspasa-7. Ambos métodos miden la actividad de la caspasa de una manera cuantitativa basada en la escisión de un sustrato. Una ventaja es la capacidad de utilizar estos métodos para numerosas muestras. Con estos métodos, la actividad de caspasa-3/caspasa-7 se detecta en macrófagos primarios tratados con miméticos de Smac.
Un aspecto crítico del ensayo fluorométrico basado en la población es el tiempo desde la lisis hasta la lectura de la fluorescencia. Las muestras deben mantenerse en hielo durante todo el procedimiento, particularmente antes de “leer” el ensayo. Esto evita la escisión prematura y la fluorescencia del sustrato. Usando el ensayo basado en la población, es posible que se requiera menos optimización. La cantidad de proteína utilizada en el ensayo se normaliza, lo que permite comparar directamente las muestras. Una advertencia es que en una etapa tardía de la muerte celular apoptótica, la cantidad total de proteína se reduce; Por lo tanto, la detección de la actividad de la caspasa puede no ser posible. Se recomiendan diferentes cinéticas o diferentes dosis de tratamiento para evitar este problema. Además, se puede utilizar otro software para evaluar con precisión la tasa de actividad de la caspasa además del software descrito en este método.
Para el ensayo de citometría de flujo, se requieren suficientes eventos o células para bloquear a las poblaciones con confianza. Además, puede ser necesaria una mayor optimización en el ensayo basado en el flujo para lograr la relación óptima entre sustrato y número de células. Sin embargo, con la citometría de flujo, este método se presta para medir parámetros adicionales, como marcadores de superficie celular para la identificación del tipo de célula.
Tanto la población como los métodos unicelulares podrían usarse para otras caspasas. Sin embargo, es importante recordar que la secuencia de reconocimiento es menos discriminada para otras caspasas. Como tal, se deben utilizar otros métodos para la actividad de la caspasa. Esto incluye la inhibición de la actividad de las caspasas, CRISPR o derribo de caspasas específicas y western blot para detectar la escisión de sustratos conocidos.
Un método alternativo para detectar la actividad de la caspasa son las imágenes de lapso de tiempo. El mismo sustrato permeable de caspasa podría utilizarse junto con otros marcadores de viabilidad, como la anexina V, para proporcionar información sobre la cinética de la muerte celular. Las imágenes también separarían la actividad de la caspasa y la supervivencia celular, permitiendo la detección de cantidades subletales de actividad de caspasa en una población celular. Las funciones no letales de la caspasa-3/caspasa-7 están relacionadas a la regulación antiviral en las células inmunes innatas29, particularmente la activación del IFN tipo I a través de la liberación de ADN mitocondrial15,16. Por lo tanto, estos ensayos para medir la actividad de las caspasas son críticos para identificar diferentes modos de muerte celular y pueden ser útiles para evaluar las funciones de muerte no celular.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. cuenta con el apoyo de la beca Clöetta Medical Research Fellow, S.R. cuenta con el apoyo de CanDoc UZH Forschungskredit y J.T. cuenta con el apoyo del Consejo Chino de Becas.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |