Настоящий протокол описывает два метода измерения активности каспазы через фторогенный субстрат с использованием проточной цитометрии или спектрофлуорометра.
Активация цистеиновых протеаз, известных как каспазы, остается важным процессом при множественных формах гибели клеток. Каспазы являются критическими инициаторами и палачами апоптоза, наиболее изученной формы запрограммированной гибели клеток. Апоптоз возникает во время процессов развития и является необходимым событием в тканевом гомеостазе. Пироптоз является еще одной формой гибели клеток, которая использует каспазы и является критическим процессом в активации иммунной системы путем активации инфламмасомы, что приводит к высвобождению членов семейства интерлейкина-1 (IL-1). Для оценки активности каспазы могут быть оценены целевые субстраты. Тем не менее, чувствительность может быть проблемой при исследовании отдельных клеток или низкоуровневой активности. Мы демонстрируем, как фторгенный субстрат может быть использован с популяционным анализом или одноклеточным анализом с помощью проточной цитометрии. При правильном контроле различные аминокислотные последовательности могут быть использованы для определения того, какие каспазы активны. С помощью этих анализов была выявлена одновременная потеря ингибиторов белков апоптоза при стимуляции фактора некроза опухоли (TNF), которая в первую очередь индуцирует апоптоз в макрофагах, а не другие формы гибели клеток.
Каспазы участвуют в нескольких формах запрограммированной гибели клеток. Апоптоз является наиболее изученной формой запрограммированной гибели клеток и связан с активностью каспазы1. Все каспазы обладают большой и малой каталитической субъединицей. Каспаза-1, каспаза-4, каспаза-5, каспаза-9 и каспаза-11 обладают доменом активации и рекрутирования каспазы (CARD), а каспаза-8 и каспаза-10 содержат эффекторные домены смерти (DED)2,3,4,5 (таблица 1). Апоптоз может быть инициирован двумя основными путями: внешним путем и внутренним путем. Внешний апоптотический путь запускается рецепторами смерти, которые являются частью суперсемейства фактора некроза опухоли (TNFSF). Рецепторы смерти обладают доменами DED, облегчающими активность каспазы-86. Внутренний апоптотический путь включает активацию каспазы-9 после образования апоптосомы, требующей высвобождения цитохрома c и Apaf-17. Активация либо инициатора каспазы, каспазы-8, либо каспазы-9, приводит к расщеплению и последующей активации каспаз палача, которыми являются каспаза-3, каспаза-6 и каспаза-7. Выявление того, что каспазы палача активны, указывает на то, что клетки подвергаются апоптозу, и эта активация считается важным фактором в определении режима гибели клеток.
Активация каспазы также является критическим моментом для регулирования воспаления и индукции альтернативных форм запрограммированной гибели клеток. Например, активация каспазы-1 приводит к созреванию провоспалительных цитокинов семейства интерлейкинов-18. Высвобождение и активация цитокинов из этого семейства, в частности IL-1β и IL-18, являются результатом расщепления гасдермина D и образования пор на плазматической мембране 9,10. Неадекватная мембранная репарация пор гасдермина D может привести к типу гибели клеток, известному как пироптоз11. Кроме того, активность каспазы-8 приводит к ингибированию казпазо-независимой гибели клеток, известной как некроптоз12. Рецептор-взаимодействующая серин/треонин протеинкиназа 1 (RIPK1) является одним из критических факторов в некроптозе и в управлении воспалением, регулируемым NF-kB. Модели показали, что RIPK1 расщепляется каспазой-8, что приводит к ограничению передачи сигналов NF-kB, апоптоза и некроптоза13,14. Таким образом, идентификация активности различных каспаз может помочь в понимании результирующей формы воспаления и гибели клеток.
Независимо от функции каспаз в регулировании модальностей гибели клеток, активность каспазы может также регулировать другие семейства цитокинов, такие как интерферон (IFN), в ответ на инфекцию15,16. Кроме того, каспазы участвуют в функциях неклеточной гибели, включая решения о судьбе клеток, восстановление и регенерацию тканей, опухолевый генез через репарацию ДНК и функцию нейронального синапса. Считается, что активность каспаз в этих нелетальных ролях ограничена клеточной локализацией и количеством каспаз. Таким образом, количественная оценка уровня активности каспазы вполне может определить, подвергается ли клетка гибели клеток или же каспаза играет роль в функции неклеточной гибели 4,17,18.
Активность каспазы может быть оценена несколькими методами. Вестерн-блоттинг для расщепленных каспаз и их субстратов использовался в качестве индикатора активности, но эти анализы в лучшем случае качественные. Чтобы определить, связана ли активность каспазы с гибелью клеток, идеально подходит количественное измерение. Поскольку каспазы расщепляют субстраты в месте распознавания, состоящем из четырех аминокислот, были разработаны колориметрические, люминесцентные или флуорометрические методы. Тем не менее, каспазы, по-видимому, имеют пластичность в распознавании подложки19,20. Последовательность распознавания не связана с белковыми доменами (табл. 1). Тетрапептидная последовательность DEVD, однако, может быть использована для обнаружения активности каспазы-3 и каспазы-7 20,21.
Миметики Smac представляют собой соединения, нацеленные на ингибиторы белков апоптоза (IAP). Использование миметиков Smac в подмножестве раковых клеток приводит к тому, что клетки становятся чувствительными к гибели клеток, индуцированной TNF22. В первичных макрофагах миметики Smac вызывают гибель клеток без экзогенного добавления TNF23,24. Потеря cIAP1 в результате деградации, вызванной миметикой Smac, приводит к образованию TNF. Если обнаружена активность каспазы, это означает, что клетки погибли не некроптозом, а апоптотическим способом. В этом методе обнаружение расщепленного СУБСТРАТА DEVD используется для идентификации активности каспазы-3/каспазы-7. Дальнейшие эксперименты по подтверждению апоптотической гибели клеток были опубликованы ранее24.
В этом методе фторогенный субстрат используется в популяционном анализе или одноклеточном анализе для измерения активности каспазы-3/каспазы-7. Оба метода количественно измеряют активность каспазы на основе расщепления субстрата. Одним из преимуществ является возможность использования этих методов для многочисленных образцов. С помощью этих методов активность каспазы-3/каспазы-7 обнаруживается в первичных макрофагах, обработанных миметиками Smac.
Критическим аспектом популяционного флуорометрического анализа является время от лизиса до считывания флуоресценции. Образцы должны храниться на льду на протяжении всей процедуры, особенно перед «чтением» анализа. Это предотвращает преждевременное расщепление и флуоресценцию субстрата. При использовании популяционного анализа может потребоваться меньшая оптимизация. Количество белка, используемого в анализе, нормализуется, что позволяет напрямую сравнивать образцы. Одно из предостережений заключается в том, что на поздней стадии апоптотической гибели клеток общее количество белка уменьшается; следовательно, обнаружение активности каспазы может быть невозможным. Для обхода этой проблемы рекомендуется разная кинетика или разные дозы лечения. Кроме того, для точной оценки скорости активности каспазы может использоваться другое программное обеспечение, помимо программного обеспечения, описанного в этом методе.
Для цитометрического анализа потока требуется достаточно событий или клеток, чтобы уверенно охватить популяции. Кроме того, для достижения оптимального соотношения количества субстрата и количества ячеек может потребоваться дополнительная оптимизация в анализе на основе потока. Однако при проточной цитометрии этот метод позволяет измерять дополнительные параметры, такие как маркеры поверхности клеток для идентификации типа клеток.
Как популяционный, так и одноклеточный методы могут быть использованы для других каспаз. Однако важно помнить, что последовательность распознавания менее дискриминируется для других каспаз. Таким образом, должны использоваться другие методы активности каспазы. Это включает в себя ингибирование активности каспазы, CRISPR или сбивание конкретных каспаз и западное блоттинг для обнаружения расщепления известных субстратов.
Одним из альтернативных методов обнаружения активности каспазы является покадровая визуализация. Тот же проницаемый подложек каспазы может быть использован вместе с другими маркерами жизнеспособности, такими как аннексин V, для предоставления информации о кинетике гибели клеток. Визуализация также будет разделять активность каспазы и выживаемость клеток, что позволяет обнаруживать сублетальные количества активности каспазы в клеточной популяции. Нелетальные функции каспазы-3/каспазы-7 связаны с противовирусной регуляцией во врожденных иммунных клетках29, в частности с активацией ИФН типа I через высвобождение митохондриальной ДНК15,16. Таким образом, эти анализы для измерения активности каспазы имеют решающее значение для выявления различных режимов гибели клеток и могут быть полезны при оценке функций неклеточной гибели.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. поддерживается грантом Clöetta Medical Research Fellow, S.R. поддерживается CanDoc UZH Forschungskredit, а J.T. поддерживается Китайским советом по стипендиям.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |