מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

המחקר הנוכחי בוצע באישור ובהתאם להנחיות הוועדה האתית לבעלי חיים של אוניברסיטת ציריך (#ZH149/19). עכברי C57Bl/6J זכרים בגילאי 8-16 שבועות, שגודלו ושוכנו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגן (SPF), שימשו במחקר הנוכחי. העצמות השלמות יכולות להישמר על קרח בתמיסת מלח חוצצת סטרילית של האנק (HBSS) עם 2% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS). מח עצם נאסף מעצם הירך והטיביה של העכבר25 ביום ההתמיינות. שתי השיטות להערכת פעילות קספז יכולות לשמש עבור סוגי תאים אחרים, כולל ראשוניים ומותמרים. 1. הבחנה בין מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) הערה: בצע את כל השלבים במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה, והשתמש בטכניקות אספטיות סטריליות. הכינו מזרק 1 מ”ל עם מחט 21 גרם. הוסף 5 מ”ל HBSS + 2% FBS לצינור 15 מ”ל. בעזרת מלקחיים סטריליים, לוקחים עצם ירך נכרתה, ומחדירים את המחט לפתח עצם הירך. מחזיקים את עצם הירך ב- HBSS + 2% FBS, שוטפים את מח העצם החוצה עד שהעצם לבנה. שוטפים את השוקה באותו אופן. המשך לשטוף את הפתרון כדי להשיג השעיה של תא יחיד. צנטריפוגה את המתלה החד-תאי במהירות של 200 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הסר את supernatant באמצעות שואב ואקום. הקש על הצינור כדי להשהות מחדש בעדינות את הכדור. הוסיפו 1 מ”ל של חיץ ליזה של תאים אדומים (ראו טבלת חומרים) וערבבו בעדינות עם פיפטה P1,000. יש לדגור ב-RT למשך דקה. הוסף 10 מ”ל HBSS + 2% FBS, וצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 4 דקות ב- RT. הסר את הסופרנטנט, והשהה מחדש ב- 10 מ”ל של מדיום תרבית מקרופאגים שמקורו במח עצם (BMDM).הערה: מדיום תרבית BMDM מורכב מ-DMEM דל גלוקוז בתוספת של 10% FBS, 20 נ”ג/מ”ל M-CSF, פניצילין (50 U/mL) וסטרפטומיצין (50 מיקרוגרם/מ”ל) (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן להחליף 20% מדיום מותנה L929 ב- M-CSF. הוסיפו 15 מ”ל של מדיום תרבית BMDM לשתי צלחות פטרי בקוטר 15 ס”מ. הוסף 5 מ”ל של תמיסת התא הבודד לכל צלחת.הערה: אין להשתמש בצלחות שטופלו בתרבית רקמות. צלחות המטופלות בתרבית רקמות מגבילות את ההתבדלות. מניחים את הכלים ב 37 ° C, 5% CO2, במשך 6 ימים.הערה: ניתן לקצור את BMDMs לאחר 5-7 ימים. זמני דגירה ארוכים יותר להתמיינות מובילים לביטוי מוגבר של חלבון אנטי-אפופטוטי26. 2. קציר, זריעה וטיפול בתאים הערה: בצע את כל השלבים במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה, והשתמש בטכניקות אספטיות סטריליות. מקרופאגים ממוינים לחלוטין נצמדים לצלחת, ומאפשרים הפרדה קלה, בעוד תאים צפים יכולים להיזרק לפח. ניתן להשתמש במי מלח חוצצי פוספט (PBS) עם או בלי Ca2 + ו- Mg2+. לאחר 6 ימי דגירה, מוציאים את התאים הצפים והמדיום מהצלחת באמצעות אספירטור. הוסיפו 5 מ”ל PBS לכל צלחת בקוטר 15 ס”מ. הסר את PBS מהצלחת באמצעות אספירטור. הוסיפו 2 מ”ל טריפסין (ראו טבלת חומרים) לכל צלחת. דוגרים על הצלחת עד שהקשה עדינה על הצלחת משחררת את התאים. קח 5 מ”ל של מדיום תרבית BMDM, וקצור את התאים מהצלחת.מעבירים לצלחת השנייה בקוטר 15 ס”מ, וקוצרים את התאים מהצלחת. הסר את תרחיף התא מהצלחת לתוך צינור 50 מ”ל. קח 5 מ”ל נוספים של מדיום תרבית BMDM, ושטוף את שתי הצלחות כדי להבטיח שכל התאים נאספו. הכניסו את תרחיף התא לאותו צינור של 50 מ”ל. קח 10 μL של תרחיף התא, וספור באמצעות hemacytometer באמצעות דילול 1: 1 עם כחול טריפאן.הערה: ניתן להשתמש גם במוני תאים אוטומטיים כאשר הם מכוילים לגודל המקרופאגים. זרעו את המקרופאגים בצפיפות של 1 x 106 תאים/מ”ל. BMDMs זרעים ב 2 x 10 6 תאים / באר בצלחת6 באר לספק כ 2 מ”ג / מ”ל חלבון סה”כ. אפשרו לתאים להיצמד לצלחת למשך 6 שעות לפחות לפני הטיפול.הערה: עבור סוגי תאים אחרים, יש לקבוע את הריכוז האופטימלי. טפלו במקרופאגים באמצעות חיקוי Smac (תרכובת A, ראו טבלת חומרים)22 ב-250 ננומטר וב-500 ננומטר במשך 16 שעות.הערה: כלול בקרה חיובית לגרימת אפופטוזיס ומחשוף קספאז-3 כדי להבטיח שהבדיקה עובדת. גורמים נפוצים לאפופטוזיס כוללים staurosporine ו etoposide. עבור קווי תאים רבים לעבור אפופטוזיס, 0.1-10 מיקרומטר עבור 16 שעות של גירוי מספיק. 3. הכנת ליזטים של תאים מתאים מטופלים הערה: שלב זה חייב להיעשות על קרח, והריאגנטים והחומרים חייבים להיות מקוררים מראש. מעבירים את הצלחות המכילות את התאים המטופלים אל הקרח. לאסוף את התווך מתרבית התא לתוך צינור 1.5 מ”ל, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשאוף את התווך, ולשים את הצינור על קרח. זה מאפשר את האוסף של התאים שהתנתקו מן הצלחת. הוסיפו 1 מ”ל PBS קר לצלחת תרבית התאים לשטיפת התאים, ושאפו את כל PBS. הוסף 100 μL של טריפסין לתאים (אם עובדים עם צלחת 6 באר). אפשרו לטריפסין להרים את התאים מהצלחת, ואספו אותם לתוך צינור 1.5 מ”ל. השתמש 1 מ”ל של PBS קר כדי להבטיח שכל התאים נאספו.הערה: אם עובדים עם תאי תרחיף, העבר בעדינות את התווך והתאים לצינור של 1.5 מ”ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את הסופרנאטנט, והשהה מחדש במאגר ליזה DISC 100 μL (150 mM נתרן כלורי, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% גליצרול, 20 mM Tris, pH 7.5, ראה טבלת חומרים). לדגור את הדגימות על קרח במשך 20 דקות. צנטריפוגה את הליזטים ב~ 12,000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להניף את החלק הבלתי מסיס. מעבירים 25 μL של הליזט לצלחת לבנה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות עבור בדיקת הפעילות קספאז-3/קספאז-7 (שלב 5).הערה: אין להפריע לכדור. זהו החלק הבלתי מסיס של התא ליזט. מעבירים 10 μL של הליזט הנותר לצלחת שקופה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות לבדיקת חומצה ביכומונית (BCA) (שלב 4). זה ישמש לנורמליזציה של הדגימות. שמרו את שתי הצלחות על קרח לעיבוד נוסף.הערה: בשלב זה ניתן לאטום את הצלחות בכיסוי דבק ולאחסן בטמפרטורה של 20°C למשך כ-4 שבועות. 4. כימות חלבונים באמצעות בדיקת BCA הערה: ניתן להשתמש בריאגנטים או בדיקות אחרות כדי לכמת את כמות החלבון בכל דגימה. במבחן מבוסס האוכלוסייה, ניתן להשוות את הדגימות על ידי נרמול כמות החלבון המשמשת בבדיקה. הכינו ריכוזי חלבון סטנדרטיים בין 0 מיקרוגרם/מ”ל ל-2,000 מק”ג/מ”ל (0 מיקרוגרם/מ”ל, 25 מק”ג/מ”ל, 125 מיקרוגרם/מ”ל, 250 מיקרוגרם/מ”ל, 500 מיקרוגרם/מ”ל, 750 מיקרוגרם/מ”ל, 100 מיקרוגרם/מ”ל, 1,500 מיקרוגרם/מ”ל, 2,000 מיקרוגרם/מ”ל) עם אלבומין בסרום בקר (BSA). הכינו פריטים ריקים עם מאגר ליזיס בלבד. הוסף 10 μL מכל תקן לצלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות המכילה את הדגימות, המוזכרות בשלב 3.7. ערבבו מגיב BCA 1 עם מגיב BCA 2 ביחס של 50:1 (ראו טבלת חומרים). הוסף 200 μL של מגיב BCA מעורב לכל דגימה ותקן. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. למדוד את הספיגה ב 562 ננומטר על מכשיר פלואורומטרי, ולכמת את ריכוז החלבון עם העקומה הסטנדרטית. 5. בדיקה מבוססת אוכלוסייה לפעילות קספאז-3/קספאז-7 הערה: אין לאפשר לתאי הליזטים שבצלחת לשבת על קרח במשך יותר מ-3 שעות. אם קיימת פעילות קספז, זה גדל עם הזמן למרות שהמדגם נמצא על קרח. אם הדגימות הוקפאו, הפשירו אותן על קרח, והמשיכו מיד לאחר הפשרת הליזטים. הפעל את המכשיר הפלואורומטרי (ראה טבלת חומרים) וחמם את המכשיר ל- 37 ° C. הכינו את התסריט כאמור:בצע קריאות בודדות כל דקה במשך 40 דקות על מנת לקבוע את הקינטיקה של התגובה. הגדר את העירור ל- 360 ננומטר ואת הפליטה ל- 465 ננומטר. עשרה הבזקים לכל באר מספיקים. הכינו את הבקרה החיובית של קספאז-3 רקומביננטי (ראו טבלת חומרים). יש לערבב 1 U של האנזים רקומביננטי קספאז-3 ב-50 μL של חיץ ליזה (צינור 1). הוסף 25 μL של חיץ ליזיס לשלושה צינורות נוספים. העבר 25 μL מצינור 1 לצינור 2. מערבבים על ידי pipetting.חזור על הפעולה עבור צינור 3 וצינור 4. צינור 5 יכיל רק 50 μL של חיץ ליזיס. הוסף 25 μL מכל תקן לצלחת הלבנה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות עבור בדיקת הפעילות קספאז-3, המוזכרת בשלב 3.6. הכינו תערובת תגובה ראשית לבדיקת פעילות קספז על קרח. לתגובה אחת, יש לערבב 50 μL של 2x caspase cleavage buffer (0.2M HEPES pH 7.5; 20% סוכרוז או PEG; 0.2% CHAPS), 5 μL של 1 mM DEVD-AMC (מצע קספאז-3 טטרפפטיד), 2 μL של 500 mM DTT, ו-18 μL של מים שעברו דה-יוניזציה (ראו טבלת חומרים). הוסף 75 μL של תערובת התגובה לכל דגימה ותקן לקבלת נפח תגובה כולל של 100 μL. מדוד מיד את הפלואורסצנטיות באמצעות המכשיר הפלואורומטרי שהוגדר בשלב 5.1. עבור כל מדידה פלואורסצנטית, החסר את קריאת הפלואורסצנטיות עבור הריק (חיץ ליזיס בלבד) מפלואורסצנטיות הדגימה. לנרמל את הקריאה על ידי חלוקה לפי ריכוז החלבון של המדגם (מחושב בשלב 4.5)27: חישוב קצב פעילות הקספז על ידי קביעת שיפוע הפלואורסצנטיות המנורמלת על ציר y וזמן על ציר x. 6. בדיקת תא בודד (ניתוח ציטומטריית זרימה) לפעילות קספאז-3/קספאז-7 זרעו את התאים כמתואר בסעיף 2. קצרו את התאים לתוך צינור פוליסטירן 5 מ”ל. אם עובדים עם תאים דבקים, לאסוף את המדיום לתוך צינור 5 מ”ל. הוסף 1 מ”ל של PBS קר לצלחת תרבית התא, ולאסוף את PBS לתוך צינור 5 מ”ל. הוסף טריפסין לתאים (100 μL אם עובדים עם מנות 6 באר). אפשרו לטריפסין להרים את התאים מהצלחת, ואספו לתוך צינור 5 מ”ל. השתמש 1 מ”ל של PBS קר כדי להבטיח שכל התאים נאספו.הערה: אם עובדים עם תאי תרחיף, העבירו בעדינות את המדיום והתאים לצינור של 5 מ”ל. צנטריפוגה הדגימות ב 300 x גרם במשך 5 דקות, 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות שואב ואקום. מכינים את תערובת הצביעה. ריכוז הצביעה האופטימלי הוא 1 x 10 6-2 x 106 תאים ב 50 μL. לדלל את המצע הפלואורוגני בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים, ציטומטריית זרימה). קח 1 μL של מצע המלאי, ודלל ב 150 μL של PBS. הוסף 50 uL לדגימה. יש לדגור על הדגימות בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות המוגנות מפני אור, תוך ערבוב כל 15 דקות. עם ציטומטר הזרימה המשמש במחקר זה, השתמש בלייזר האדום ב 640 ננומטר, ולזהות באמצעות 675/25 ננומטר. הפעל תחילה את דגימת הבקרה הלא מוכתמת, וקבל מינימום של 10,000 אירועים של האוכלוסייה הרצויה. אל תכלול את הפסולת באמצעות שער (P1) בתרשים נקודות FSC-A ו- SSC-A.השתמש בהיסטוגרמה המציגה את האירועים בשער P1 ובזיהוי מצע הקספז (ציר Y) כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI).הערה: מצע הקספז המתואר בשיטה זו דורש עירור ב- 590 ננומטר ופולט ב- 628 ננומטר.