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Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64572
, , , , ,
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology,Harvard Medical School

Summary

O estado metabólico das células epiteliais pigmentares da retina humana (H-RPE) reflete sua saúde e função. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para examinar o fluxo metabólico em tempo real de H-RPE usando respirometria de alta resolução.

Abstract

A disfunção metabólica das células epiteliais pigmentares da retina (EPR) é um fator patogênico chave de doenças da retina, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e vitreorretinopatia proliferativa (RVP). Como os EPR são células altamente metabolicamente ativas, alterações em seu estado metabólico refletem mudanças em sua saúde e função. A respirometria de alta resolução permite a análise cinética em tempo real das duas principais vias bioenergéticas, glicólise e fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), através da quantificação da taxa de acidificação extracelular (ECAR) e taxa de consumo de oxigênio (OCR), respectivamente. A seguir está um protocolo otimizado para a realização de respirometria de alta resolução em células epiteliais pigmentares primárias da retina humana (H-RPE). Este protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas na produção de perfis bioenergéticos de PSE para definir suas capacidades basal e máxima de OXPHOS e glicolíticas. A exposição do H-RPE a diferentes injeções de drogas visando a maquinaria mitocondrial e glicolítica resulta em perfis bioenergéticos definidos, a partir dos quais os principais parâmetros metabólicos podem ser calculados. Este protocolo destaca a resposta aumentada do BAM15 como um agente desacoplador em comparação com o cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) para induzir a capacidade respiratória máxima em PSE. Esse protocolo pode ser utilizado para estudar o estado bioenergético da PSE sob diferentes condições da doença e testar a eficácia de novas drogas na restauração do estado metabólico basal da PSE.

Introduction

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) existem como uma monocamada de células epiteliais pigmentadas estrategicamente localizadas entre os fotorreceptores e o endotélio fenestrado do coriocapilar. Os EPR são altamente metabolicamente ativos com inúmeras funções, incluindo (1) fagocitose dos discos fotorreceptores eliminados, (2) reciclagem do pigmento visual para manter o ciclo visual, (3) transporte de nutrientes, metabólitos, íons e água, (4) absorção de luz, (5) proteção contra fotooxidação, (6) secreção de fatores essenciais para apoiar a integridade retiniana e (7) formação da barreira hemato-retiniana externa1 . A degeneração do EPR está associada à disfunção metabólica e a defeitos mitocondriais, levando a doenças oculares cegas, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e a vitreorretinopatia proliferativa (RVP)2.

Duas vias bioenergéticas importantes incluem a glicólise, que ocorre no citoplasma, e a fosforilação oxidativa (OXPHOS), que ocorre nas mitocôndrias. Durante a glicólise, uma molécula de glicose é convertida em duas moléculas de piruvato e uma produção líquida de duas moléculas de trifosfato de adenosina (ATP). Em contraste com a glicólise, OXPHOS produz níveis muito mais elevados de ATP (~32-38 moléculas de ATP por molécula de glicose). Notavelmente, OXPHOS consome oxigênio e requer mitocôndrias funcionais para ocorrer, enquanto a glicólise ocorre no citoplasma e não requer oxigênio.

Antes da introdução de técnicas baseadas em fluorescência ou fosforescência para examinar a respiração mitocondrial, os níveis de oxigênio foram medidos em suspensões de células permeabilizadas em câmaras equipadas com um eletrodo de oxigênio tipo Clark3. Embora o eletrodo de Clark seja muito mais barato do que a respirometria baseada em fluorescência e funcione em células não aderentes, ele é relativamente de baixo rendimento, com cada corrida respiratória durando cerca de 15-20 min e exigindo quantidades muito maiores de células para cada amostra3. Assim, a técnica de respirometria baseada em fluorescência substituiu amplamente o eletrodo de Clark e tornou-se uma técnica popular nos campos do metabolismo e da pesquisa mitocondrial.

Este protocolo descreve uma técnica de respirometria baseada em fluorescência de alto rendimento, alta resolução que mede cineticamente o OXPHOS e perfis bioenergéticos glicolíticos de células vivas. Uma vez que o processo de OXPHOS consome oxigênio, o perfil bioenergético para OXPHOS é produzido pelo mapeamento de mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) ao longo do tempo4. Nesta técnica, dois fluoróforos são embutidos na manga do cartucho sensor que é conectada a feixes de fibra óptica que emitem luz, excitando os fluoróforos. As alterações na emissão de fluoróforos são medidas por sensores de fluorescência altamente sensíveis e transmitidas através do feixe de fibra óptica para serem convertidas em uma leitura OCR5. O fluoróforo torna-se extinguido pelo oxigênio, permitindo assim a determinação dos níveis de oxigênio extracelular no meio de ensaio, conhecido como fluxo de oxigênio ou OCR. O outro fluoróforo é uma sonda sensor de pH sensível a mudanças no efluxo de prótons, que é convertido em uma medida da taxa de acidificação extracelular (ECAR). Durante as medições, os feixes de fibra óptica com fluoróforos embutidos são reduzidos a 200 μm acima da monocamada celular, criando uma microcâmara transitória que permite leituras rápidas e em tempo real. Uma vez detectada uma alteração de 10% nos níveis de oxigênio ou prótons, os sensores são levantados para cima, permitindo que um volume maior de mídia se misture com o meio de microcâmara transiente, restaurando os valores de OCR e ECAR de volta à linha de base. Cada cartucho sensor é equipado com quatro portas para permitir a administração sequencial de até quatro compostos por poço durante o ensaio. Medições podem ser coletadas antes e após a injeção dos compostos em cada porta, revelando informações importantes sobre o estado metabólico das células.

Interrogar essas duas vias metabólicas distintas pode produzir descobertas importantes sobre o estado metabólico do EPR após exposição a diferentes estímulos patogênicos e, assim, pode ser usado para testar a eficácia de drogas em restaurar a integridade metabólica do EPR 6,7,8. O advento da respirometria de alto rendimento e a disponibilidade de inibidores mitocondriais específicos têm estimulado mais pesquisas na definição do perfil bioenergético do EPR e na identificação de defeitos no metabolismo e nas mitocôndrias durante estados patológicos6,7,8,9,10,11,12,13 . A respirometria de alta resolução tem destacado o papel fundamental da reprogramação metabólica da PSE em patologias retinianas como a DMRI e a RVP. Duas citocinas-chave envolvidas na patogênese da DMRI e da RVP são o fator transformador de crescimento beta 2 (TGFβ2) e o fator de necrose tumoral alfa (TNFα). A indução da transição epitélio-mesenquimal (EMT) pelo TGFβ2 é acompanhada por disfunção mitocondrial, supressão da OXPHOS e aumento compensatório da capacidade glicolítica na PSE6. Mais recentemente, demonstrou-se que a citocina pró-inflamatória, TNFα, induz um aumento significativo da regulação do OXPHOS basal e redução da glicólise no H-PSE7. A administração de fumarato de dimetila suprimiu significativamente a inflamação induzida pelo TNFα no H-RPE e restaurou a morfologia mitocondrial e o perfil bioenergético basal7. Os perfis metabólicos divergentes induzidos por esses dois fatores de crescimento estimulam intrigantes questões mecanicistas sobre o envolvimento da reprogramação metabólica nas doenças retinianas. O protocolo a seguir descreve as etapas para avaliação do OXPHOS e do perfil bioenergético glicolítico em PSE-H por meio da respirometria de alta resolução.

Protocol

1. Plaeamento H-RPE na placa de cultura celular Descongelar o H-RPE em frasco T25 em meio de EPR humano suplementado com meio de crescimento de EPR (4 mM de L-glutamina, 25 ng/mL de FGF-2, 2% de SFB, 30 mg/mL de gentamicina e 15 μg/mL de anfotericina). Incubar as células a 37 °C e 5% CO2 em estufa umedificada. Atualizar o meio no dia seguinte e esperar que as células atinjam pelo menos 80% de confluência antes de passar a uma proporção de 1:3 para um frasco T75. Uma vez confluentes, passar as células utilizando o kit de reagentes de subcultura composto por solução de tripsina/EDTA a 0,025%, solução neutralizante de tripsina e solução salina tamponada com HEPES (pH 7,0-7,6).Enxaguar suavemente H-RPE com 3 mL de solução salina tamponada com HEPES. Em seguida, adicionar 3 mL de tripsina/EDTA e incubar (37 °C e 5% CO2) por 5 min (ou até que as células tenham se retirado da base do frasco, como observado ao microscópio). Neutralizar a tripsina/EDTA com 3 mL de solução neutralizante de tripsina. Centrifugar as células a 200 x g por 3,5 min para formar o pellet celular. Aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as células em meio de EPR humano até uma concentração final de 20.000 células por 100 μL por poço.Pipetar para cima e para baixo várias vezes para garantir que a suspensão da célula seja homogênea, usando uma pipeta multicanal para facilitar e consistência da pipetagem na microplaca de cultura de células de 96 poços. Coloque a ponta da pipeta logo abaixo da borda circular no topo do poço para obter uma camada de células homogênea e uniforme.NOTA: Nenhum revestimento é necessário, pois as células aderem bem à microplaca. Certifique-se de deixar os quatro poços de canto vazios de células (100 μL de mídia apenas) para servir como poços de correção de fundo (Figura 1A).NOTA: A microplaca é formatada em um design típico de placa de 96 poços; no entanto, a área de superfície de cada poço é de 0,106 cm2, que é 40% menor do que uma placa padrão de 96 poços. Nesta densidade celular, as células devem estar 100% confluentes no dia seguinte. Recomenda-se realizar um experimento de otimização da densidade celular primeiro antes de testar os tratamentos para garantir que as leituras basais de OCR e ECAR estejam em torno de 50-100 pmol/min e 10-20 mpH/min, respectivamente. Deixar a placa de cultura celular à temperatura ambiente (TR) por 1 h antes de colocá-la novamente na incubadora (5% CO2, 37 °C, umidificado) para ajudar a minimizar os efeitos de borda. Os efeitos de borda são alterações no volume do meio nos poços das bordas periféricas da placa de 96 poços devido à evaporação14.NOTA: As células irão aderir durante a noite e formar uma monocamada confluente no dia seguinte. H-RPE são maturados na placa por pelo menos 1 mês, atualizando metade do meio de crescimento a cada 2-3 dias. Examinar as células ao microscópio antes de trocar o meio para verificar sua morfologia e nível de pigmentação. Certifique-se de que as células sejam confluentes com uma morfologia característica semelhante a um paralelepípedo e adquiram pigmentação ao longo do tempo, como visto nas imagens morfológicas de Shu et al.7. 2. Um dia antes da execução do ensaio Certifique-se de que o cartucho do sensor esteja hidratado no dia anterior ao ensaio, enchendo cada poço da placa de serviço público com 200 μL de água deionizada.NOTA: A tampa da placa de serviço público contém biossensores fluorescentes para medir os níveis de oxigênio e pH para cada poço. Os sensores são acoplados a guias de onda de fibra óptica que fornecem luz em vários comprimentos de onda de excitação e transmitem um sinal fluorescente através de filtros ópticos para fotodetectores. Coloque o cartucho do sensor submerso em água na placa do utilitário juntamente com ~20 mL do calibrador (para aquecer para uso no dia seguinte) em um forno umidificado a 37 °C (sem CO2) durante a noite.NOTA: O calibrador é uma solução proprietária projetada para calibração de cartucho de sensor e é provavelmente semelhante em composição ao soro fisiológico tamponada com fosfato (PBS). O tempo mínimo para hidratação do cartucho é de 4 h, mas os melhores resultados são obtidos com a hidratação noturna. Certifique-se de que o instrumento esteja ligado e inicie o software para permitir que o instrumento estabilize a 37 °C durante a noite (Figura 2). Geralmente, o instrumento pode ser deixado ligado mesmo quando não está em uso. 3. Mito Stress Test em tempo real utilizando o analisador de fluxo extracelular No dia do ensaio, substitua a água na placa da concessionária por um volume igual de calibrador aquecido pelo menos 45 minutos antes da execução do ensaio. Fazer o meio de ensaio Mito Stress Test usando o meio base sem vermelho de fenol adicionando suplementos, como mostrado na Tabela 1. Aqueça o meio a 37 °C, ajuste o pH para 7,4 e filtre a vácuo o meio usando uma unidade de filtro superior de tubo. Para executar um prato cheio, faça ~25 mL de mídia de ensaio. Remover o meio PSE humano e substituí-lo por 180 μL de meio de ensaio recém-preparado (passo 3.2). Colocar a placa de cultura celular numa estufa humidificada a 37 °C (sem CO2) durante 1 h antes de iniciar o ensaio.NOTA: Isso é importante para desgaseificar a placa celular, permitindo a difusão de CO2 . Como as células não estão mais em seus meios de crescimento e não mais em uma incubadora com CO2, sua viabilidade se deteriorará com o tempo, portanto, deve-se tomar cuidado para conduzir o ensaio da forma mais eficiente possível. Deve-se tomar cuidado também para garantir que não haja bolhas na placa de cultura celular; se houver algum, coloque-os com uma pipeta ou agulha. Cada cartucho sensor possui quatro portas de entrega de reagentes por poço para a injeção dos compostos de teste nos poços da placa de cultura celular durante o ensaio (Figura 1C,D). Preparar ~3mL das soluções de 10x do fármaco diluindo os estoques do fármaco nos respectivos meios de ensaio de acordo com a Tabela 2. Por exemplo, carregar a porta A com 25 μM de oligomicina dissolvida no meio de ensaio do Mito Stress Test, de modo que, quando o volume do fármaco é injetado no poço pelo instrumento, a concentração final a que cada célula é exposta é de 2,5 μM. Pipetar 20 μL do estoque de 10x droga para a porta A, 22 μL para a porta B, e 25 μL na porta C, para atingir a concentração final especificada do fármaco em cada poço. Para protocolos que exigem todas as quatro portas de drogas, pipetar 28 μL para a porta D.NOTA: Consulte a Figura 1B ao pipetar as drogas nos portos de drogas para a orientação adequada dos portos A/B/C/D. O entalhe na borda do cartucho deve estar localizado no canto inferior esquerdo ao carregar as portas de drogas. Ao pipetar em um ângulo em cada porta de droga, as bolhas podem ser minimizadas. Se houver bolhas presentes, deve-se tomar cuidado para estourá-las com uma pipeta ou agulha. Abra a guia Modelos no software de análise, selecione Mito Stress Test e preencha as Definições de Grupo.Detalhes de entrada sobre a Estratégia de Injeção (neste caso, ela é pré-inserida como os medicamentos do Mito Stress Test). Detalhes de entrada sobre os diferentes grupos experimentais no ensaio (por exemplo, Controle ou Tratamento). Insira detalhes sobre a Mídia de Ensaio (adição de diferentes suplementos e suas concentrações específicas à mídia de ensaio de base) e, finalmente, adicione o Tipo de Célula. Clique na próxima aba, Mapa de placas, onde os diferentes grupos que estão sendo examinados serão atribuídos à sua localização específica no mapa de placas de 96 poços. Feito isso, clique na guia Protocolo para revisar o protocolo do instrumento para o protocolo padrão do Mito Stress Test .NOTA: O modelo padrão do Mito Stress Test está pronto para uso, mas pode ser modificado de qualquer maneira para se adequar ao design experimental. Por exemplo, o tempo de medição padrão é de 3 min, mas isso pode ser modificado para 5 min, se desejado. Clique em Executar o ensaio e insira o cartucho do sensor que está submerso na solução calibradora na placa do utilitário. Esse processo leva em torno de 25 min. Nesta etapa, cada biossensor é calibrado independentemente com base na saída do sensor medida na solução calibrante de pH e concentração de oxigênio conhecidos.Uma vez calibrado, remova a placa de utilidade e insira a placa de cultura celular.NOTA: A placa de cultura celular é equilibrada primeiro, após o que, o instrumento começa a misturar o meio de ensaio e medir os valores de OCR e ECAR. Essa etapa dura em torno de 1,5 h e é realizada dentro do instrumento sem qualquer intervenção do usuário. Uma leitura basal de OCR e ECAR é estabelecida primeiro misturando o meio de ensaio por 3 min e, em seguida, medindo OCR e ECAR por 3 min. O instrumento executa três loops de mistura e medição. Após a medição inicial, o instrumento injeta automaticamente a solução do medicamento Port A em cada poço. Isto é seguido por três ciclos de mistura e medição (3 min cada). O mesmo padrão ocorre após cada injeção subsequente de drogas (Portas B e C). Quando a execução estiver concluída, remova a placa de cultura de células e o cartucho do sensor. Para fins de controle de qualidade, certifique-se de que todas as portas de drogas no cartucho do sensor tenham sido injetadas, examinando as portas para verificar se nenhuma droga residual permanece. Descarte o cartucho do sensor e a placa de utilitário, pois são itens de uso único. Examine as células na microplaca de cultura celular sob o microscópio para garantir que ainda haja uma monocamada confluente de células. Descarte o meio de ensaio e substitua-o por 60 μL de tampão de lise 1x em cada poço.NOTA: O tampão de lise é feito a partir de 10x tampão de lise diluído a 1x em água deionizada com a adição de 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF). Embrulhe as bordas da placa em Parafilm para evitar a evaporação e coloque-a em um freezer de -80 °C para ajudar na lise celular durante a noite, antes da quantificação do conteúdo de proteína usando o ensaio BCA. Para análise dos dados, normalize todos os dados dividindo os valores de OCR e ECAR pelo micrograma de proteína em cada poço. Exporte o gerador de relatórios do Mito Stress Test, que utiliza macros do Excel para calcular automaticamente os parâmetros do Mito Stress Test usando o software de análise de dados.NOTA: Isso pode ser usado para determinar a respiração basal, respiração máxima, capacidade respiratória sobressalente, vazamento de prótons, produção de ATP e respiração não mitocondrial. As definições desses cálculos estão listadas na Tabela 3. 4. Teste de Estresse Glicolítico em Tempo Real utilizando o analisador de fluxo extracelular Realizar o Teste de Esforço Glicolítico seguindo os mesmos passos do Mito Stress Test, exceto usando os diferentes meios de ensaio suplementos e injeções de drogas mostrados na Tabela 1 e Tabela 2. Para análise de dados, exporte o gerador de relatórios do Teste de Estresse Glicolítico, que utiliza macros do Excel para calcular automaticamente os parâmetros do Teste de Estresse Glicolítico do software de análise de dados.NOTA: Isso pode ser usado para determinar acidificação não-glicolítica, glicólise, capacidade glicolítica e reserva glicolítica. As definições desses cálculos estão listadas na Tabela 3. 5. Ensaio de quantificação da proteína BCA NOTA: O ensaio de quantificação de proteínas do ácido bicinchônico (BCA) (também conhecido como ensaio de Smith15) é um ensaio colorimétrico à base de cobre usado para determinar o conteúdo total de proteínas em uma amostra. Normalizar os dados de OCR e ECAR para o micrograma de proteína em cada poço garante que diferentes quantidades de células/proteínas em cada poço não distorcam as leituras. O mecanismo do ensaio de BCA é baseado em duas reações químicas. Em primeiro lugar, as ligações peptídicas em proteínas reduzem íons cúpricos (2+) a íons cuprous (+), que é uma reação dependente da temperatura assistida por temperaturas mais altas (37 a 60 °C). Se houver mais ligações peptídicas, tornando a quantidade de2+ proporcional ao conteúdo de proteína na solução16. Esta reação resulta em uma mudança de cor de verde para uma solução roxa intensa, com um pico de absorbância em 562 nm16. Quanto maior o teor de proteína na amostra, maior a absorbância nesse comprimento de onda. A faixa de trabalho deste kit é de 20-2.000 μg/mL. O kit de ensaio BCA contém alíquotas de 1 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg/mL, que serve como padrão de referência de concentração proteica. Preparar uma diluição em série numa placa transparente de fundo plano de 96 poços a partir dos 2 mg/ml de BSA não diluídos e, subsequentemente, reduzir para metade a concentração diluindo em água deionizada (por exemplo, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/ml, etc.). O uso de uma concentração conhecida de proteína permite o cálculo de uma curva padrão, que é usada para calcular o teor de proteína das amostras experimentais. Para melhorar a precisão das medições calculadas do teor de proteínas, meça as leituras de absorbância dos padrões de referência de concentração de proteínas juntamente com as amostras experimentais para cada ensaio. Pipetar 25 μL de cada diluição em série BSA em duplicata para a placa de 96 poços. Pipetar 25 μL do tampão de lise 1x em duplicata para a placa de 96 poços para servir como branco. Descongelar a placa de cultura celular à temperatura ambiente e pipetar 25 μL de cada lisado celular em duplicata para a placa de 96 poços. Prepare o reagente de trabalho em uma proporção de 50:1 de reagentes do kit BCA A:B. Misture cuidadosamente por vórtice para remover qualquer turbidez no reagente de trabalho, de modo que seja uma solução verde homogênea. Adicionar 200 μL do reagente de trabalho a cada poço. Proteja o prato da luz cobrindo o prato em papel alumínio e incube em forno a 37 °C durante 20 minutos. Meça a absorbância a 562 nm em um leitor de placas de 96 poços. Para análise dos dados, faça a média de todos os valores duplicados. Subtrair os níveis de absorbância em branco determinados dos poços tampão de lise 1x das medições de todas as amostras. Determinar a curva padrão traçando a absorbância de cada padrão BSA para a sua concentração conhecida em μg/mL. Utilizar a equação linear derivada da curva padrão para determinar a concentração proteica das amostras experimentais.

Representative Results

O instrumento mede simultaneamente OCR e ECAR para cada corrida. Para o Mito Stress Test, os cálculos dos parâmetros são baseados nas leituras do OCR (Figura 3A), enquanto para o Glycolytic Stress Test, os cálculos dos parâmetros são baseados nas leituras do ECAR (Figura 3B). A Figura 3 mostra gráficos representativos para a curva OCR do Mito Stress Test ao longo do tempo (Figura 3C) e cálculos de parâmetros na forma de gráficos de barras para H-PSE (Figura 3D). O Teste de Estresse Glicolítico é representado como uma curva ECAR ao longo do tempo (Figura 3E), e os cálculos dos parâmetros são exibidos em gráficos de barras para PSE-H (Figura 3F). A respiração basal proporciona a compreensão das demandas energéticas das células em condições basais17. A primeira injeção de fármaco, oligomicina (Oligo), é um inibidor da ATP sintase e, portanto, qualquer redução da OCR após a primeira injeção da droga é uma medida da respiração ligada ao ATP18. Qualquer respiração basal remanescente após injeções subsequentes de drogas é considerada um vazamento de prótons, uma vez que não está acoplada à síntese de ATP. O aumento do extravasamento de prótons pode indicar aumento do desacoplamento mitocondrial, que é regulado por proteínas desacopladoras fisiologicamente presentes, mas também tem sido associado a patologias como obesidade, câncer, diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares19. A segunda injeção é de um agente desacoplador, como BAM15 ou FCCP, para determinar o potencial respiratório máximo das mitocôndrias. Os agentes desacopladores colapsam o gradiente de prótons e reduzem a força motriz de prótons através da membrana interna mitocondrial. O resultado é um fluxo desinibido de elétrons através da cadeia de transporte de elétrons (ETC), que eleva a taxa de consumo de oxigênio e faz com que a respiração mitocondrial atinja sua capacidade máxima20. A capacidade respiratória ociosa (CRE) é a diferença entre a respiração máxima e basal, indicando a capacidade das células de responder às mudanças nas demandas energéticas quando desafiadas, indicando aptidão celular. É importante ressaltar que, para o Mito Stress Test em PSE-H, a BAM15 é superior à FCCP no aumento da capacidade respiratória mitocondrial (Figura 4A,B), uma vez que a respiração máxima e a capacidade respiratória sobressalente são significativamente maiores com 10 μM BAM15 em comparação com 500 nM ou 1 μM FCCP. Não foram observadas diferenças significativas entre as doses do FCCP. A terceira e última injeção de rotenona e antimicina A (Rot/AA) inibem os complexos mitocondriais I e III, respectivamente, da ETC, o que desliga a respiração mitocondrial; qualquer OCR residual é devida a fontes não mitocondriais21. Durante a glicólise, uma molécula de glicose é convertida em duas moléculas de lactato na ausência de oxigênio. A extrusão de lactato da célula é acompanhada pelo efluxo de um próton por molécula de lactato, causando acidificação do espaço extracelular. O fluxo de produção de prótons no meio é medido por mudanças no ECAR. Os níveis de glicólise basal são estabelecidos primeiro, após o que a glicose é injetada no meio de ensaio, que é desprovido de glicose, para induzir a glicólise e, assim, aumentar os níveis de ECAR22. A oligomicina é injetada para induzir o ECAR “mais alto”, pois interrompe a produção de ATP mitocondrial, forçando assim a célula a derivar seu ATP através da glicólise. Finalmente, a glicólise é interrompida pela adição de 2DG, que inibe a hexoquinase, a primeira enzima da glicólise23. Qualquer ECAR remanescente é provavelmente devido a outras fontes de acidificação, como a produção de CO2 pelo ciclo de TCA durante OXPHOS, e é denotado como ECAR não glicolítico. A reserva glicolítica é calculada como a diferença entre o ECAR “mais alto” e o ECAR na presença de glicose. A capacidade glicolítica é a soma da glicólise e da reserva glicolítica. Figura 1: Componentes da placa e do cartucho do sensor . (A) O instrumento, o software de análise de dados e a interface de configuração do protocolo são mostrados. No layout da placa de cultura de 96 poços, as células são banhadas nos poços de cor azul e os quatro poços de canto são marcados em preto, pois servem como poços de correção traseiros que contêm apenas mídia (e nenhuma célula). (B) Existem quatro portas de drogas para cada poço do cartucho sensor onde as drogas A, B, C e D podem ser carregadas. Os volumes a serem pipetados em cada porta são listados com base nos cálculos para 10x preparações de estoque de medicamentos. (C) O cartucho do sensor consiste em sondas do sensor que são colocadas diretamente na placa de serviço público cheia do calibrador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Linha do tempo do ensaio. As células são semeadas na placa de cultura celular. Uma vez pronto, o ensaio envolve um procedimento de 2 dias seguido de quantificação do conteúdo de proteína usando o ensaio de BCA e posterior análise dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Gráficos representativos do Mito Stress Test e do Glycolytic Stress Test. Os cálculos dos parâmetros (A) Mito Stress Test e (B) Glycolytic Stress Test são descritos no esquema. (C) Curva representativa do consumo de oxigênio (OCR) e (D) parâmetros do Mito Stress Test para PSE-H são mostrados. (E) Curva representativa da taxa de acidificação extracelular (ECAR) e (F) parâmetros do Teste de Estresse Glicolítico para H-PSE são mostrados. Barras de erro são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Comparação de BAM15 versus FCCP como agente de desacoplamento. Mito Stress Test em H-PSE comparando a eficácia da indução de respiração máxima usando 10 μM BAM15, 500 nM FCCP ou 1 μM FCCP, mostrando os parâmetros (A) taxa de consumo de oxigênio (OCR) e (B) Mito Stress Test. Barras de erro são meios ± SEM. **** p ≤ 0,0001; ns, não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Teste Glicose (mM) GlutaMax (mM) Piruvato de sódio (mM) HEPES (mM) Mito Teste de Estresse 25 2 1 1 Teste de Estresse Glicolítico Nenhum 0.5 Nenhum 1 Tabela 1: Concentração de suplementos adicionados ao meio de ensaio para os testes de Mito e Estresse Glicolítico.  Teste Porta A Porta B Porta C Mito Teste de Estresse Oligomicina 2,5 μM FCCP 500 nM OU BAM15 10 μM Rotenone 2 μM E Antimicina A 2 μM Teste de Estresse Glicolítico Glicose 10 mM Oligomicina 2 μM 2-Desoxiglicose 50 mM Tabela 2: Concentrações das injeções do fármaco para os testes de Mito e Estresse Glicolítico. É importante notar que estas são as concentrações finais a que as células são expostas após a injeção das drogas em cada poço. Os medicamentos devem ser preparados 10x mais forte ao carregar os portos de drogas. Prazo Definição Calibrador O calibrador é uma solução que é usada para calibrar o cartucho do sensor. Sua formulação é proprietária e tem uma composição semelhante à PBS. Cartucho do sensor O cartucho sensor contém dois fluoróforos embutidos na manga do cartucho sensor que são conectados a feixes de fibra óptica que emitem luz, excitando os fluoróforos. Um fluoróforo mede o fluxo de oxigênio e o outro mede o fluxo de prótons. Cada cartucho sensor também é equipado com 4 portas para permitir a administração sequencial de até 4 compostos por poço durante o ensaio. Placa de utilidade A placa de utilidade (também conhecida como placa calibradora) é usada para calibrar os sensores. A solução calibradora é colocada na placa de utilidade. Mito Teste de Estresse O Mito Stress Test é o nome do ensaio que fornece o perfil bioenergético da respiração mitocondrial, plotando mudanças na OCR ao longo do tempo. Teste de Estresse Glicolítico O Teste de Estresse Glicolítico é o nome do ensaio que fornece o perfil bioenergético glicolítico traçando mudanças no ECAR ao longo do tempo. Taxa de consumo de oxigênio (OCR) A taxa de consumo de oxigênio é uma medida do fluxo de oxigênio (pmol/min) e indica o estado metabólico mitocondrial. Taxa de Acidificação Extracelular (ECAR) A taxa de acidificação extracelular é uma medida do efluxo de prótons (mpH/min) e indica o estado metabólico glicolítico. Wave Software O Software Wave é utilizado para programação do ensaio e posterior análise dos dados Consumo de oxigênio não mitocondrial Medição da taxa mínima após injeção de rotenona/antimicina A Respiração Basal (Última medição da taxa antes da primeira injeção) – (Taxa de Respiração Não Mitocondrial) Respiração Máxima (Medição da taxa máxima após a injeção de FCCP) – (Respiração não mitocondrial) Vazamento de H+ (próton) (Medição da taxa mínima após a injeção de oligomicina) – (Respiração não mitocondrial Produção de ATP (Última medição da taxa antes da injeção de Oligomicina) – (Medição da taxa mínima após a injeção de Oligomicina) Capacidade Respiratória Ociosa (Respiração Máxima) – (Respiração Basal) Capacidade Respiratória Sobressalente em % (Respiração Máxima) / (Respiração Basal) × 100 Eficiência de Acoplamento Taxa de Produção de ATP) / (Taxa de Respiração Basal) × 100 Glicólise (Medição da taxa máxima antes da injeção de oligomicina) – (Última medição da taxa antes da injeção de glicose) Capacidade Glicolítica (Medição da taxa máxima após a injeção de oligomicina) – (Última medição da taxa antes da injeção de glicose) Reserva Glicolítica (Capacidade Glicolítica) – (Glicólise) Reserva Glicolítica em % (Taxa de Capacidade Glicolítica) /(Glicólise) × 100 Acidificação não glicolítica Última medição da taxa antes da injeção de glicose Tabela 3: Lista de definições dos principais componentes do ensaio.

Discussion

Este protocolo otimizado para respirometria de alta resolução de H-RPE envolve o uso de BAM15 como desacoplador em vez do FCCP comumente usado. Enquanto estudos prévios sobre a respirometria de alta resolução da PSE utilizaram o FCCP 9,24, a BAM15 parece induzir uma indução mais robusta dos níveis respiratórios máximos em PSE-H em comparação com o FCCP. Enquanto tanto o FCCP quanto o BAM15 são seguros para uso em células, o BAM15 é relatado para ter menos efeitos colaterais em células normais em comparação com FCCP ou carbonilcianeto-3-clorofenilhidrazona (CCCP)25. mostraram que a BAM15 despolariza as mitocôndrias sem afetar o potencial de membrana plasmática, induzindo assim uma taxa de respiração mitocondrial máxima sustentada com baixa citotoxicidade26. O FCCP, por outro lado, despolariza tanto a mitocôndria quanto a membrana plasmática e apresenta maior citotoxicidade26.

Existem várias etapas críticas no protocolo, incluindo garantir que as células sejam devidamente plaqueadas em uma monocamada confluente, uniforme e homogênea de EPR em todos os poços experimentais da microplaca. Os EPR maduros são altamente dependentes do OXPHOS para a geração de energia e, portanto, as células devem ser deixadas amadurecer por pelo menos 1 mês para garantir que o EPR gere leituras basais e máximas adequadas de OCR durante o ensaio. A desgaseificação da placa de cultura celular por 1 h a 37 °C em um forno umidificado (sem CO 2) antes de colocá-la no instrumento é crucial para leituras precisas de ECAR, pois o CO2 pode afetar o pH do meio de ensaio. É importante lembrar de hidratar o cartucho do sensor no dia anterior ao ensaio para garantir que ele forneça leituras confiáveis de OCR e ECAR no dia do ensaio. Deve-se tomar cuidado para reconstituir adequadamente os medicamentos a serem injetados e aliar os estoques de medicamentos reconstituídos em volumes menores para armazenamento de longo prazo para minimizar os ciclos de congelamento/descongelamento. É fundamental preparar 10x soluções de fármacos que são diluídas nos respectivos meios de ensaio (por exemplo, diluir em meio de ensaio Mito Stress Test para o Mito Stress Test) para considerar a diluição da injeção do fármaco em cada poço preenchido com meios de ensaio. A cada injeção subsequente de fármaco há mais meios em cada poço e, portanto, os volumes de droga que estão sendo carregados aumentam a cada injeção, e deve-se tomar cuidado para seguir os volumes especificados no protocolo. É importante realizar verificações de qualidade após a conclusão do experimento, examinando o cartucho do sensor para garantir que nenhum medicamento residual seja evidente e observando a placa de cultura celular sob um microscópio para garantir que a monocamada celular confluente e homogênea permaneça.

Modificações a este protocolo incluem injetar diferentes drogas nos portos e determinar como essas drogas afetam as leituras de OCR e ECAR. Uma modificação popular é injetar uma droga experimental de escolha como Port A antes de injetar as drogas usuais Mito ou Glycolytic Stress Test. Esse tipo de protocolo fornece informações sobre como uma injeção aguda da droga de escolha afeta os parâmetros subsequentes de OXPHOS e glicolíticos. Outras modificações incluem examinar diferentes tipos celulares; isso requer a solução inicial de problemas da densidade celular de semeadura ideal e a otimização do meio de ensaio, garantindo que as leituras basais variem de 50-100 pmol/min para OCR e 10-20 mpH/min para ECAR. As concentrações ótimas dos fármacos injetáveis precisam ser determinadas para cada novo tipo celular examinado, observando-se as respostas de OCR e ECAR a uma diluição seriada dos fármacos.

Uma limitação chave do protocolo é que a viabilidade celular diminui com o tempo, uma vez que as células não estão em uma incubadora de CO2 em seu meio de crescimento normal e, portanto, o ensaio deve ser concluído dentro de 3-4 h para garantir a máxima viabilidade celular. Além disso, a exposição a toxinas mitocondriais injetadas em cada poço pode diminuir ainda mais a viabilidade celular ao longo do tempo. Uma vez concluído o ensaio, as células devem ser lisadas para avaliação do conteúdo de proteínas para normalizar as leituras de OCR e ECAR e, portanto, as mesmas células não podem ser colhidas para ensaios subsequentes de biologia molecular.

Alternativas ao cavalo-marinho para perfilagem bioenergética incluem o Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 e Resipher (Lucid Scientific)7. O Oroboros O2k é um respirômetro fechado de duas câmaras que utiliza eletrodos polarográficos de oxigênio do tipo S1 Clark. Enquanto o Oroboros O2k produz medidas altamente sensíveis do fluxo metabólico em tempo real, o dispositivo é trabalhoso, pois o operador é obrigado a injetar manualmente cada droga30. O BaroFuse é um novo sistema de perfusão microfluídica multicanal que usa pressão de gás para permitir múltiplos experimentos de perfusão paralela e está ligado a um sistema de detecção de oxigênio para medir OCR. A vantagem deste sistema de cultura em fluxo é que a função e a viabilidade dos tecidos são mantidas, ao contrário do cavalo-marinho, onde a viabilidade celular diminui ao longo de ensaios mais longos. O Resipher utiliza sensores ópticos de oxigênio altamente sensíveis para medir OCR enquanto as células estão em uma placa de 96 poços na incubadora, permitindo assim medições contínuas de OCR ao longo de várias semanas a meses. Notavelmente, esses instrumentos não medem ECAR e, portanto, o Cavalo-Marinho tem a vantagem da exploração simultânea de OXPHOS e glicólise.

Interrogar perfis bioenergéticos em tempo real de OXPHOS e glicólise está emergindo como um fator-chave na caracterização da saúde e função do EPR. A respirometria de alta resolução permite um meio eficiente de comparar o estado metabólico de PSE normal e doente, abrindo assim novas vias de rastreamento da eficácia de drogas para doenças retinianas, como DMRI e RVP. Direções futuras para a respirometria de alta resolução em PSE incluem a otimização de um protocolo para examinar perfis bioenergéticos para monocamadas de EPR altamente polarizadas cultivadas em filtros transwell. (2016) conseguiram isso com sucesso cortando uma seção triangular da monocamada polarizada de EPR cultivada em filtros transwell31. A expansão adicional da metodologia inclui o exame dos perfis bioenergéticos de EPR derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (EPRp-iPSC), isolado de pacientes com diferentes condições degenerativas da retina32. A exploração de como as citocinas patogênicas envolvidas na DMRI e na RVP impactam a natureza dinâmica do metabolismo do EPR pode revelar vulnerabilidades metabólicas que podem informar a identificação de novos alvos farmacológicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado em parte por bolsas de: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); Programa de Bolsas de Pós-Doutorado da Fundação BrightFocus em Pesquisa de Degeneração Macular (M2021010F, D.Y.S.); Departamento de Defesa, Programa de Pesquisa em Visão Espinhal sob o Prêmio nº VR180132 (M.S.-G. e L.A.K.); Instituto Nacional de Olhos dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio nº R01EY027739 (L.A.K.). O reconhecimento é feito aos doadores do Macular Degeneration Research M2021010F, um programa da Fundação BrightFocus, pelo apoio a esta pesquisa. Os esquemas foram criados com Biorender.com

Materials

2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S  Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay
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References

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Fitch, T. C., Frank, S. I., Li, Y. K., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (192), e64572, doi:10.3791/64572 (2023).
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