قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقتين لقياس نشاط الكاسباس من خلال ركيزة فلورية باستخدام قياس التدفق الخلوي أو مقياس الطيف الفلوري.
Abstract
لا يزال تنشيط بروتياز السيستين ، المعروف باسم caspases ، عملية مهمة في أشكال متعددة من موت الخلايا. Caspases هي المبادرين والجلادين الحرجة لموت الخلايا المبرمج ، وهو الشكل الأكثر دراسة لموت الخلايا المبرمج. يحدث موت الخلايا المبرمج أثناء العمليات التنموية وهو حدث ضروري في توازن الأنسجة. Pyroptosis هو شكل آخر من أشكال موت الخلايا التي تستخدم caspases وهي عملية حاسمة في تنشيط الجهاز المناعي من خلال تنشيط الالتهاب ، مما يؤدي إلى إطلاق أفراد عائلة interleukin-1 (IL-1). لتقييم نشاط caspase ، يمكن تقييم الركائز المستهدفة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الحساسية مشكلة عند فحص الخلايا المفردة أو النشاط منخفض المستوى. نوضح كيف يمكن استخدام الركيزة الفلورية مع مقايسة سكانية أو مقايسة أحادية الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. مع الضوابط المناسبة ، يمكن استخدام تسلسلات مختلفة من الأحماض الأمينية لتحديد الكاسباس النشط. باستخدام هذه المقايسات ، تم تحديد الخسارة المتزامنة لمثبطات بروتينات موت الخلايا المبرمج عند تحفيز عامل نخر الورم (TNF) ، والذي يؤدي في المقام الأول إلى موت الخلايا المبرمج في الضامة بدلا من الأشكال الأخرى لموت الخلايا.
Introduction
تشارك Caspases في عدة أشكال من موت الخلايا المبرمج. موت الخلايا المبرمج هو الشكل الأكثر دراسة لموت الخلايا المبرمج ويرتبط بنشاط الكاسباز1. تمتلك جميع الكاسباس وحدة فرعية تحفيزية كبيرة وصغيرة. يمتلك Caspase-1 و caspase-4 و caspase-5 و caspase-9 و caspase-11 مجال تنشيط وتجنيد caspase (CARD) ، ويحتوي caspase-8 و caspase-10 على مجالات مستجيب الموت (DED) 2،3،4،5 (الجدول 1). يمكن أن يبدأ موت الخلايا المبرمج من خلال مسارين رئيسيين: المسار الخارجي والمسار الداخلي. يتم تشغيل مسار موت الخلايا المبرمج الخارجي بواسطة مستقبلات الموت ، والتي تعد جزءا من عائلة عامل نخر الورم (TNFSF). تمتلك مستقبلات الموت مجالات DED ، مما يسهل نشاط caspase-86. يتضمن مسار موت الخلايا المبرمج الجوهري تنشيط caspase-9 بعد تكوين apoptosome ، مما يتطلب إطلاق السيتوكروم c و Apaf-17. يؤدي تنشيط أي من كاسباز البادئ أو كاسباس -8 أو كاسباس -9 إلى الانقسام والتنشيط اللاحق لكاسباس الجلاد ، وهي كاسباس -3 وكاسباس -6 وكاسباس -7. يشير تحديد أن كاسباس الجلاد نشط إلى أن الخلايا تخضع لموت الخلايا المبرمج ، ويعتبر هذا التنشيط عاملا مهما في تحديد طريقة موت الخلايا.
يعد تنشيط Caspase أيضا منعطفا حاسما لتنظيم الالتهاب وتحريض أشكال بديلة من موت الخلايا المبرمج. على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط caspase-1 إلى نضوج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في عائلة interleukin-18. ينتج إطلاق وتنشيط السيتوكينات من هذه العائلة ، وخاصة IL-1β و IL-18 ، عن انشقاق gasdermin D وتكوين المسام في غشاء البلازما 9,10. يمكن أن يؤدي الإصلاح غير الكافي لغشاء مسام gasdermin D إلى نوع من موت الخلايا يعرف باسم pyroptosis11. علاوة على ذلك ، يؤدي نشاط caspase-8 إلى تثبيط موت الخلايا المستقلة عن caspase المعروف باسم necroptosis12. يعد بروتين سيرين / ثريونين كيناز 1 (RIPK1) المتفاعل مع المستقبلات أحد العوامل الحاسمة في التنخر وفي الالتهاب الدافع الذي ينظمه NF-kB. أظهرت النماذج أن RIPK1 مشقوق بواسطة caspase-8 ، مما يؤدي إلى الحد من إشارات NF-kB ، وموت الخلايا المبرمج ، والتنخر13،14. لذلك ، يمكن أن يساعد تحديد نشاط الكاسباسات المختلفة في فهم الالتهاب الناتج وطريقة موت الخلايا.
بغض النظر عن وظيفة الكاسباز في تنظيم طرق موت الخلايا ، يمكن لنشاط الكاسباز أيضا تنظيم عائلات السيتوكينات الأخرى ، مثل الإنترفيرون (IFN) ، استجابة للعدوى15,16. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك الكاسباز في وظائف الموت غير الخلوي ، بما في ذلك قرارات مصير الخلية ، وإصلاح الأنسجة وتجديدها ، وتكوين الأورام من خلال إصلاح الحمض النووي ، ووظيفة المشبك العصبي. يعتقد أن نشاط الكاسباز في هذه الأدوار غير القاتلة محدود بسبب التوطين الخلوي وكمية الكاسباز. لذلك ، فإن تحديد مستوى نشاط الكاسباز قد يحدد جيدا ما إذا كانت الخلية تخضع لموت الخلية أو ما إذا كان الكاسباز يلعب دورا في وظيفة موت غير الخلية4،17،18.
يمكن تقييم نشاط Caspase بطرق متعددة. تم استخدام النشاف الغربي للكاسباس المشقوق وركائزها كمؤشر للنشاط ، ولكن هذه المقايسات نوعية في أحسن الأحوال. لتحديد ما إذا كان نشاط الكاسباز مرتبطا بموت الخلايا ، يكون القياس الكمي مثاليا. نظرا لأن الكاسباس يشق ركائز في موقع التعرف الذي يتكون من أربعة أحماض أمينية ، فقد تم تطوير طرق قياس الألوان أو التلألؤ أو القياس الفلوري. ومع ذلك ، يبدو أن الكاسباز لديه مرونة في التعرف على الركيزة 19,20. لا يرتبط تسلسل التعرف بمجالات البروتين (الجدول 1). ومع ذلك ، يمكن استخدام تسلسل رباعي الببتيد DEVD للكشف عن نشاط caspase-3 و caspase-720,21.
محاكيات Smac هي مركبات تستهدف مثبطات بروتينات موت الخلايا المبرمج (IAPs). يؤدي استخدام محاكيات Smac في مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية إلى أن تصبح الخلايا حساسة لموت الخلايا الناجم عن عامل نخر الورم22. في الضامة الأولية ، تسبب محاكيات Smac موت الخلايا دون إضافة خارجية لعامل نخر الورم23,24. يؤدي فقدان cIAP1 عن طريق التحلل الناجم عن محاكاة Smac إلى إنتاج عامل نخر الورم. إذا تم الكشف عن نشاط caspase ، فهذا يعني أن الخلايا لم تموت عن طريق necroptosis ولكن بطريقة موت الخلايا المبرمج. في هذه الطريقة ، يتم استخدام الكشف عن ركيزة DEVD المشقوقة لتحديد نشاط caspase-3 / caspase-7. تم نشر المزيد من التجارب لتأكيد موت الخلايا المبرمج سابقا24.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الطريقة ، يتم استخدام الركيزة الفلورية في الفحص القائم على السكان أو تحليل الخلية الواحدة لقياس نشاط caspase-3 / caspase-7. تقيس كلتا الطريقتين نشاط الكاسباز بطريقة كمية بناء على انشقاق الركيزة. ميزة واحدة هي القدرة على استخدام هذه الأساليب للعديد من العينات. باستخدام هذه الطرق ، يتم الكشف عن نشاط caspase-3 / caspase-7 في البلاعم الأولية المعالجة بمحاكاة Smac.
أحد الجوانب الحاسمة للمقايسة الفلورومترية القائمة على السكان هو الوقت من التحلل إلى قراءة التألق. يجب الاحتفاظ بالعينات على الجليد طوال الإجراء ، خاصة قبل “قراءة” الفحص. هذا يمنع الانقسام المبكر ومضان الركيزة. باستخدام الفحص القائم على السكان ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين أقل. يتم تطبيع كمية البروتين المستخدمة في الفحص ، مما يسمح بمقارنة العينات مباشرة. أحد التحذيرات هو أنه في مرحلة متأخرة من موت الخلايا المبرمج ، يتم تقليل إجمالي كمية البروتين. وبالتالي ، قد لا يكون الكشف عن نشاط Caspase ممكنا. يوصى بحركية مختلفة أو جرعات علاج مختلفة للتحايل على هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام برامج أخرى لتقييم معدل نشاط caspase بدقة إلى جانب البرنامج الموضح في هذه الطريقة.
بالنسبة لفحص قياس التدفق الخلوي ، يلزم وجود أحداث أو خلايا كافية لبوابة السكان بثقة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين في الفحص القائم على التدفق لتحقيق النسبة المثلى من الركيزة إلى رقم الخلية. ومع ذلك ، مع قياس التدفق الخلوي ، فإن هذه الطريقة تفسح المجال لقياس معلمات إضافية ، مثل علامات سطح الخلية لتحديد نوع الخلية.
يمكن استخدام كل من السكان وطرق الخلية الواحدة لكاسباسات أخرى. ومع ذلك ، من المهم أن تتذكر أن تسلسل التعرف أقل تمييزا بالنسبة للكاسباسات الأخرى. على هذا النحو ، يجب استخدام طرق أخرى لنشاط caspase. وهذا يشمل تثبيط نشاط الكاسباز ، كريسبر أو ضربة قاضية لكاسباس معينة ، والنشاف الغربي للكشف عن انشقاق الركائز المعروفة.
إحدى الطرق البديلة للكشف عن نشاط الكاسباز هي التصوير بفاصل زمني. يمكن استخدام نفس ركيزة الكاسباز القابلة للنفاذ جنبا إلى جنب مع علامات أخرى للصلاحية ، مثل الملحق الخامس ، لتوفير معلومات عن حركية موت الخلايا. سيفصل التصوير أيضا نشاط الكاسباز وبقاء الخلية ، مما يسمح بالكشف عن الكميات شبه المميتة من نشاط الكاسباز في مجموعة الخلايا. ترتبط الوظائف غير المميتة ل caspase-3 / caspase-7 بالتنظيم المضاد للفيروسات في الخلايا المناعية الفطرية29 ، وخاصة تنشيط النوع الأول IFN عبر إطلاق الحمض النووي للميتوكوندريا15,16. وبالتالي ، فإن هذه المقايسات لقياس نشاط الكاسباز ضرورية لتحديد الأنماط المختلفة لموت الخلايا وقد تكون مفيدة في تقييم وظائف الموت غير الخلوي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم WWW من خلال منحة زميل أبحاث طبية Clöetta ، ويتم دعم SR من قبل CanDoc UZH Forschungskredit ، ويتم دعم JT من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني.
Materials
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| 15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
| 37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
| 6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
| 96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
| 96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
| Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
| BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
| b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
| caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
| CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
| DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
| EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
| Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
| FBS | Thermoscientific | 26140 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
| Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
| M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
| M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
| protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
| Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
| sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
| sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
| Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
| sucrose | Sigma | 1.07687 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |
References
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Nicholson, D. W., Thornberry, N. A. Caspases: Killer proteases. Trends in Biochemical Sciences. 22 (8), 299-306 (1997).
- Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
- Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -. D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
- Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
- Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
- Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
- Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
- White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
- Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
- Nakajima, Y. -. I., Kuranaga, E. Caspase-dependent non-apoptotic processes in development. Cell Death and Differentiation. 24, 1422-1430 (2017).
- Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
- Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
- McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
- Wong, W. W. -. L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631 (2015).
- Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
- . Caspase activity assay buffer. Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).
- Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) – Including Dunnett’s and Tukey’s follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , 93-103 (2018).
- Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).
