蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

本研究は、チューリッヒ大学の動物倫理委員会(#ZH149/19)の承認を得て、ガイドラインに従って実施されました。本研究では、特定の病原体フリー(SPF)条件で飼育および飼育された、8〜16週齢の雄C57Bl / 6Jマウスを使用しました。無傷の骨は、2%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を含む滅菌ハンク緩衝生理食塩水(HBSS)で氷上に保つことができます。骨髄は分化当日にマウス25 の大腿骨及び脛骨から採取した。カスパーゼ活性を評価するための両方の方法は、初代および形質転換の両方を含む他の細胞型に使用することができる。 1. 骨髄由来マクロファージ(BMDM)の鑑別 注:組織培養層流フードですべての手順を実行し、滅菌無菌技術を使用します。 21 Gの針が付いた1 mLのシリンジを準備します。 5 mLのHBSS + 2Sを15 mLチューブに加えます。 滅菌鉗子を使用して、切除した大腿骨を取り、大腿骨の開口部に針を挿入します。大腿骨をHBSS + 2Sに保持し、骨が白くなるまで骨髄を洗い流します。同じ方法で脛骨を洗い流します。溶液を洗い流し続けて、単一細胞懸濁液を得る。 単一細胞懸濁液を200 x g で室温(RT)で4分間遠心分離します。 真空吸引器を使用して上清を除去します。チューブをタップして、ペレットを静かに再懸濁します。赤血球溶解バッファー1 mL( 材料の表を参照)を加え、P1,000ピペットで穏やかに混合します。RTで1分間インキュベートします。 10 mLのHBSS + 2% FBSを加え、200 x g でRTで4分間遠心分離します。 上清を除去し、10mLの骨髄由来マクロファージ(BMDM)培養液に再懸濁する。注:BMDM培地は、10S、20 ng / ml M-CSF、ペニシリン(50 U / mL)、およびストレプトマイシン(50 μg / mL)を添加した低グルコースDMEMで構成されています( 材料の表を参照)。あるいは、20%L929馴化培地をM−CSFの代わりに用いることができる。 15 mLのBMDM培地を2つの15 cmペトリ皿に加えます。5 mLの単一細胞溶液を各プレートに追加します。注:組織培養処理プレートは使用しないでください。組織培養処理プレートは分化を制限する。 皿を37°C、5%CO2に6日間置きます。注意: BMDMは5〜7日後に収穫できます。分化のためのインキュベーション時間が長くなると、抗アポトーシスタンパク質発現が増加します26。 2.細胞の収穫、播種、処理 注:組織培養層流フードですべての手順を実行し、滅菌無菌技術を使用します。完全に分化したマクロファージはプレートに接着し、容易に分離でき、浮遊細胞は廃棄することができます。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、Ca2+ およびMg2+の有無にかかわらず使用できます。 6日間のインキュベーション後、アスピレーターを使用してプレートから浮遊細胞と培地を取り除きます。 各15 cmプレートに5 mLのPBSを追加します。アスピレーターを使用してプレートからPBSを取り外します。 各プレートに2 mLのトリプシン( 材料表を参照)を追加します。プレートを軽くたたくと細胞がはがれるまでプレートをインキュベートします。5 mLのBMDM培地を取り、プレートから細胞を回収します。2枚目の15cmプレートに移し、プレートから細胞を回収する。細胞懸濁液をプレートから取り出して50 mLチューブに入れます。さらに5 mLのBMDM培地を取り、両方のプレートを洗浄して、すべての細胞が回収されたことを確認します。細胞懸濁液を同じ50 mLチューブに入れます。 細胞懸濁液を10 μL採取し、トリパンブルーで1:1希釈した血球計算盤を用いて計数します。注:自動セルカウンターは、マクロファージのサイズに合わせて校正された場合にも使用できます。 マクロファージを1 x 106 細胞/mLの密度で播種します。6ウェルプレートに2 x 106 細胞/ウェルで播種したBMDMは、約2 mg/mLの総タンパク質を提供します。処理前に、細胞をプレートに最低6時間接着させます。注:他の細胞タイプについては、最適な濃度を決定する必要があります。 マクロファージをSmac模倣体(化合物A、 材料表を参照)22で250 nMおよび500 nMで16時間処理します。注:アッセイが機能していることを確認するために、アポトーシスとカスパーゼ-3切断を誘導するポジティブコントロールを含めます。一般的なアポトーシス誘導物質には、スタウロスポリンおよびエトポシドが含まれる。多くの細胞株がアポトーシスを起こすためには、16時間の刺激に対して0.1〜10μMで十分です。 3. 処理細胞からの細胞ライセートの調製 注:このステップは氷上で実行する必要があり、試薬と材料は事前に冷却する必要があります。 処理した細胞を含むプレートを氷上に移します。細胞培養液から培地を1.5 mLチューブに回収し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、培地を吸引し、チューブを氷上に置きます。これにより、プレートから剥離した細胞の収集が可能になります。 細胞を洗浄するための細胞培養プレートに1 mLの冷PBSを加え、すべてのPBSを吸引します。100 μLのトリプシンを細胞に加えます(6ウェルディッシュを使用する場合)。トリプシンで細胞をプレートから持ち上げ、1.5 mLチューブに回収します。1 mLのコールドPBSを使用して、すべての細胞が収集されていることを確認します。注:浮遊細胞を扱う場合は、培地と細胞を1.5 mLチューブに静かに移します。 細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、100 μL DISC 溶解バッファー (150 mM 塩化ナトリウム、2 mM EDTA、1% Triton X-100、10% グリセロール、20 mM トリス、pH 7.5、 材料表を参照) に再懸濁します。 サンプルを氷上で20分間インキュベートします。 ライセートを~12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、不溶性画分をペレット化します。 カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性アッセイ(ステップ5)のために、25 μLのライセートを白色平底96ウェルプレートに移します。注意: ペレットを乱さないでください。これは細胞ライセートの不溶性画分です。 残りのライセート10 μLを、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ用の透明な平底96ウェルプレートに移します(ステップ4)。これは、サンプルの正規化に使用されます。 さらなる処理のために両方のプレートを氷の上に置いてください。注:この段階で、プレートは粘着カバーで密封し、-20°Cで約4週間保存できます。 4. BCAアッセイを用いたタンパク質定量 注:他の試薬またはアッセイを使用して、各サンプル中のタンパク質量を定量できます。ポピュレーションベースのアッセイでは、アッセイで使用されるタンパク質の量を正規化することによってサンプルを比較できます。 ウシ血清アルブミン(BSA)を使用して、0 μg/mLから2,000 μg/mL(0 μg/mL、25 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL、100 μg/mL、1,500 μg/mL、2,000 μg/mL)の標準タンパク質濃度を調製します。溶解バッファーのみでブランクを調製します。 ステップ3.7で説明したサンプルを含む平底96ウェルプレートに各標準物質10 μLを追加します。 BCA試薬1とBCA試薬2を50:1の比率で混合します( 材料表を参照)。200 μLの混合BCA試薬を各サンプルと標準物質に加えます。 37°Cで30分間インキュベートします。 蛍光測定装置で562 nmの吸光度を測定し、検量線でタンパク質濃度を定量します。 5.カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性の集団ベースのアッセイ 注意: プレート内の細胞溶解物を氷の上に3時間以上置かないでください。カスパーゼ活性が存在する場合、サンプルが氷上にあるにもかかわらず、これは時間とともに増加します。サンプルが凍結している場合は、氷上で解凍し、ライセートが解凍したらすぐに進めます。 蛍光測定装置( 材料表を参照)を起動し、機械を37°Cに加熱します。 前述のようにスクリプトを準備します。反応の速度論を決定するために、毎分40分間個々の読み取りを実行します。 励起を360 nm、発光を465 nmに設定します。ウェルあたり10回のフラッシュで十分です。 組換えカスパーゼ-3のポジティブコントロールを準備します( 材料の表を参照)。組換えカスパーゼ-3酵素1Uを50 μLの溶解バッファー(チューブ1)に混合します。25 μLの溶解バッファーを追加の3本のチューブに加えます。チューブ1からチューブ2に25 μLを移します。ピペッティングで混ぜる。チューブ3とチューブ4についても繰り返します。チューブ5には50 μLの溶解バッファーのみが含まれます。ステップ3.6で説明したカスパーゼ-3活性アッセイ用の白い平底96ウェルプレートに各標準物質25 μLを追加します。 氷上でのカスパーゼ活性アッセイ用のマスター反応ミックスを調製します。1回の反応で、50 μLの2xカスパーゼ切断バッファー(0.2M HEPES pH 7.5;20%スクロースまたはPEG;0.2%チャップス)、5 μLの1 mM DEVD-AMC(カスパーゼ-3テトラペプチド基質)、2 μLの500 mM DTT、および18 μLの脱イオン水を混合します(材料の表を参照)。 75 μLの反応ミックスを各サンプルと標準物質に加え、総反応量100 μLを得ました。 ステップ5.1で設定した蛍光測定器を使用して、すぐに蛍光を測定します。 蛍光測定ごとに、サンプルの蛍光からブランク(溶解バッファーのみ)の蛍光測定値を差し引きます。サンプルのタンパク質濃度(ステップ4.5で計算)で割って読み取り値を正規化します27: y軸に正規化された蛍光の傾き、x軸に時間を決定することにより、カスパーゼ活性率を計算します。 6. カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性のシングルセルアッセイ(フローサイトメトリー解析) セクション2の説明に従ってセルをシードします。 細胞を5 mLのポリスチレンチューブに回収します。接着細胞を扱う場合は、培地を5 mLチューブに回収します。1 mLの冷たいPBSを細胞培養プレートに加え、PBSを5 mLチューブに回収します。細胞にトリプシンを加えます(6ウェルディッシュで作業する場合は100 μL)。トリプシンで細胞をプレートから持ち上げ、5 mLチューブに集めます。1 mLのコールドPBSを使用して、すべての細胞が収集されていることを確認します。注:浮遊細胞を使用する場合は、培地と細胞を5 mLチューブに静かに移します。 サンプルを300 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。 真空吸引器を使用して上清を除去します。 染色ミックスを準備します。最適な染色濃度は、50 μL中の1 x 10 6-2 x 106細胞です。製造元の指示に従って蛍光発生基質を希釈します(材料表、フローサイトメトリーを参照)。ストック基質を1 μL取り、PBS150 μLで希釈します。サンプルあたり50 uLを追加します。 サンプルを光から保護された37°Cで30分間インキュベートし、15分ごとに混合します。 この研究で使用したフローサイトメーターを使用して、640 nmの赤色レーザーを使用し、675/25 nmを使用して検出します。最初に染色されていないコントロールサンプルを実行し、目的の母集団の少なくとも10,000イベントを取得します。FSC-AおよびSSC-Aドットプロット上のゲート(P1)を使用して破片を除外します。P1ゲートのイベントとカスパーゼ基質の検出(y軸)を表示するヒストグラムを使用して、蛍光強度の中央値(MFI)を決定します。注:この方法に記載されているカスパーゼ基質は、590 nmでの励起を必要とし、628 nmで発光します。