Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.
De activering van cysteïneproteasen, bekend als caspasen, blijft een belangrijk proces in meerdere vormen van celdood. Caspasen zijn kritische initiators en beulen van apoptose, de meest bestudeerde vorm van geprogrammeerde celdood. Apoptose treedt op tijdens ontwikkelingsprocessen en is een noodzakelijke gebeurtenis in weefselhomeostase. Pyroptose is een andere vorm van celdood die caspasen gebruikt en is een cruciaal proces bij het activeren van het immuunsysteem door de activering van het inflammasoom, wat resulteert in de afgifte van leden van de interleukine-1 (IL-1) familie. Om de caspase-activiteit te beoordelen, kunnen doelsubstraten worden beoordeeld. Gevoeligheid kan echter een probleem zijn bij het onderzoeken van afzonderlijke cellen of activiteit op laag niveau. We laten zien hoe een fluorogeen substraat kan worden gebruikt met een populatiegebaseerde test of eencellige test door flowcytometrie. Met de juiste controles kunnen verschillende aminozuursequenties worden gebruikt om te identificeren welke caspasen actief zijn. Met behulp van deze testen is het gelijktijdige verlies van de remmers van apoptose-eiwitten bij tumornecrosefactor (TNF) stimulatie geïdentificeerd, die voornamelijk apoptose induceert in macrofagen in plaats van andere vormen van celdood.
Caspasen zijn betrokken bij verschillende vormen van geprogrammeerde celdood. Apoptose is de meest bestudeerde vorm van geprogrammeerde celdood en is geassocieerd met caspase-activiteit1. Alle caspasen bezitten een grote en kleine katalytische subeenheid. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 en caspase-11 bezitten een caspase activatie- en rekruteringsdomein (CARD), en caspase-8 en caspase-10 bevatten death effector domains (DED)2,3,4,5 (Tabel 1). Apoptose kan worden geïnitieerd door twee belangrijke paden: de extrinsieke route en de intrinsieke route. De extrinsieke apoptotische route wordt geactiveerd door doodsreceptoren, die deel uitmaken van de tumornecrosefactor superfamilie (TNFSF). Doodsreceptoren bezitten DED-domeinen, waardoor caspase-8-activiteitwordt vergemakkelijkt 6. De intrinsieke apoptotische route omvat de activering van caspase-9 na de vorming van het apoptosoom, waarbij cytochroom c en Apaf-17 moeten vrijkomen. De activering van initiator caspase, caspase-8 of caspase-9, leidt tot de splitsing en daaropvolgende activering van de beul caspasen, die caspase-3, caspase-6 en caspase-7 zijn. Identificeren dat de beul caspasen actief zijn, geeft aan dat de cellen apoptose ondergaan, en deze activering wordt beschouwd als een belangrijke factor bij het definiëren van de modus van celdood.
Caspase-activering is ook een kritiek moment voor het reguleren van ontstekingen en de inductie van alternatieve vormen van geprogrammeerde celdood. Caspase-1-activering leidt bijvoorbeeld tot de rijping van pro-inflammatoire cytokines van de interleukine-1-familie8. De afgifte en activering van cytokines uit deze familie, met name IL-1β en IL-18, zijn het gevolg van gasdermine D-splitsing en porievorming bij het plasmamembraan 9,10. Onvoldoende membraanherstel van gasdermine D-poriën kan leiden tot een soort celdood die bekend staat als pyroptose11. Bovendien resulteert caspase-8-activiteit in de remming van een caspase-onafhankelijke celdood die bekend staat als necroptosis12. Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 1 (RIPK1) is een van de kritische factoren bij necroptose en bij het veroorzaken van ontstekingen gereguleerd door NF-kB. Modellen hebben aangetoond dat RIPK1 wordt gesplitst door caspase-8, wat resulteert in het beperken van NF-kB-signalering, apoptose en necroptose13,14. Daarom kan het identificeren van de activiteit van verschillende caspasen helpen bij het begrijpen van de resulterende ontsteking en celdoodmodaliteit.
Onafhankelijk van de functie van caspasen bij het reguleren van celdoodmodaliteiten, kan caspase-activiteit ook andere cytokinefamilies reguleren, zoals interferon (IFN), als reactie op infectie15,16. Bovendien zijn caspasen betrokken bij niet-celdoodfuncties, waaronder beslissingen over het lot van cellen, weefselherstel en -regeneratie, tumorigenese door DNA-reparatie en neuronale synapsfunctie. De activiteit van caspasen in deze niet-dodelijke rollen wordt verondersteld te worden beperkt door de cellulaire lokalisatie en hoeveelheid caspasen. Daarom kan het kwantificeren van het niveau van caspase-activiteit heel goed bepalen of een cel celdood ondergaat of dat de caspase een rol speelt in een niet-celdoodfunctie 4,17,18.
Caspase-activiteit kan op meerdere manieren worden beoordeeld. Western blotting voor gespleten caspasen en hun substraten is gebruikt als een indicator van activiteit, maar deze testen zijn op zijn best kwalitatief. Om te bepalen of caspase-activiteit geassocieerd is met celdood, is een kwantitatieve meting ideaal. Omdat caspasen substraten splitsen op een herkenningsplaats die bestaat uit vier aminozuren, zijn colorimetrische, luminescentie- of fluorometrische methoden ontwikkeld. Caspasen lijken echter plasticiteit in hun substraatherkenning te hebben 19,20. De herkenningsvolgorde is niet geassocieerd met de eiwitdomeinen (tabel 1). De tetrapeptidesequentie DEVD kan echter worden gebruikt om caspase-3 en caspase-7 activiteit20,21 te detecteren.
Smac mimetica zijn verbindingen die zich richten op de remmers van apoptose-eiwitten (IAP’s). Het gebruik van Smac-mimetica in een subset van kankercellen zorgt ervoor dat de cellen gevoelig worden voor TNF-geïnduceerde celdood22. In primaire macrofagen veroorzaken Smac-mimetica celdood zonder de exogene toevoeging van TNF 23,24. Het verlies van cIAP1 door Smac mimetisch geïnduceerde afbraak resulteert in de productie van TNF. Als caspase-activiteit wordt gedetecteerd, betekent dit dat de cellen niet zijn gestorven door necroptose, maar op een apoptotische manier. In deze methode wordt de detectie van gespleten DEVD-substraat gebruikt om caspase-3/caspase-7-activiteit te identificeren. Verdere experimenten om apoptotische celdood te bevestigen zijn eerder gepubliceerd24.
Bij deze methode wordt een fluorogeen substraat gebruikt in een populatiegebaseerde test of eencellige analyse om caspase-3/caspase-7-activiteit te meten. Beide methoden meten de caspase-activiteit op een kwantitatieve manier op basis van de splitsing van een substraat. Een voordeel is de mogelijkheid om deze methoden te gebruiken voor tal van monsters. Met deze methoden wordt caspase-3/caspase-7 activiteit gedetecteerd in primaire macrofagen behandeld met Smac mimetica.
Een cruciaal aspect van de populatiegebaseerde fluorometrische test is de tijd van lysis tot het lezen van de fluorescentie. De monsters moeten gedurende de hele procedure op ijs worden bewaard, met name voordat de test wordt “afgelezen”. Dit voorkomt voortijdige splitsing en fluorescentie van het substraat. Met behulp van de populatiegebaseerde test kan minder optimalisatie nodig zijn. De hoeveelheid eiwit die in de test wordt gebruikt, wordt genormaliseerd, waardoor de monsters direct kunnen worden vergeleken. Een voorbehoud is dat in een laat stadium van apoptotische celdood de totale eiwithoeveelheid wordt verminderd; daarom is de detectie van caspase-activiteit mogelijk niet mogelijk. Verschillende kinetiek of verschillende behandelingsdoses worden aanbevolen om dit probleem te omzeilen. Bovendien kan andere software worden gebruikt om de snelheid van caspase-activiteit nauwkeurig te beoordelen naast de software die in deze methode wordt beschreven.
Voor de flowcytometrische test zijn voldoende gebeurtenissen of cellen nodig om de populaties met vertrouwen te sluiten. Bovendien kan meer optimalisatie in de op stroming gebaseerde test nodig zijn om de optimale verhouding tussen substraat en celgetal te bereiken. Met flowcytometrie leent deze methode zich echter voor het meten van aanvullende parameters, zoals celoppervlakmarkers voor celtype-identificatie.
Zowel de populatie als eencellige methoden kunnen worden gebruikt voor andere caspasen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat de herkenningsvolgorde minder wordt gediscrimineerd voor andere caspasen. Als zodanig moeten andere methoden voor caspase-activiteit worden gebruikt. Dit omvat de remming van caspase-activiteit, CRISPR of knock-down van specifieke caspasen en western blotting om de splitsing van bekende substraten te detecteren.
Een alternatieve methode voor het detecteren van caspase-activiteit is time-lapse imaging. Hetzelfde doorlatende caspase-substraat kan samen met andere markers van levensvatbaarheid, zoals annexine V, worden gebruikt om informatie te verstrekken over de kinetiek van celdood. Beeldvorming zou ook de caspase-activiteit en celoverleving scheiden, waardoor subletale hoeveelheden caspase-activiteit in een celpopulatie kunnen worden gedetecteerd. De niet-letale functies van caspase-3/caspase-7 zijn gekoppeld aan antivirale regulatie in aangeboren immuuncellen29, met name de activering van type I IFN via mitochondriale DNA-afgifte15,16. Deze testen om caspase-activiteit te meten zijn dus van cruciaal belang voor het identificeren van verschillende manieren van celdood en kunnen nuttig zijn bij het beoordelen van niet-celdoodfuncties.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. wordt ondersteund door de Clöetta Medical Research Fellow-beurs, S.R. wordt ondersteund door de CanDoc UZH Forschungskredit en J.T. wordt ondersteund door de Chinese Scholarship Council.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |