Il presente protocollo descrive due metodi per misurare l’attività delle caspasi attraverso un substrato fluorogenico utilizzando la citometria a flusso o uno spettrofluorometro.
L’attivazione delle proteasi della cisteina, note come caspasi, rimane un processo importante in molteplici forme di morte cellulare. Le caspasi sono iniziatori critici e carnefici dell’apoptosi, la forma più studiata di morte cellulare programmata. L’apoptosi si verifica durante i processi di sviluppo ed è un evento necessario nell’omeostasi tissutale. La piroptosi è un’altra forma di morte cellulare che utilizza le caspasi ed è un processo critico nell’attivazione del sistema immunitario attraverso l’attivazione dell’inflammasoma, che provoca il rilascio di membri della famiglia dell’interleuchina-1 (IL-1). Per valutare l’attività delle caspasi, è possibile valutare i substrati target. Tuttavia, la sensibilità può essere un problema quando si esaminano singole cellule o attività di basso livello. Dimostriamo come un substrato fluorogenico può essere utilizzato con un test basato sulla popolazione o un test a singola cellula mediante citometria a flusso. Con controlli adeguati, diverse sequenze di aminoacidi possono essere utilizzate per identificare quali caspasi sono attive. Utilizzando questi test, è stata identificata la perdita simultanea degli inibitori delle proteine dell’apoptosi dopo stimolazione del fattore di necrosi tumorale (TNF), che induce principalmente l’apoptosi nei macrofagi piuttosto che altre forme di morte cellulare.
Le caspasi sono coinvolte in diverse forme di morte cellulare programmata. L’apoptosi è la forma più studiata di morte cellulare programmata ed è associata all’attività della caspasi1. Tutte le caspasi possiedono una subunità catalitica grande e piccola. Caspase-1, caspasi-4, caspasi-5, caspasi-9 e caspasi-11 possiedono un dominio di attivazione e reclutamento della caspasi (CARD), e le caspasi-8 e caspasi-10 contengono domini effettori di morte (DED)2,3,4,5 (Tabella 1). L’apoptosi può essere iniziata da due percorsi principali: la via estrinseca e la via intrinseca. La via apoptotica estrinseca è innescata dai recettori di morte, che fanno parte della superfamiglia dei fattori di necrosi tumorale (TNFSF). I recettori di morte possiedono domini DED, facilitando l’attività della caspasi-86. La via apoptotica intrinseca comporta l’attivazione della caspasi-9 dopo la formazione dell’apoptosoma, richiedendo il rilascio del citocromo c e Apaf-17. L’attivazione della caspasi iniziatrice, caspasi-8 o caspasi-9, porta alla scissione e alla successiva attivazione delle caspasi del boia, che sono caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7. Identificare che le caspasi del boia sono attive indica che le cellule sono in fase di apoptosi, e questa attivazione è considerata un fattore importante nella definizione della modalità di morte cellulare.
L’attivazione della caspasi è anche un momento critico per regolare l’infiammazione e l’induzione di forme alternative di morte cellulare programmata. Ad esempio, l’attivazione della caspasi-1 porta alla maturazione delle citochine pro-infiammatorie della famiglia dell’interleuchina-18. Il rilascio e l’attivazione delle citochine di questa famiglia, in particolare IL-1β e IL-18, derivano dalla scissione del gasdermina D e dalla formazione di pori alla membrana plasmatica 9,10. Una riparazione inadeguata della membrana dei pori della gasdermina D può provocare un tipo di morte cellulare nota come piroptosi11. Inoltre, l’attività della caspasi-8 provoca l’inibizione di una morte cellulare caspasi-indipendente nota come necroptosi12. La proteina chinasi 1 serina/treonina che interagisce con i recettori (RIPK1) è uno dei fattori critici nella necroptosi e nel guidare l’infiammazione regolata da NF-kB. I modelli hanno dimostrato che RIPK1 è scisso dalla caspasi-8, con conseguente limitazione della segnalazione NF-kB, dell’apoptosi e della necroptosi13,14. Pertanto, identificare l’attività delle diverse caspasi può aiutare a comprendere l’infiammazione risultante e la modalità di morte cellulare.
Indipendentemente dalla funzione delle caspasi nella regolazione delle modalità di morte cellulare, l’attività delle caspasi può anche regolare altre famiglie di citochine, come l’interferone (IFN), in risposta all’infezione15,16. Inoltre, le caspasi sono coinvolte nelle funzioni di morte non cellulare, comprese le decisioni sul destino cellulare, la riparazione e la rigenerazione dei tessuti, la tumorigenesi attraverso la riparazione del DNA e la funzione delle sinapsi neuronali. Si ritiene che l’attività delle caspasi in questi ruoli non letali sia limitata dalla localizzazione cellulare e dalla quantità di caspasi. Pertanto, quantificare il livello di attività della caspasi può ben definire se una cellula subisce la morte cellulare o se la caspasi svolge un ruolo in una funzione di morte non cellulare 4,17,18.
L’attività della caspasi può essere valutata con più metodi. Il Western blotting per le caspasi scisse e i loro substrati è stato usato come indicatore di attività, ma questi test sono qualitativi nella migliore delle ipotesi. Per determinare se l’attività delle caspasi è associata alla morte cellulare, una misurazione quantitativa è l’ideale. Poiché le caspasi scindono i substrati in un sito di riconoscimento costituito da quattro amminoacidi, sono stati sviluppati metodi colorimetrici, luminescenziali o fluorometrici. Tuttavia, le caspasi sembrano avere plasticità nel loro riconoscimento del substrato19,20. La sequenza di riconoscimento non è associata ai domini proteici (Tabella 1). La sequenza tetrapeptidica DEVD, tuttavia, può essere utilizzata per rilevare l’attività della caspasi-3 e della caspasi-720,21.
I mimetici Smac sono composti che prendono di mira gli inibitori delle proteine dell’apoptosi (IAP). L’uso di Mimetici Smac in un sottogruppo di cellule tumorali fa sì che le cellule diventino sensibili alla morte cellulare indotta dal TNF22. Nei macrofagi primari, i mimetici Smac causano la morte cellulare senza l’aggiunta esogena di TNF23,24. La perdita di cIAP1 da parte della degradazione indotta da Smac mimetico provoca la produzione di TNF. Se viene rilevata l’attività della caspasi, ciò significa che le cellule non sono morte per necroptosi ma in modo apoptotico. In questo metodo, il rilevamento del substrato DEVD scisso viene utilizzato per identificare l’attività della caspasi-3/caspasi-7. Ulteriori esperimenti per confermare la morte cellulare apoptotica sono stati pubblicati in precedenza24.
In questo metodo, un substrato fluorogenico viene utilizzato in un test basato sulla popolazione o in un’analisi a singola cellula per misurare l’attività della caspasi-3 / caspasi-7. Entrambi i metodi misurano l’attività della caspasi in modo quantitativo in base alla scissione di un substrato. Un vantaggio è la capacità di utilizzare questi metodi per numerosi campioni. Con questi metodi, l’attività della caspasi-3/caspasi-7 viene rilevata nei macrofagi primari trattati con Smac mimetici.
Un aspetto critico del test fluorometrico basato sulla popolazione è il tempo dalla lisi alla lettura della fluorescenza. I campioni devono essere tenuti congelati durante tutta la procedura, in particolare prima di “leggere” il test. Ciò impedisce la scissione prematura e la fluorescenza del substrato. Utilizzando il test basato sulla popolazione, potrebbe essere necessaria una minore ottimizzazione. La quantità di proteine utilizzate nel test viene normalizzata, consentendo di confrontare direttamente i campioni. Un avvertimento è che in una fase avanzata della morte cellulare apoptotica, la quantità totale di proteine è ridotta; Pertanto, il rilevamento dell’attività delle caspasi potrebbe non essere possibile. Si raccomanda una cinetica diversa o dosi di trattamento diverse per aggirare questo problema. Inoltre, è possibile utilizzare altri software per valutare con precisione il tasso di attività delle caspasi oltre al software descritto in questo metodo.
Per il test citometrico a flusso, sono necessari abbastanza eventi o cellule per controllare le popolazioni con sicurezza. Inoltre, potrebbe essere necessaria una maggiore ottimizzazione nel test basato sul flusso per ottenere il rapporto ottimale tra substrato e numero di cellule. Tuttavia, con la citometria a flusso, questo metodo si presta a misurare parametri aggiuntivi, come i marcatori della superficie cellulare per l’identificazione del tipo di cellula.
Sia la popolazione che i metodi unicellulari potrebbero essere utilizzati per altre caspasi. Tuttavia, è importante ricordare che la sequenza di riconoscimento è meno discriminata per altre caspasi. Pertanto, devono essere utilizzati altri metodi per l’attività delle caspasi. Ciò include l’inibizione dell’attività delle caspasi, CRISPR o knock-down di specifiche caspasi e western blotting per rilevare la scissione di substrati noti.
Un metodo alternativo per rilevare l’attività delle caspasi è l’imaging time-lapse. Lo stesso substrato di caspasi permeabile potrebbe essere utilizzato insieme ad altri marcatori di vitalità, come l’annessina V, per fornire informazioni sulla cinetica della morte cellulare. L’imaging separerebbe anche l’attività della caspasi e la sopravvivenza cellulare, consentendo il rilevamento di quantità subletali di attività della caspasi in una popolazione cellulare. Le funzioni non letali della caspasi-3/caspasi-7 sono legate alla regolazione antivirale nelle cellule immunitarie innate29, in particolare all’attivazione dell’IFN di tipo I attraverso il rilascio di DNA mitocondriale15,16. Pertanto, questi test per misurare l’attività delle caspasi sono fondamentali per identificare diverse modalità di morte cellulare e possono essere utili per valutare le funzioni di morte non cellulare.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. è supportato dalla sovvenzione Clöetta Medical Research Fellow, S.R. è supportato dal CanDoc UZH Forschungskredit e J.T. è supportato dal Chinese Scholarship Council.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |