JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64572
, , , , ,
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology,Harvard Medical School

Summary

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE’nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Retinal pigment epitel hücrelerinin (RPE) metabolik disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve proliferatif vitreoretinopati (PVR) gibi retina hastalıklarının önemli bir patojenik itici gücüdür. RPE metabolik olarak oldukça aktif hücreler olduğundan, metabolik durumlarındaki değişiklikler sağlık ve işlevlerindeki değişiklikleri yansıtır. Yüksek çözünürlüklü respirometri, sırasıyla hücre dışı asitleşme hızının (ECAR) ve oksijen tüketim hızının (OCR) nicelleştirilmesi yoluyla iki ana biyoenerjetik yolağın, glikoliz ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun (OXPHOS) gerçek zamanlı kinetik analizine izin verir. Aşağıdakiler, primer insan retinal pigment epitel hücreleri (H-RPE) üzerinde yüksek çözünürlüklü respirometri yapmak için optimize edilmiş bir protokoldür. Bu protokol, bazal ve maksimal OXPHOS ve glikolitik kapasitelerini tanımlamak için RPE’nin biyoenerjetik profillerinin üretilmesinde yer alan adımların ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. H-RPE’nin mitokondriyal ve glikolitik makineleri hedef alan farklı ilaç enjeksiyonlarına maruz bırakılması, anahtar metabolik parametrelerin hesaplanabileceği tanımlanmış biyoenerjetik profillerle sonuçlanır. Bu protokol, RPE’de maksimum solunum kapasitesini indüklemek için karbonil siyanür p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP) ile karşılaştırıldığında BAM15’in bir ayırma ajanı olarak gelişmiş tepkisini vurgulamaktadır. Bu protokol, farklı hastalık koşulları altında RPE’nin biyoenerjetik durumunu incelemek ve RPE’nin bazal metabolik durumunu iyileştirmede yeni ilaçların etkinliğini test etmek için kullanılabilir.

Introduction

Retinal pigment epitel hücreleri (RPE), fotoreseptörler ile koryokapillarisin fenestrated endotelyumu arasında stratejik olarak yer alan pigmentli epitel hücrelerinin tek katmanlı bir tabakası olarak bulunur. RPE, (1) dökülen fotoreseptör disklerinin fagositozu, (2) görsel döngüyü korumak için görsel pigmentin geri dönüşümü, (3) besinlerin, metabolitlerin, iyonların ve suyun taşınması, (4) ışığın emilimi, (5) fotooksidasyona karşı koruma, (6) retina bütünlüğünü desteklemek için gerekli faktörlerin salgılanması ve (7) dış kan-retina bariyerinin oluşumu1 dahil olmak üzere çok sayıda fonksiyonla metabolik olarak oldukça aktiftir . RPE’nin dejenerasyonu metabolik disfonksiyon ve mitokondriyal defektlerle ilişkilidir ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve proliferatif vitreoretinopati (PVR)2 gibi kör edici göz hastalıklarına yol açar.

İki önemli biyoenerjetik yolak, sitoplazmada meydana gelen glikoliz ve mitokondride meydana gelen oksidatif fosforilasyonu (OXPHOS) içerir. Glikoliz sırasında, bir glikoz molekülü iki piruvat molekülüne ve iki adenozin trifosfat (ATP) molekülünün net üretimine dönüştürülür. Glikolizin aksine, OXPHOS çok daha yüksek seviyelerde ATP üretir (glikoz molekülü başına ~ 32-38 ATP molekülü). Özellikle, OXPHOS oksijen tüketir ve fonksiyonel mitokondrinin oluşmasını gerektirirken, glikoliz sitoplazmada meydana gelir ve oksijen gerektirmez.

Mitokondriyal solunumu incelemek için floresan veya fosforesans bazlı tekniklerin kullanılmasından önce, Clark tipi oksijen elektrodu3 ile donatılmış odalardaki geçirgen hücre süspansiyonlarında oksijen seviyeleri ölçülmüştür. Clark elektrodu, floresan bazlı respirometriden çok daha ucuz olmasına ve yapışkan olmayan hücrelerde çalışmasına rağmen, nispeten düşük verimlidir, her solunum çalışması yaklaşık 15-20 dakika sürer ve her numune için çok daha yüksek miktarda hücre gerektirir3. Böylece, floresan bazlı respirometri tekniği büyük ölçüde Clark elektrodunun yerini almış ve metabolizma ve mitokondriyal araştırma alanlarında popüler bir teknik haline gelmiştir.

Bu protokol, canlı hücrelerin OXPHOS ve glikolitik biyoenerjetik profillerini kinetik olarak ölçen yüksek verimli, yüksek çözünürlüklü, floresan bazlı bir respirometri tekniğini tanımlar. OXPHOS prosesi oksijen tükettiğinden, OXPHOS için biyoenerjetik profil, zaman içinde oksijen tüketim oranındaki (OCR) değişikliklerin haritalanmasıyla üretilir4. Bu teknikte, ışık yayan ve floroforları heyecanlandıran fiber optik demetlere bağlı sensör kartuşu manşonuna iki florofor gömülüdür. Florofor emisyonundaki değişiklikler, son derece hassas floresan sensörleri tarafından ölçülür ve OCRokuma 5’e dönüştürülmek üzere fiber optik demet üzerinden iletilir. Florofor oksijen tarafından söndürülür, böylece oksijen akısı veya OCR olarak bilinen tahlil ortamındaki hücre dışı oksijen seviyelerinin belirlenmesini sağlar. Diğer florofor, hücre dışı asitleşme hızının (ECAR) bir ölçüsüne dönüştürülen proton efflux’teki değişikliklere duyarlı bir pH sensörü probudur. Ölçümler sırasında, gömülü floroforlara sahip fiber optik demetler, hücre tek katmanının 200 μm yukarısına indirilerek hızlı, gerçek zamanlı okumalara olanak tanıyan geçici bir mikro oda oluşturulur. Oksijen veya proton seviyelerinde %10’luk bir değişiklik tespit edildiğinde, sensörler yukarı doğru kaldırılarak daha büyük hacimli ortamların geçici mikro odacıklı ortamla karışmasına izin verilerek OCR ve ECAR değerleri taban çizgisine geri yüklenir. Her sensör kartuşu, tahlil sırasında kuyu başına dört bileşiğin sıralı olarak uygulanmasına izin vermek için dört bağlantı noktası ile donatılmıştır. Ölçümler, her bir porttaki bileşiklerin enjeksiyonundan önce ve sonra toplanabilir ve hücrelerin metabolik durumu hakkında önemli bilgileri ortaya çıkarır.

Bu iki farklı metabolik yolun sorgulanması, farklı patojenik uyaranlara maruz kaldıktan sonra RPE’nin metabolik durumu ile ilgili önemli keşifler sağlayabilir ve böylece RPE 6,7,8’in metabolik bütünlüğünü geri kazanmada ilaçların etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Yüksek verimli respirometrinin ortaya çıkışı ve spesifik mitokondriyal inhibitörlerin mevcudiyeti, RPE’nin biyoenerjetik profillerinin tanımlanmasında ve hastalık durumları sırasında metabolizma ve mitokondrideki kusurların belirlenmesinde daha fazla araştırmayı teşvik etmiştir 6,7,8,9,10,11,12,13 . Yüksek çözünürlüklü respirometri, AMD ve PVR gibi retinal patolojilerde RPE’nin metabolik olarak yeniden programlanmasının anahtar rolünü vurgulamıştır. AMD ve PVR patogenezinde rol oynayan iki anahtar sitokin, transforme edici büyüme faktörü-beta 2 (TGFβ2) ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa). TGFβ2 ile epitelyal-mezenkimal geçişin (EMT) indüksiyonuna mitokondriyal disfonksiyon, OXPHOS supresyonu ve RPE6’da glikolitik kapasitede telafi edici bir artış eşlik eder. Daha yakın zamanlarda, pro-inflamatuar sitokin TNFa’nın, H-RPE7’de bazal OXPHOS’un önemli bir upregülasyonunu ve azalmış glikolizi indüklediği gösterilmiştir. Dimetil fumarat uygulaması, H-RPE’de TNFa kaynaklı inflamasyonu önemli ölçüde baskıladı ve mitokondriyal morfolojiyi ve bazal biyoenerjetik profilleri restore etti7. Bu iki büyüme faktörünün neden olduğu farklı metabolik profiller, retina hastalıklarında metabolik yeniden programlamanın katılımı ile ilgili ilginç mekanik soruları teşvik etmektedir. Aşağıdaki protokol, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE’de OXPHOS ve glikolitik biyoenerjetik profillerin değerlendirilmesi için gereken adımları açıklamaktadır.

Protocol

1. Hücre kültürü plakasında H-RPE kaplaması RPE büyüme ortamı takviyeleri (4 mM L-glutamin, 25 ng / mL FGF-2,% 2 FBS, 30 mg / mL gentamisin ve 15 μg / mL amfoterisin) ile desteklenmiş insan RPE ortamında bir T25 şişesinde H-RPE’yi çözün. Hücreleri 37 ° C’de ve% 5 CO2’de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün ortamı yenileyin ve bir T75 şişesine 1:3 oranında geçmeden önce hücrelerin en az% 80 birleşmeye ulaşmasını bekleyin. Bir kez birleştikten sonra, tripsin / EDTA% 0.025 çözeltisi, tripsin nötralize edici çözelti ve HEPES tamponlu salinden (pH 7.0-7.6) oluşan alt kültür reaktifleri kitini kullanarak hücreleri geçirin.H-RPE’yi 3 mL HEPES tamponlu salin ile nazikçe durulayın. Daha sonra 3 mL tripsin / EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca (veya mikroskop altında gözlemlendiği gibi hücreler şişenin tabanından kalkana kadar) inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2). Tripsin / EDTA’yı 3 mL tripsin nötralize edici çözelti ile nötralize edin. Hücre peletini oluşturmak için hücreleri 200 x g’de 3,5 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan’ı dikkatlice aspire edin ve atın. İnsan RPE ortamındaki hücreleri, kuyucuk başına 100 μL başına 20.000 hücrelik nihai bir konsantrasyona yeniden askıya alın.Hücre süspansiyonunun homojen olduğundan emin olmak için 96 delikli hücre kültürü mikroplakasına pipetlemenin kolaylığı ve tutarlılığı için çok kanallı bir pipet kullanarak birçok kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Eşit ve homojen bir hücre tabakası için pipet ucunu kuyunun üst kısmındaki dairesel kenarın hemen altına yerleştirin.NOT: Hücreler mikroplakaya iyi yapıştığından kaplama gerekmez. Arka plan düzeltme kuyuları olarak kullanılmak üzere dört köşe kuyucuğunu hücrelerden (yalnızca 100 μL ortam) boş bıraktığınızdan emin olun (Şekil 1A).NOT: Mikroplaka, tipik bir 96 delikli plaka tasarımında biçimlendirilmiştir; Bununla birlikte, her bir kuyunun yüzey alanı, standart bir 96 delikli plakadan% 40 daha küçük olan 0.106cm2’dir. Bu hücre yoğunluğunda, hücreler ertesi gün% 100 birleşmelidir. Bazal OCR ve ECAR okumalarının sırasıyla 50-100 pmol / dak ve 10-20 mpH / dak civarında olduğundan emin olmak için tedavileri test etmeden önce bir hücre yoğunluğu optimizasyonu deneyi yapılması önerilir. Kenar etkilerini en aza indirmeye yardımcı olmak için hücre kültürü plakasını inkübatöre geri yerleştirmeden önce (% 5 CO2, 37 ° C, nemlendirilmiş) 1 saat oda sıcaklığında (RT) bırakın. Kenar etkileri, buharlaşma nedeniyle 96 delikli plakanın periferik sınırlarının kuyularındaki ortam hacmindeki değişikliklerdir14.NOT: Hücreler gece boyunca yapışacak ve ertesi gün akıcı bir tek katman oluşturacaktır. H-RPE, her 2-3 günde bir büyüme ortamının yarısı yenilenerek plakada en az 1 ay olgunlaştırılır. Morfolojilerini ve pigmentasyon seviyelerini kontrol etmek için ortamı değiştirmeden önce hücreleri mikroskop altında inceleyin. Hücrelerin karakteristik bir parke taşı benzeri morfoloji ile birleştiğinden ve Shu ve ark.7’deki morfoloji görüntülerinde görüldüğü gibi zamanla pigmentasyon kazandığından emin olun. 2. Tahlili çalıştırmadan önceki gün Tahlilden bir gün önce, yardımcı plakanın her bir kuyucuğunu 200 μL deiyonize su ile doldurarak sensör kartuşunun nemlendirildiğinden emin olun.NOT: Yardımcı plakanın kapağı, her bir kuyucuk için oksijen ve pH seviyelerini ölçmek için floresan biyosensörler içerir. Sensörler, çeşitli uyarma dalga boylarında ışık ileten ve optik filtreler aracılığıyla fotodetektörlere floresan sinyali ileten fiber optik dalga kılavuzlarına bağlanır. Servis plakasındaki suya batırılmış sensör kartuşunu, ~20 mL kalibrantla birlikte (ertesi gün kullanmak üzere ısınmak için) gece boyunca 37 °C nemlendirilmiş bir fırına (CO2 olmadan) yerleştirin.NOT: Kalibrant, sensör kartuşu kalibrasyonu için tasarlanmış tescilli bir çözümdür ve bileşim bakımından fosfat tamponlu salin (PBS) ile benzerlik gösterebilir. Kartuş hidrasyonu için minimum süre 4 saattir, ancak en iyi sonuçlar gece boyunca hidrasyon ile elde edilir. Cihazın açık olduğundan emin olun ve cihazın gece boyunca 37 ° C’ye sabitlenmesini sağlamak için yazılımı başlatın (Şekil 2). Genel olarak, cihaz kullanılmadığında bile açık bırakılabilir. 3. Hücre dışı akı analizörünü kullanarak gerçek zamanlı Mito Stres Testi Tahlil gününde, tahlili çalıştırmadan en az 45 dakika önce şebeke plakasındaki suyu eşit hacimde ısıtılmış kalibrantla değiştirin. Mito Stres Testi tahlil medyasını, Tablo 1’de gösterildiği gibi, takviyeler ekleyerek fenol kırmızısı içermeyen baz ortamını kullanarak yapın. Ortamı 37 ° C’ye ısıtın, pH’ı 7,4 ° C’ye ayarlayın ve bir tüp üstü filtre ünitesi kullanarak ortamı vakumlayın. Tam bir plakayı çalıştırmak için, ~ 25 mL tahlil ortamı yapın. İnsan RPE ortamını çıkarın ve 180 μL taze hazırlanmış tahlil ortamı ile değiştirin (adım 3.2). Tahlile başlamadan önce hücre kültürü plakasını nemlendirilmiş 37 ° C’lik bir fırına (CO2 olmadan) 1 saat boyunca yerleştirin.NOT: Bu, CO2 difüzyonuna izin veren hücre plakasının gazdan arındırılması için önemlidir. Hücreler artık büyüme ortamlarında olmadıklarından ve artık CO2’li bir inkübatörde olmadıklarından, canlılıkları zamanla bozulacaktır, bu nedenle tahlilin mümkün olduğunca verimli bir şekilde yapılmasına özen gösterilmelidir. Hücre kültürü plakasında kabarcık olmadığından emin olmak için de özen gösterilmelidir; Varsa, bir pipet veya iğne ile patlatın. Her sensör kartuşu, test sırasında test bileşiklerinin hücre kültürü plakasının kuyucuklarına enjeksiyonu için kuyu başına dört reaktif dağıtım portuna sahiptir (Şekil 1C, D). Tablo 2’ye göre ilgili tahlil ortamındaki ilaç stoklarını seyrelterek 10x ilaç çözeltilerinin ~3mL’sini hazırlayın. Örneğin, A Portuna, Mito Stres Testi tahlil ortamında çözünmüş 25 μM oligomisin yükleyin, böylece ilaç hacmi cihaz tarafından kuyuya enjekte edildiğinde, her hücrenin maruz kaldığı nihai konsantrasyon 2,5 μM’dir. 10x ilaç stoğunun 20 μL’sini Port A’ya, 22 μL’sini Port B’ye, ve her bir kuyucukta belirtilen nihai ilaç konsantrasyonunu elde etmek için Port C’ye 25 μL. Dört ilaç bağlantı noktasının tümünü gerektiren protokoller için, pipet 28 μL ile D bağlantı noktasına gidin.NOT: A/B/C/D Bağlantı Noktalarının doğru yönlendirilmesi için ilaçları ilaç bağlantı noktalarına pipetlerken Şekil 1B’ye bakın. Kartuşun kenarındaki çentik, ilaç portlarını yüklerken sol alt köşeye yerleştirilmelidir. Her bir ilaç portuna bir açıyla pipetleme yapılarak kabarcıklar en aza indirilebilir. Herhangi bir kabarcık varsa, bunları bir pipet veya iğne ile patlatmaya özen gösterilmelidir. Analiz yazılımında Şablonlar sekmesini açın, Mito Stres Testi’ni seçin ve Grup Tanımları’nı doldurun.Enjeksiyon Stratejisi ile ilgili ayrıntıları girin (bu durumda, Mito Stres Testi ilaçları olarak önceden girilmiştir). Tahlildeki farklı deney gruplarıyla ilgili ayrıntıları girin (örneğin, Kontrol veya Tedavi). Tahlil Ortamına ayrıntıları girin (baz tahlil ortamına farklı takviyelerin ve spesifik konsantrasyonlarının eklenmesi) ve son olarak Hücre Tipini ekleyin. İncelenen farklı grupların 96 delikli plaka haritasındaki belirli konumlarına atanacağı bir sonraki sekme olan Plaka Haritası’na tıklayın. Bu yapıldıktan sonra, varsayılan Mito Stres Testi protokolü için cihaz protokolünü gözden geçirmek üzere Protokol sekmesine tıklayın.NOT: Varsayılan Mito Stres Testi şablonu kullanıma hazırdır, ancak deneysel tasarıma uyacak şekilde herhangi bir şekilde değiştirilebilir. Örneğin, varsayılan ölçüm süresi 3 dakikadır, ancak istenirse bu 5 dakika olarak değiştirilebilir. Testi Çalıştır’a tıklayın ve kalibrant çözeltisine batırılmış sensör kartuşunu yardımcı plakaya yerleştirin. Bu işlem yaklaşık 25 dakika sürer. Bu adımda, her bir biyosensör, bilinen pH ve oksijen konsantrasyonunun kalibrant çözeltisinde ölçülen sensör çıkışına göre bağımsız olarak kalibre edilir.Bu kalibre edildikten sonra, yardımcı plakayı çıkarın ve hücre kültürü plakasını takın.NOT: Önce hücre kültürü plakası dengelenir, bundan sonra cihaz tahlil ortamını karıştırmaya ve OCR ve ECAR değerlerini ölçmeye başlar. Bu adım yaklaşık 1,5 saat sürer ve kullanıcının herhangi bir müdahalesi olmadan cihazın içinde gerçekleştirilir. OCR ve ECAR’ın temel okuması, ilk önce tahlil ortamının 3 dakika karıştırılması ve daha sonra OCR ve ECAR’ın 3 dakika boyunca ölçülmesiyle oluşturulur. Cihaz üç karıştırma ve ölçüm döngüsü gerçekleştirir. Temel ölçümden sonra, cihaz her bir kuyucuğa Port A ilaç çözeltisini otomatik olarak enjekte eder. Bunu üç karıştırma ve ölçüm döngüsü izler (her biri 3 dakika). Aynı model, sonraki her ilaç enjeksiyonundan sonra ortaya çıkar (Bağlantı Noktaları B ve C). Çalışma tamamlandıktan sonra, hücre kültürü plakasını ve sensör kartuşunu çıkarın. Kalite kontrol amacıyla, artık ilaç kalmadığını kontrol etmek için bağlantı noktalarını inceleyerek sensör kartuşundaki tüm ilaç bağlantı noktalarının enjekte edildiğinden emin olun. Sensör kartuşunu ve yardımcı plakayı tek kullanımlık öğeler oldukları için atın. Hücre kültürü mikroplakasındaki hücreleri mikroskop altında inceleyerek hücrelerin hala akıcı bir tek katmanlı olduğundan emin olun. Tahlil ortamını atın ve her bir kuyucukta 60 μL 1x lizis tamponu ile değiştirin.NOT: Lizis tamponu, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ilavesiyle deiyonize suda 1x’e seyreltilmiş 10x lizis tamponundan yapılır. Buharlaşmayı önlemek için plakanın kenarlarını Parafilm’e sarın ve BCA testini kullanarak protein içeriğinin miktarını belirlemeden önce, gece boyunca hücre lizine yardımcı olmak için -80 ° C’lik bir dondurucuya yerleştirin. Veri analizi için, OCR ve ECAR değerlerini her bir kuyucuktaki protein mikrogramına bölerek tüm verileri normalleştirin. Veri analizi yazılımını kullanarak Mito Stres Testi parametrelerini otomatik olarak hesaplamak için Excel makrolarını kullanan Mito Stres Testi rapor oluşturucusunu dışa aktarın.NOT: Bu, bazal solunum, maksimal solunum, yedek solunum kapasitesi, proton sızıntısı, ATP üretimi ve mitokondriyal olmayan solunumu belirlemek için kullanılabilir. Bu hesaplamaların tanımları Tablo 3’te listelenmiştir. 4. Hücre dışı akı analizörünü kullanarak gerçek zamanlı Glikolitik Stres Testi Glikolitik Stres Testini, Tablo 1 ve Tablo 2’de gösterilen farklı tahlil ortamı takviyelerini ve ilaç enjeksiyonlarını kullanmak dışında, Mito Stres Testi ile aynı adımları izleyerek gerçekleştirin. Veri analizi için, veri analizi yazılımından Glikolitik Stres Testi parametrelerini otomatik olarak hesaplamak üzere Excel makrolarını kullanan Glikolitik Stres Testi rapor oluşturucusunu dışa aktarın.NOT: Bu, glikolitik olmayan asitleşmeyi, glikolizi, glikolitik kapasiteyi ve glikolitik rezervi belirlemek için kullanılabilir. Bu hesaplamaların tanımları Tablo 3’te listelenmiştir. 5. BCA protein niceleme testi NOT: Biskinkonik asit (BCA) protein niceleme testi (Smith testi15 olarak da bilinir), bir numunedeki toplam protein içeriğini belirlemek için kullanılan bakır bazlı bir kolorimetrik tahlildir. OCR ve ECAR verilerinin her bir kuyucuktaki protein mikrogramına normalleştirilmesi, her bir kuyucuktaki farklı miktarlarda hücrenin / proteinin okumaları çarpıtmamasını sağlar. BCA testinin mekanizması iki kimyasal reaksiyona dayanmaktadır. İlk olarak, proteinlerdeki peptit bağları, kuprak iyonlarını (Cu2 +) daha yüksek sıcaklıklar (37 ila 60 ° C) tarafından desteklenen sıcaklığa bağlı bir reaksiyon olan kükürt iyonlarına (Cu +) indirger. Daha fazla peptit bağı varsa, Cu2 + miktarını çözelti16’daki protein içeriğiyle orantılı hale getirin. Bu reaksiyon, yeşilden yoğun bir mor çözeltiye renk değişimine neden olur ve 562 nm16’da tepe emilimi ile sonuçlanır. Numunedeki protein içeriği ne kadar yüksek olursa, bu dalga boyundaki absorbans o kadar yüksek olur. Bu kitin çalışma aralığı 20-2.000 μg / mL’dir. BCA tahlil kiti, protein konsantrasyonu referans standardı olarak hizmet veren 2 mg / mL’de 1 mL alikot sığır serum albümini (BSA) içerir. Seyreltilmemiş 2 mg/mL BSA’dan başlayarak ve daha sonra deiyonize suda seyrelterek konsantrasyonu yarıya indirerek berrak, düz tabanlı 96 delikli bir plakada seri seyreltme hazırlayın (örneğin, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 mg/mL, vb.). Bilinen bir protein konsantrasyonunun kullanılması, deneysel numunelerin protein içeriğini hesaplamak için kullanılan standart bir eğrinin hesaplanmasına izin verir. Hesaplanan protein içeriği ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için, her bir tahlil için deneysel numunelerin yanı sıra protein konsantrasyonu referans standartlarının absorbans okumalarını ölçün. Her BSA seri seyreltmesinin 25 μL’lik pipeti, 96 delikli plakaya çift olarak aktarılır. Pipet, 1x lizis tamponunun 25 μL’sini, boşluk olarak kullanılmak üzere 96 delikli plakaya çift olarak yerleştirin. Hücre kültürü plakasını oda sıcaklığına kadar çözün ve pipetleri her hücre lizatının 25 μL’sini 96 delikli plakaya çift olarak verin. Çalışma reaktifini BCA kiti reaktiflerinin 50: 1 oranında hazırlayın A: B. Çalışma reaktifindeki bulanıklığı gidermek için vorteks yaparak iyice karıştırın, böylece homojen yeşil bir çözelti olur. Her bir kuyucuğa 200 μL çalışma reaktifi ekleyin. Plakayı folyo ile kaplayarak plakayı ışıktan koruyun ve 37 ° C’lik bir fırında 20 dakika boyunca inkübe edin. 96 delikli bir plaka okuyucuda absorbansı 562 nm’de ölçün. Veri analizi için, tüm yinelenen değerlerin ortalamasını alın. 1x lizis tampon kuyularından belirlenen boş absorbans seviyelerini tüm numunelerin ölçümlerinden çıkarın. Her BSA standardının μg/mL cinsinden bilinen konsantrasyonuna absorbansını çizerek standart eğriyi belirleyin. Deneysel örneklerin protein konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriden türetilen doğrusal denklemi kullanın.

Representative Results

Cihaz, her çalışma için aynı anda hem OCR hem de ECAR’ı ölçer. Mito Stres Testi için parametre hesaplamaları OCR okumalarına (Şekil 3A) dayanırken, Glikolitik Stres Testi için parametre hesaplamaları ECAR okumalarına dayanmaktadır (Şekil 3B). Şekil 3, Mito Stres Testi OCR eğrisinin zaman içindeki temsili grafiklerini (Şekil 3C) ve H-RPE için çubuk grafikler şeklinde parametre hesaplamalarını (Şekil 3D) göstermektedir. Glikolitik Stres Testi, zaman içinde bir ECAR eğrisi olarak temsil edilir (Şekil 3E) ve parametre hesaplamaları H-RPE için çubuk grafiklerde görüntülenir (Şekil 3F). Bazal solunum, bazal koşullar altında hücrelerin enerjik taleplerinin anlaşılmasını sağlar17. İlk ilaç enjeksiyonu olan oligomisin (Oligo), bir ATP sentaz inhibitörüdür ve bu nedenle, ilk ilaç enjeksiyonunu takiben OCR’nin herhangi bir şekilde azaltılması, ATP’ye bağlı solunum18’in bir ölçüsüdür. Sonraki ilaç enjeksiyonlarını takiben kalan herhangi bir bazal solunum, ATP sentezine bağlanmadığı için proton sızıntısı olarak kabul edilir. Artmış proton sızıntısı, fizyolojik olarak mevcut olan ancak obezite, kanser, tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık19 gibi patolojilerle de bağlantılı olan proteinlerin ayrılmasıyla düzenlenen mitokondriyal ayrışmanın arttığını gösterebilir. İkinci enjeksiyon, mitokondrinin maksimum solunum potansiyelini belirlemek için BAM15 veya FCCP gibi bir ayırma ajanıdır. Ayırma ajanları proton gradyanını çökertir ve mitokondriyal iç zar boyunca proton itici kuvvetini azaltır. Sonuç, oksijen taşıma zinciri (ETC) boyunca elektronların engellenmemiş bir akışıdır, bu da oksijen tüketimi oranını yükseltir ve mitokondriyal solunumun maksimum kapasitesine ulaşmasına neden olur20. Yedek solunum kapasitesi (SRC), maksimum ve bazal solunum arasındaki farktır ve hücrelerin zorlandığında enerjik taleplerdeki değişikliklere cevap verme kapasitesini gösterir ve hücre uygunluğunu gösterir. Önemli olarak, H-RPE’deki Mito Stres Testi için, BAM15, mitokondriyal solunum kapasitesini arttırmada FCCP’den üstündür (Şekil 4A, B), çünkü maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi, 500 nM veya 1 μM FCCP’ye kıyasla 10 μM BAM15 ile anlamlı derecede daha yüksektir. Her iki FCCP dozu arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Rotenon ve antimisin A’nın (Rot / AA) üçüncü ve son enjeksiyonu, mitokondriyal solunumu kapatan ETM’nin sırasıyla mitokondriyal kompleksleri I ve III’ü inhibe eder; herhangi bir kalıntı OCR, mitokondriyal olmayan kaynaklardan kaynaklanmaktadır21. Glikoliz sırasında, bir glikoz molekülü, oksijen yokluğunda iki laktat molekülüne dönüştürülür. Laktatın hücreden ekstrüzyonuna, laktat molekülü başına bir protonun efflüksü eşlik eder, bu nedenle hücre dışı boşluğun asitlenmesine neden olur. Ortamdaki proton üretiminin akışı, ECAR’daki değişikliklerle ölçülür. İlk önce bazal glikoliz seviyeleri belirlenir, daha sonra glikolizi indüklemek ve böylece ECAR seviyelerini22’yi arttırmak için glikozdan yoksun olan tahlil ortamına glikoz enjekte edilir. Oligomisin, mitokondriyal ATP üretimini durdurduğu için “en yüksek” ECAR’ı indüklemek için enjekte edilir, böylece hücreyi ATP’sini glikoliz yoluyla türetmeye zorlar. Son olarak, glikoliz, glikoliz23’ün ilk enzimi olan hekzokinazı inhibe eden 2DG eklenerek kapatılır. Kalan herhangi bir ECAR muhtemelen OXPHOS sırasında TCA döngüsü tarafından CO2 üretimi gibi diğer asitleşme kaynaklarından kaynaklanmaktadır ve glikolitik olmayan ECAR olarak belirtilmiştir. Glikolitik rezerv, glikoz varlığında “en yüksek” ECAR ile ECAR arasındaki fark olarak hesaplanır. Glikolitik kapasite, glikoliz ve glikolitik rezervin toplamıdır. Şekil 1: Plaka ve sensör kartuşunun bileşenleri . (A) Cihaz, veri analiz yazılımı ve protokol kurulum arayüzü gösterilir. 96 kuyucuklu kültür plakası düzeninde, hücreler mavi renkli kuyucuklara kaplanır ve dört köşe kuyucuğu, yalnızca ortam içeren (ve hücre içermeyen) arka düzeltme kuyucukları olarak işlev gördükleri için siyah renkle işaretlenir. (B) Sensör kartuşunun A, B, C ve D ilaçlarının yüklenebileceği her bir kuyucuğu için dört ilaç portu vardır. Her bir porta pipetlenecek hacimler, 10x ilaç stok preparatları için yapılan hesaplamalara göre listelenir. (C) Sensör kartuşu, doğrudan kafir dolgulu yardımcı plakaya yerleştirilen sensör problarından oluşur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Tahlilin zaman çizelgesi. Hücreler hücre kültürü plakasına ekilir. Hazır olduktan sonra, tahlil 2 günlük bir prosedürü ve ardından BCA tahlili ve müteakip veri analizini kullanarak protein içeriğinin nicelleştirilmesini içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Mito Stres Testi ve Glikolitik Stres Testi’nin temsili grafikleri. (A) Mito Stres Testi ve (B) Glikolitik Stres Testi parametrelerinin hesaplamaları şematikte gösterilmiştir. (C) Temsili oksijen tüketimi (OCR) eğrisi ve (D) H-RPE için Mito Stres Testi parametreleri gösterilmiştir. (E) H-RPE için temsili hücre dışı asitleşme hızı (ECAR) eğrisi ve (F) Glikolitik Stres Testi parametreleri gösterilmiştir. Hata çubukları SEM ± araçlardır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: BAM15 ile FCCP’nin bir ayırma ajanı olarak karşılaştırılması. H-RPE’de Mito Stres Testi, (A) oksijen tüketim oranı (OCR) eğrisini ve (B) Mito Stres Testi parametrelerini gösteren, 10 μM BAM15, 500 nM FCCP veya 1 μM FCCP kullanarak maksimum solunumu indüklemenin etkinliğini karşılaştırır. Hata çubukları SEM’± anlamına gelir. **** p ≤ 0.0001; ns, önemli değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Test Glikoz (mM) GlutaMax (mM) Sodyum piruvat (mM) HEPES (mM) Mito Stres Testi 25 2 1 1 Glikolitik Stres Testi Hiç kimse 0.5 Hiç kimse 1 Tablo 1: Mito ve Glikolitik Stres Testleri için tahlil ortamına eklenen takviyelerin konsantrasyonu.  Test Bağlantı Noktası A B Bağlantı Noktası C Bağlantı Noktası Mito Stres Testi Oligomisin 2.5 μM FCCP 500 nM VEYA BAM15 10 μM Rotenon 2 μM VE Antimisin A 2 μM Glikolitik Stres Testi Glikoz 10 mM Oligomisin 2 μM 2-Deoksiglukoz 50 mM Tablo 2: Mito ve Glikolitik Stres Testleri için ilaç port enjeksiyonlarının konsantrasyonları. Bunların, ilaçların her bir kuyucuğa enjekte edilmesinden sonra hücrelerin maruz kaldığı son konsantrasyonlar olduğuna dikkat etmek önemlidir. İlaç portları yüklenirken ilaçlar 10 kat daha güçlü hazırlanmalıdır. Terim Tanım Kalibrant Kalibrant, sensör kartuşunu kalibre etmek için kullanılan bir çözeltidir. Formülasyonu tescillidir ve PBS’ye benzer bir bileşime sahiptir. Sensör Kartuşu Sensör kartuşu, ışık yayan ve floroforları heyecanlandıran fiber optik demetlere bağlı sensör kartuşu manşonuna gömülü iki florofor içerir. Bir florofor oksijen akısını ölçer ve diğeri proton akısını ölçer. Her sensör kartuşu, tahlil sırasında kuyu başına 4 bileşiğin sıralı olarak uygulanmasına izin vermek için 4 bağlantı noktası ile donatılmıştır. Yardımcı Plaka Yardımcı plaka (kalibrant plakası olarak da bilinir), sensörleri kalibre etmek için kullanılır. Calibrant çözeltisi Utility Plate’e yerleştirilir. Mito Stres Testi Mito Stres Testi, zaman içinde OCR’deki değişiklikleri çizerek mitokondriyal solunum biyoenerjetik profilini sağlayan tahlilin adıdır. Glikolitik Stres Testi Glikolitik Stres Testi, zaman içinde ECAR’daki değişiklikleri çizerek glikolitik biyoenerjetik profili sağlayan tahlilin adıdır. Oksijen Tüketim Hızı (OCR) Oksijen tüketim hızı, oksijen akışının (pmol/dak) bir ölçüsüdür ve mitokondriyal metabolik durumu gösterir. Hücre Dışı Asitleşme Hızı (ECAR) Hücre dışı asitleşme hızı, proton efflux’un (mpH / dak) bir ölçüsüdür ve glikolitik metabolik durumu gösterir. Wave Yazılımı Wave Yazılımı, tahlili programlamak ve sonraki veri analizini yapmak için kullanılır Mitokondriyal Olmayan Oksijen Tüketimi Rotenon/antimisin A enjeksiyonundan sonra minimum hız ölçümü Bazal Solunum (İlk enjeksiyondan önceki son hız ölçümü) – (Mitokondriyal Olmayan Solunum Hızı) Maksimum Solunum (FCCP enjeksiyonundan sonra maksimum hız ölçümü) – (Mitokondriyal Olmayan Solunum) H+ (Proton) Sızıntısı (Oligomisin enjeksiyonu sonrası minimum hız ölçümü) – (Mitokondriyal Olmayan Solunum ATP Üretim (Oligomisin enjeksiyonundan önceki son oran ölçümü) – (Oligomisin enjeksiyonundan sonra minimum oran ölçümü) Yedek Solunum Kapasitesi (Maksimal Solunum) – (Bazal Solunum) % olarak yedek solunum kapasitesi (Maksimal Solunum) / (Bazal Solunum) × 100 Kaplin Verimliliği ATP Üretim Hızı) / (Bazal Solunum Hızı) × 100 Glikoliz (Oligomisin enjeksiyonundan önce maksimum hız ölçümü) – (Glikoz enjeksiyonundan önceki son oran ölçümü) Glikolitik Kapasite (Oligomisin enjeksiyonundan sonra maksimum hız ölçümü) – (Glikoz enjeksiyonundan önceki son oran ölçümü) Glikolitik Rezerv (Glikolitik Kapasite) – (Glikoliz) % olarak glikolitik rezerv (Glikolitik Kapasite Oranı) /(Glikoliz) × 100 Glikolitik Olmayan Asitleşme Glikoz enjeksiyonundan önceki son oran ölçümü Tablo 3: Tahlilin temel bileşenlerinin tanımlarının listesi.

Discussion

H-RPE’nin yüksek çözünürlüklü respirometrisi için bu optimize edilmiş protokol, yaygın olarak kullanılan FCCP yerine BAM15’in ayırıcı olarak kullanılmasını içerir. RPE’nin yüksek çözünürlüklü respirometrisi üzerine yapılan önceki çalışmalarda FCCP 9,24 kullanılırken, BAM15’in FCCP’ye kıyasla H-RPE’de maksimum solunum seviyelerinin daha sağlam bir indüksiyonunu indüklediği görülmektedir. Hem FCCP hem de BAM15’in hücrelerde kullanımı güvenli olsa da, BAM15’in normal hücrelerde FCCP veya karbonilsiyanür-3-klorofenilhidrazon (CCCP)25’e kıyasla daha az yan etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. Kenwood ve ark., BAM15’in plazma zarı potansiyelini etkilemeden mitokondrileri depolarize ettiğini, böylece düşük sitotoksisitede sürekli bir maksimum mitokondriyal solunum hızını indüklediğini göstermiştir26. Öte yandan FCCP, hem mitokondri hem de plazma zarını depolarize eder ve daha yüksek sitotoksisite gösterir26.

Protokolde, hücrelerin mikroplakanın tüm deneysel kuyularında birleşik, eşit ve homojen bir RPE tek katmanlı olarak düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak da dahil olmak üzere birkaç kritik adım vardır. Olgun RPE, enerji üretimi için OXPHOS’a büyük ölçüde bağımlıdır ve bu nedenle RPE’nin tahlil sırasında uygun bazal ve maksimum OCR okumaları üretmesini sağlamak için hücrelerin en az 1 ay boyunca olgunlaşmasına izin verilmelidir. Hücre kültürü plakasını cihaza yerleştirmeden önce nemlendirilmiş bir fırında (CO 2 olmadan) 37 ° C’de 1 saat boyunca gazdan arındırmak, doğru ECAR okumaları için çok önemlidir, çünkü CO2 tahlil ortamının pH’ını etkileyebilir. Tahlil gününde güvenilir OCR ve ECAR okumaları sağladığından emin olmak için sensör kartuşunu tahlilden bir gün önce nemlendirmeyi hatırlamak önemlidir. Donma/çözülme döngülerini en aza indirmek için enjekte edilecek ilaçların uygun şekilde yeniden oluşturulmasına ve yeniden yapılandırılmış ilaç stoklarının uzun süreli depolama için daha küçük hacimlere çıkarılmasına özen gösterilmelidir. İlgili tahlil ortamında seyreltilmiş 10x ilaç çözeltisi hazırlamak (örneğin, Mito Stres Testi için Mito Stres Testi tahlil ortamında seyreltmek), ilacın tahlil ortamı ile dolu her bir kuyucuğa enjeksiyonundan seyreltmeyi hesaba katmak için kritik öneme sahiptir. Sonraki her ilaç enjeksiyonunda, her bir kuyucukta daha fazla ortam vardır ve bu nedenle yüklenen ilaç hacimleri her enjeksiyonla birlikte artar ve protokolde belirtilen hacimleri takip etmeye özen gösterilmelidir. Deneyin tamamlanmasının ardından, hiçbir kalıntı ilacın belirgin olmadığından emin olmak için sensör kartuşunu inceleyerek ve akıcı ve homojen hücre tek katmanının kalmasını sağlamak için hücre kültürü plakasını mikroskop altında gözlemleyerek kalite kontrolleri yapmak önemlidir.

Bu protokoldeki değişiklikler, portlara farklı ilaçların enjekte edilmesini ve bu ilaçların OCR ve ECAR okumalarını nasıl etkilediğini belirlemeyi içerir. Popüler bir modifikasyon, normal Mito veya Glikolitik Stres Testi ilaçlarını enjekte etmeden önce Port A olarak tercih edilen deneysel bir ilacı enjekte etmektir. Bu tür bir protokol, tercih edilen ilacın akut enjeksiyonunun sonraki OXPHOS ve glikolitik parametreleri nasıl etkilediğine dair içgörüler sağlar. Diğer modifikasyonlar arasında farklı hücre tiplerinin incelenmesi; bu, optimum tohumlama hücresi yoğunluğunun ilk sorun giderme işlemini ve bazal okumaların OCR için 50-100 pmol / dak ve ECAR için 10-20 mpH / dak arasında olmasını sağlayarak tahlil ortamının optimizasyonunu gerektirir. Enjekte edilen ilaçların optimal konsantrasyonları, ilaçların seri seyreltilmesine OCR ve ECAR yanıtlarını gözlemleyerek incelenen her yeni hücre tipi için belirlenmelidir.

Protokolün önemli bir sınırlaması, hücreler normal büyüme ortamlarında bir CO2 inkübatöründe olmadığı için hücre canlılığının zamanla azalmasıdır ve bu nedenle maksimum hücre canlılığını sağlamak için tahlil 3-4 saat içinde tamamlanmalıdır. Ayrıca, her bir kuyucuğa enjekte edilen mitokondriyal toksinlere maruz kalmak, zamanla hücre canlılığını daha da azaltabilir. Tahlil tamamlandıktan sonra, OCR ve ECAR okumalarını normalleştirmek için protein içeriğinin değerlendirilmesi için hücreler lize edilmelidir ve bu nedenle aynı hücreler sonraki moleküler biyoloji tahlilleri için toplanamaz.

Biyoenerjetik profilleme için Denizatı alternatifleri arasında Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 ve Resipher (Lucid Scientific)7 bulunmaktadır. Oroboros O2k, S1 Clark tipi polarografik oksijen elektrotlarını kullanan kapalı iki odacıklı bir respirometredir. Oroboros O2k, gerçek zamanlı metabolik akının son derece hassas ölçümlerini üretirken, operatörün her ilacı30’u manuel olarak enjekte etmesi gerektiğinden, cihaz emek yoğundur. BaroFuse, çoklu paralel perfüzyon deneylerini mümkün kılmak için gaz basıncını kullanan ve OCR’yi ölçmek için bir oksijen algılama sistemine bağlı olan yeni bir çok kanallı mikroakışkan perfüzyon sistemidir. Bu akış kültürü sisteminin avantajı, hücre canlılığının daha uzun tahliller boyunca azaldığı Denizatının aksine, doku fonksiyonunun ve canlılığının korunmasıdır. Resipher, hücreler inkübatörde 96 delikli bir plakadayken OCR’yi ölçmek için son derece hassas optik oksijen sensörleri kullanır, böylece birkaç hafta ila aylar boyunca sürekli OCR ölçümleri sağlar. Özellikle, bu aletler ECAR’ı ölçmez ve bu nedenle Denizatı hem OXPHOS hem de glikolizin eşzamanlı araştırılması avantajına sahiptir.

OXPHOS ve glikolizin gerçek zamanlı biyoenerjetik profillerinin sorgulanması, RPE sağlığını ve işlevini karakterize etmede kilit bir faktör olarak ortaya çıkmaktadır. Yüksek çözünürlüklü respirometri, normal ve hastalıklı RPE’nin metabolik durumunu karşılaştırmak için etkili bir araç sağlar, böylece AMD ve PVR gibi retina hastalıkları için ilaç etkinliğinin taranmasında yeni yollar açılır. RPE’de yüksek çözünürlüklü respirometri için gelecekteki yönler, transwell filtrelerde yetiştirilen yüksek polarize RPE monokatmanları için biyoenerjetik profilleri incelemek için bir protokolün optimize edilmesini içerir. Calton et al. (2016), transwell filtreler31 üzerinde yetiştirilen polarize RPE monolayer’ın üçgen bir bölümünü keserek bunu başarıyla başardı. Metodolojinin daha da genişletilmesi, farklı retinal dejeneratif koşullara sahip hastalardan izole edilen indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı RPE’nin (iPSC-RPE) biyoenerjetik profillerinin incelenmesini içerir32. AMD ve PVR’de yer alan patojenik sitokinlerin RPE metabolizmasının dinamik doğasını nasıl etkilediğinin araştırılması, yeni uyuşturulabilir hedeflerin belirlenmesini bilgilendirebilecek metabolik kırılganlıkları ortaya çıkarabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen şu hibelerle desteklenmiştir: Görme Mücadelesi Leonard & Robert Weintraub Doktora Sonrası Bursu (D.Y.S.); Maküler Dejenerasyon Araştırmalarında BrightFocus Vakfı Doktora Sonrası Burs Programı (M2021010F, D.Y.S.); Savunma Bakanlığı, Spinal Vizyon Araştırma Programı, Ödül no. VR180132 (M.S.-G. ve L.A.K.); Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü, R01EY027739 (L.A.K.) Ödül no. Bu araştırmayı desteklemek için BrightFocus Vakfı’nın bir programı olan Makula Dejenerasyon Araştırması M2021010F’nin bağışçılarına teşekkür edilir. Şemalar Biorender.com ile oluşturuldu

Materials

2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S  Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
  2. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
  3. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
  4. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  5. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  6. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
  7. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
  8. Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
  9. Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
  10. Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
  11. Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
  12. Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
  13. Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
  14. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
  17. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
  18. Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
  19. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
  20. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  21. Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
  22. Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
  23. Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
  24. Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
  25. Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
  26. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  27. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  28. Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
  29. Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
  30. Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
  31. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
  32. Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).

Tags

Real-time BioenergeticsPrimary Human Retinal Pigment Epithelial CellsHigh-resolution RespirometryOxphosGlycolysisAMDCell CultureRespirometry InstrumentMito Stress Test Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fitch, T. C., Frank, S. I., Li, Y. K., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (192), e64572, doi:10.3791/64572 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image