Le présent protocole décrit deux méthodes pour mesurer l’activité des caspases à travers un substrat fluorogénique à l’aide de la cytométrie en flux ou d’un spectrofluoromètre.
L’activation des protéases de cystéine, connues sous le nom de caspases, reste un processus important dans de multiples formes de mort cellulaire. Les caspases sont des initiateurs et des bourreaux critiques de l’apoptose, la forme la plus étudiée de mort cellulaire programmée. L’apoptose survient au cours des processus de développement et est un événement nécessaire dans l’homéostasie tissulaire. La pyroptose est une autre forme de mort cellulaire qui utilise des caspases et est un processus essentiel dans l’activation du système immunitaire par l’activation de l’inflammasome, ce qui entraîne la libération de membres de la famille de l’interleukine-1 (IL-1). Pour évaluer l’activité des caspases, les substrats cibles peuvent être évalués. Cependant, la sensibilité peut être un problème lors de l’examen de cellules individuelles ou d’une activité de faible niveau. Nous démontrons comment un substrat fluorogénique peut être utilisé avec un test basé sur la population ou un test unicellulaire par cytométrie en flux. Avec des contrôles appropriés, différentes séquences d’acides aminés peuvent être utilisées pour identifier quelles caspases sont actives. En utilisant ces tests, la perte simultanée des inhibiteurs des protéines d’apoptose lors de la stimulation du facteur de nécrose tumorale (TNF) a été identifiée, ce qui induit principalement l’apoptose dans les macrophages plutôt que d’autres formes de mort cellulaire.
Les caspases sont impliquées dans plusieurs formes de mort cellulaire programmée. L’apoptose est la forme la plus étudiée de mort cellulaire programmée et est associée à l’activité de la caspase1. Toutes les caspases possèdent une sous-unité catalytique grande et petite. La caspase-1, la caspase-4, la caspase-5, la caspase-9 et la caspase-11 possèdent un domaine d’activation et de recrutement des caspases (CARD), et les caspases-8 et les caspases-10 contiennent des domaines effecteurs de mort (DED)2,3,4,5 (tableau 1). L’apoptose peut être initiée par deux voies principales: la voie extrinsèque et la voie intrinsèque. La voie apoptotique extrinsèque est déclenchée par les récepteurs de mort, qui font partie de la superfamille des facteurs de nécrose tumorale (TNFSF). Les récepteurs de la mort possèdent des domaines DED, facilitant l’activité de la caspase-86. La voie apoptotique intrinsèque implique l’activation de la caspase-9 après la formation de l’apoptosome, nécessitant la libération du cytochrome c et de l’Apaf-17. L’activation de l’une ou l’autre caspase initiatrice, la caspase-8 ou la caspase-9, conduit au clivage et à l’activation ultérieure des caspases bourreaux, qui sont la caspase-3, la caspase-6 et la caspase-7. Identifier que les caspases bourreaux sont actives indique que les cellules subissent une apoptose, et cette activation est considérée comme un facteur important dans la définition du mode de mort cellulaire.
L’activation des caspases est également un moment critique pour la régulation de l’inflammation et l’induction de formes alternatives de mort cellulaire programmée. Par exemple, l’activation de la caspase-1 conduit à la maturation des cytokines pro-inflammatoires de la famille de l’interleukine-18. La libération et l’activation des cytokines de cette famille, en particulier l’IL-1β et l’IL-18, résultent du clivage de la gasdermine D et de la formation de pores au niveau de la membrane plasmique 9,10. Une réparation membranaire inadéquate des pores de la gasdermine D peut entraîner un type de mort cellulaire connu sous le nom de pyroptose11. De plus, l’activité de la caspase-8 entraîne l’inhibition d’une mort cellulaire indépendante de la caspase connue sous le nom de nécroptose12. La protéine kinase 1 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK1) est l’un des facteurs critiques de la nécroptose et de l’inflammation régulée par NF-kB. Les modèles ont montré que RIPK1 est clivé par la caspase-8, ce qui limite la signalisation NF-kB, l’apoptose et la nécroptose13,14. Par conséquent, l’identification de l’activité des différentes caspases peut aider à comprendre l’inflammation résultante et la modalité de mort cellulaire.
Indépendamment de la fonction des caspases dans la régulation des modalités de mort cellulaire, l’activité des caspases peut également réguler d’autres familles de cytokines, telles que l’interféron (IFN), en réponse à une infection15,16. De plus, les caspases sont impliquées dans les fonctions de mort non cellulaire, y compris les décisions de devenir cellulaire, la réparation et la régénération des tissus, la tumorigenèse par la réparation de l’ADN et la fonction des synapses neuronales. On pense que l’activité des caspases dans ces rôles non létaux est limitée par la localisation cellulaire et la quantité de caspases. Par conséquent, la quantification du niveau d’activité des caspases pourrait bien définir si une cellule subit la mort cellulaire ou si la caspase joue un rôle dans une fonction de mort non cellulaire 4,17,18.
L’activité des caspases peut être évaluée par plusieurs méthodes. Le transfert Western pour les caspases clivées et leurs substrats a été utilisé comme indicateur d’activité, mais ces tests sont au mieux qualitatifs. Pour déterminer si l’activité des caspases est associée à la mort cellulaire, une mesure quantitative est idéale. Étant donné que les caspases clivent les substrats sur un site de reconnaissance composé de quatre acides aminés, des méthodes colorimétriques, luminescentes ou fluorométriques ont été développées. Cependant, les caspases semblent avoir une plasticité dans leur reconnaissance de substrat19,20. La séquence de reconnaissance n’est pas associée aux domaines protéiques (tableau 1). La séquence tétrapeptidique DEVD, cependant, peut être utilisée pour détecter l’activité de la caspase-3 et de la caspase-720,21.
Les mimétiques Smac sont des composés ciblant les inhibiteurs des protéines d’apoptose (IAP). L’utilisation de mimétiques Smac dans un sous-ensemble de cellules cancéreuses rend les cellules sensibles à la mort cellulaire induite par le TNF22. Dans les macrophages primaires, les mimétiques Smac provoquent la mort cellulaire sans l’ajout exogène de TNF23,24. La perte de cIAP1 par la dégradation induite par les mimétiques de Smac entraîne la production de TNF. Si l’activité de la caspase est détectée, cela signifie que les cellules ne sont pas mortes par nécroptose mais de manière apoptotique. Dans cette méthode, la détection du substrat DEVD clivé est utilisée pour identifier l’activité de la caspase-3/caspase-7. D’autres expériences pour confirmer la mort cellulaire apoptotique ont été publiées précédemment24.
Dans cette méthode, un substrat fluorogénique est utilisé dans un test basé sur la population ou une analyse unicellulaire pour mesurer l’activité de la caspase-3/caspase-7. Les deux méthodes mesurent l’activité de la caspase de manière quantitative en fonction du clivage d’un substrat. Un avantage est la possibilité d’utiliser ces méthodes pour de nombreux échantillons. Avec ces méthodes, l’activité de la caspase-3/caspase-7 est détectée dans les macrophages primaires traités avec des mimétiques Smac.
Un aspect essentiel du test fluorométrique basé sur la population est le temps écoulé entre la lyse et la lecture de la fluorescence. Les échantillons doivent être conservés sur la glace tout au long de la procédure, en particulier avant de « lire » l’essai. Cela empêche le clivage prématuré et la fluorescence du substrat. En utilisant le test basé sur la population, moins d’optimisation peut être nécessaire. La quantité de protéines utilisée dans le test est normalisée, ce qui permet de comparer directement les échantillons. Une mise en garde est qu’à un stade avancé de la mort cellulaire apoptotique, la quantité totale de protéines est réduite; Par conséquent, la détection de l’activité des caspases peut ne pas être possible. Différentes cinétiques ou différentes doses de traitement sont recommandées pour contourner ce problème. En outre, d’autres logiciels peuvent être utilisés pour évaluer avec précision le taux d’activité des caspases en plus du logiciel décrit dans cette méthode.
Pour le test cytométrique en flux, suffisamment d’événements ou de cellules sont nécessaires pour contrôler les populations en toute confiance. En outre, une optimisation plus poussée du test basé sur le flux peut être nécessaire pour obtenir le rapport optimal entre le substrat et le nombre de cellules. Cependant, avec la cytométrie en flux, cette méthode se prête à la mesure de paramètres supplémentaires, tels que les marqueurs de surface cellulaire pour l’identification du type cellulaire.
La méthode de population et la méthode unicellulaire pourraient être utilisées pour d’autres caspases. Cependant, il est important de se rappeler que la séquence de reconnaissance est moins discriminée pour les autres caspases. Par conséquent, d’autres méthodes d’activité des caspases doivent être utilisées. Cela inclut l’inhibition de l’activité des caspases, CRISPR ou knock-down de caspases spécifiques, et le Western blot pour détecter le clivage de substrats connus.
Une méthode alternative pour détecter l’activité des caspases est l’imagerie accélérée. Le même substrat de caspase perméable pourrait être utilisé avec d’autres marqueurs de viabilité, tels que l’annexine V, pour fournir des informations sur la cinétique de la mort cellulaire. L’imagerie séparerait également l’activité des caspases et la survie cellulaire, permettant la détection de quantités sublétales d’activité des caspases dans une population cellulaire. Les fonctions non létales de la caspase-3/caspase-7 sont liées à la régulation antivirale dans les cellules immunitaires innées29, en particulier l’activation de l’IFN de type I via la libération de l’ADN mitochondrial15,16. Ainsi, ces tests pour mesurer l’activité des caspases sont essentiels pour identifier différents modes de mort cellulaire et peuvent être utiles pour évaluer les fonctions de mort non cellulaire.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. est soutenu par la subvention Clöetta Medical Research Fellow, S.R. est soutenu par le CanDoc UZH Forschungskredit, et J.T. est soutenu par le Chinese Scholarship Council.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |