JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64572
, , , , ,
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology,Harvard Medical School

Summary

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Abstract

Metabole disfunctie van retinale pigmentepitheelcellen (RPE) is een belangrijke pathogene aanjager van retinale ziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en proliferatieve vitreoretinopathie (PVR). Aangezien RPE zeer metabolisch actieve cellen zijn, weerspiegelen veranderingen in hun metabole status veranderingen in hun gezondheid en functie. Hoge resolutie respirometrie maakt real-time kinetische analyse mogelijk van de twee belangrijkste bio-energetische routes, glycolyse en mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS), door middel van kwantificering van respectievelijk de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR). Het volgende is een geoptimaliseerd protocol voor het uitvoeren van respirometrie met hoge resolutie op primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE). Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de stappen die betrokken zijn bij het produceren van bio-energetische profielen van RPE om hun basale en maximale OXPHOS- en glycolytische capaciteiten te definiëren. Het blootstellen van H-RPE aan verschillende medicijninjecties gericht op de mitochondriale en glycolytische machinerie resulteert in gedefinieerde bio-energetische profielen, waaruit belangrijke metabole parameters kunnen worden berekend. Dit protocol benadrukt de verbeterde respons van BAM15 als ontkoppelingsmiddel in vergelijking met carbonylcyanide p-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP) om de maximale ademhalingscapaciteit in RPE te induceren. Dit protocol kan worden gebruikt om de bio-energetische status van RPE onder verschillende ziekteomstandigheden te bestuderen en de werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen te testen bij het herstellen van de basale metabole status van RPE.

Introduction

Retinale pigmentepitheelcellen (RPE) bestaan als een monolaag van gepigmenteerde epitheelcellen die strategisch zijn gelegen tussen de fotoreceptoren en fenestrated endotheel van de choriocapillaris. RPE zijn zeer metabolisch actief met tal van functies, waaronder (1) fagocytose van afgeworpen fotoreceptorschijven, (2) recycling van visueel pigment om de visuele cyclus te behouden, (3) transport van voedingsstoffen, metabolieten, ionen en water, (4) absorptie van licht, (5) bescherming tegen fotooxidatie, (6) secretie van essentiële factoren om de integriteit van het netvlies te ondersteunen, en (7) vorming van de buitenste bloed-retinale barrière1 . Degeneratie van RPE is geassocieerd met metabole disfunctie en mitochondriale defecten, wat leidt tot verblindende oogziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en proliferatieve vitreoretinopathie (PVR)2.

Twee belangrijke bio-energetische routes zijn glycolyse, die optreedt in het cytoplasma, en oxidatieve fosforylering (OXPHOS), die optreedt in mitochondriën. Tijdens glycolyse wordt één molecuul glucose omgezet in twee moleculen pyruvaat en een nettoproductie van twee moleculen adenosinetrifosfaat (ATP). In tegenstelling tot glycolyse produceert OXPHOS veel hogere niveaus van ATP (~ 32-38 moleculen ATP per glucosemolecuul). Met name OXPHOS verbruikt zuurstof en vereist functionele mitochondriën, terwijl glycolyse optreedt in het cytoplasma en geen zuurstof vereist.

Voorafgaand aan de introductie van op fluorescentie of fosforescentie gebaseerde technieken om mitochondriale ademhaling te onderzoeken, werden zuurstofniveaus gemeten in gepermeabiliseerde celsuspensies in kamers uitgerust met een Clark-type zuurstofelektrode3. Hoewel de Clark-elektrode veel goedkoper is dan op fluorescentie gebaseerde respirometrie en werkt in niet-hechtende cellen, is het een relatief lage doorvoer, waarbij elke ademhalingsloop ongeveer 15-20 minuten duurt en veel grotere hoeveelheden cellen vereist voor elk monster3. Zo heeft de op fluorescentie gebaseerde respirometrietechniek de Clark-elektrode grotendeels vervangen en is het een populaire techniek geworden op het gebied van metabolisme en mitochondriaal onderzoek.

Dit protocol beschrijft een high-throughput, high-resolution, fluorescentie-gebaseerde respirometrietechniek die kinetisch de OXPHOS- en glycolytische bio-energetische profielen van levende cellen meet. Omdat het proces van OXPHOS zuurstof verbruikt, wordt het bio-energetische profiel voor OXPHOS geproduceerd door veranderingen in de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) in de loop van de tijd in kaart te brengen4. Bij deze techniek zijn twee fluoroforen ingebed in de sensorcartridgehuls die is verbonden met glasvezelbundels die licht uitzenden, waardoor de fluoroforen worden opgewonden. Veranderingen in fluorofooremissie worden gemeten door zeer gevoelige fluorescentiesensoren en doorgegeven via de glasvezelbundel om te worden omgezet in een OCR-uitlezing5. De fluorofoor wordt geblust door zuurstof, waardoor de bepaling van extracellulaire zuurstofniveaus in de testmedia, bekend als zuurstofflux of OCR, mogelijk wordt. De andere fluorofoor is een pH-sensorsonde die gevoelig is voor veranderingen in proton-efflux, die wordt omgezet in een maat voor extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR). Tijdens metingen worden de glasvezelbundels met ingebedde fluoroforen verlaagd tot 200 μm boven de celmonolaag, waardoor een voorbijgaande microkamer ontstaat die snelle, realtime metingen mogelijk maakt. Zodra een verandering van 10% in zuurstof- of protonniveaus wordt gedetecteerd, worden de sensoren naar boven getild, waardoor een groter volume media zich kan mengen met de transiënte microkamermedia, waardoor OCR- en ECAR-waarden worden hersteld naar de basislijn. Elke sensorcartridge is uitgerust met vier poorten om de sequentiële toediening van maximaal vier verbindingen per put tijdens de test mogelijk te maken. Metingen kunnen worden verzameld voor en na injectie van de verbindingen in elke poort, waardoor belangrijke informatie over de metabole status van de cellen wordt onthuld.

Het ondervragen van deze twee verschillende metabole routes kan belangrijke ontdekkingen opleveren met betrekking tot de metabole status van RPE na blootstelling aan verschillende pathogene stimuli, en kan dus worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen te testen bij het herstellen van de metabole integriteit van RPE 6,7,8. De komst van high-throughput respirometrie en de beschikbaarheid van specifieke mitochondriale remmers hebben meer onderzoek gestimuleerd bij het definiëren van de bio-energetische profielen van RPE en het identificeren van defecten in het metabolisme en mitochondriën tijdens ziektetoestanden 6,7,8,9,10,11,12,13 . Hoge resolutie respirometrie heeft de sleutelrol van metabole herprogrammering van RPE in retinale pathologieën zoals AMD en PVR benadrukt. Twee belangrijke cytokines die betrokken zijn bij de pathogenese van AMD en PVR transformeren groeifactor-bèta 2 (TGFβ2) en tumornecrosefactor-alfa (TNFα). De inductie van epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) door TGFβ2 gaat gepaard met mitochondriale disfunctie, OXPHOS-onderdrukking en een compenserende toename van de glycolytische capaciteit in RPE6. Meer recent is aangetoond dat het pro-inflammatoire cytokine, TNFα, een significante upregulatie van basale OXPHOS en verminderde glycolyse in H-RPE7 induceert. De toediening van dimethylfumaraat onderdrukte significant TNFα-geïnduceerde ontsteking in H-RPE en herstelde mitochondriale morfologie en basale bio-energetische profielen7. De uiteenlopende metabole profielen geïnduceerd door deze twee groeifactoren stimuleren intrigerende mechanistische vragen met betrekking tot de betrokkenheid van metabole herprogrammering bij netvliesaandoeningen. Het volgende protocol beschrijft de stappen voor het beoordelen van OXPHOS en glycolytische bio-energetische profielen in H-RPE met behulp van hoge-resolutie respirometrie.

Protocol

1. Beplating van H-RPE in de celkweekplaat Ontdooi H-RPE in een T25-kolf in humaan RPE-medium aangevuld met RPE-groeimediumsupplementen (4 mM L-glutamine, 25 ng / ml FGF-2, 2% FBS, 30 mg / ml gentamicine en 15 μg / ml amfotericine). Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Ververs de media de volgende dag en wacht tot de cellen ten minste 80% samenvloeiing hebben bereikt voordat ze in een verhouding van 1:3 in een T75-kolf terechtkomen. Eenmaal samenvloeiend, passeer de cellen met behulp van de subcultuurreagentiakit bestaande uit trypsine / EDTA 0,025% oplossing, trypsine-neutraliserende oplossing en HEPES gebufferde zoutoplossing (pH 7,0-7,6).Spoel H-RPE voorzichtig af met 3 ml HEPES gebufferde zoutoplossing. Voeg vervolgens 3 ml trypsine/EDTA toe en incubeer (37 °C en 5% CO2) gedurende 5 minuten (of totdat de cellen van de bodem van de kolf zijn opgetild, zoals waargenomen onder de microscoop). Neutraliseer de trypsine/EDTA met 3 ml trypsine-neutraliserende oplossing. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 3,5 minuten om de celkorrel te vormen. Zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg. Resuspendie van de cellen in menselijk RPE-medium tot een uiteindelijke concentratie van 20.000 cellen per 100 μL per put.Pipetteer meerdere keren op en neer om ervoor te zorgen dat de celsuspensie homogeen is, met behulp van een meerkanaalspipet voor gemak en consistentie van pipetteren in de 96-well celkweekmicroplaat. Laat de pipetpunt net onder de ronde rand aan de bovenkant van de put rusten voor een gelijkmatige, homogene cellaag.OPMERKING: Er is geen coating nodig omdat de cellen goed hechten aan de microplaat. Zorg ervoor dat u de vier hoekputten leeg laat van cellen (alleen 100 μL media) om te dienen als de achtergrondcorrectieputten (figuur 1A).OPMERKING: De microplaat is geformatteerd in een typisch 96-well plaatontwerp; Het oppervlak van elke put is echter 0,106 cm2, wat 40% kleiner is dan een standaard plaat met 96 putten. Bij deze celdichtheid moeten de cellen de volgende dag 100% confluent zijn. Het wordt aanbevolen om eerst een celdichtheidsoptimalisatie-experiment uit te voeren voordat behandelingen worden getest om ervoor te zorgen dat basale OCR- en ECAR-metingen respectievelijk ongeveer 50-100 pmol / min en 10-20 mpH / min zijn. Laat de celkweekplaat 1 uur op kamertemperatuur (RT) staan voordat u deze terug in de couveuse plaatst (5% CO2, 37 °C, bevochtigd) om randeffecten te minimaliseren. Randeffecten zijn veranderingen in het mediavolume in de putten van de perifere randen van de 96-putplaat als gevolg van verdamping14.OPMERKING: De cellen hechten zich ‘s nachts en vormen de volgende dag een confluente monolaag. H-RPE worden minstens 1 maand in de plaat gerijpt door elke 2-3 dagen de helft van de groeimedia te verversen. Onderzoek de cellen onder de microscoop voordat u de media verandert om hun morfologie en pigmentatieniveau te controleren. Zorg ervoor dat de cellen samenvloeien met een karakteristieke kasseiachtige morfologie en in de loop van de tijd pigmentatie krijgen, zoals te zien is in de morfologiebeelden in Shu et al.7. 2. De dag voor het uitvoeren van de test Zorg ervoor dat de sensorpatroon de dag voor de test is gehydrateerd door elke put van de gebruiksplaat te vullen met 200 μL gedeïoniseerd water.OPMERKING: Het deksel van de gebruiksplaat bevat fluorescerende biosensoren voor het meten van zuurstof- en pH-waarden voor elke put. De sensoren zijn gekoppeld aan glasvezelgolfgeleiders die licht leveren op verschillende excitatiegolflengten en een fluorescerend signaal via optische filters naar fotodetectoren sturen. Plaats de sensorcartridge ondergedompeld in water in de nutsplaat samen met ~ 20 ml van het kaliber (om op te warmen voor gebruik de volgende dag) in een 37 ° C bevochtigde oven (zonder CO2) ‘s nachts.OPMERKING: Het kaliber is een gepatenteerde oplossing die is ontworpen voor de kalibratie van sensorcartridges en is waarschijnlijk vergelijkbaar in samenstelling met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De minimale tijd voor patroonhydratatie is 4 uur, maar de beste resultaten worden verkregen met nachtelijke hydratatie. Zorg ervoor dat het instrument is ingeschakeld en start de software zodat het instrument ‘s nachts kan stabiliseren tot 37 °C (figuur 2). Over het algemeen kan het instrument aan blijven staan, zelfs als het niet in gebruik is. 3. Real-time Mito Stress Test met behulp van de extracellulaire flux analyzer Vervang op de dag van de test het water in de gebruiksplaat door een gelijk volume verwarmd kaliber ten minste 45 minuten voordat de test wordt uitgevoerd. Maak de Mito-stresstesttestmedia met behulp van het basismedium zonder fenolrood door supplementen toe te voegen, zoals weergegeven in tabel 1. Verwarm de media tot 37 °C, stel de pH in op 7,4 en filter de media vacuüm met behulp van een buisvormige filtereenheid. Voor het uitvoeren van een volledige plaat, maak ~ 25 ml assay media. Verwijder de menselijke RPE-media en vervang deze door 180 μL vers bereide testmedia (stap 3.2). Plaats de celkweekplaat gedurende 1 uur in een bevochtigde oven van 37 °C (zonder CO2) voordat u met de test begint.OPMERKING: Dit is belangrijk voor het ontgassen van de celplaat, waardoor CO 2-diffusie mogelijk is. Aangezien de cellen zich niet langer in hun groeimedia bevinden en niet langer in een incubator met CO2, zal hun levensvatbaarheid na verloop van tijd verslechteren, daarom moet ervoor worden gezorgd dat de test zo efficiënt mogelijk wordt uitgevoerd. Er moet ook voor worden gezorgd dat er geen bellen in de celkweekplaat zitten; Als die aanwezig zijn, pop ze dan met een pipet of naald. Elke sensorpatroon heeft vier reagensafgiftepoorten per put voor de injectie van teststoffen in de putjes van de celkweekplaat tijdens de test (figuur 1C,D). Bereid ~ 3 ml van de 10x geneesmiddeloplossingen door de medicijnvoorraden in de respectieve testmedia te verdunnen volgens tabel 2. Laad bijvoorbeeld poort A met 25 μM oligomycine opgelost in de Mito-stresstesttestmedia, zodat wanneer het geneesmiddelvolume door het instrument in de put wordt geïnjecteerd, de uiteindelijke concentratie waaraan elke cel wordt blootgesteld 2,5 μM is. Pipetteer 20 μL van de 10x medicijnvoorraad in poort A, 22 μl in poort B, en 25 μL in poort C, om de gespecificeerde uiteindelijke geneesmiddelconcentratie in elke put te bereiken. Voor protocollen die alle vier de drugspoorten vereisen, pipet 28 μL in poort D.OPMERKING: Raadpleeg figuur 1B bij het pipetteren van de geneesmiddelen in de drugspoorten voor de juiste oriëntatie van poorten A / B / C / D. De inkeping aan de rand van de cartridge moet zich in de linkerbenedenhoek bevinden bij het laden van de medicijnpoorten. Door onder een hoek in elke drugpoort te pipetteren, kunnen bubbels worden geminimaliseerd. Als er bubbels aanwezig zijn, moet ervoor worden gezorgd dat ze met een pipet of naald worden gesprongen. Open het tabblad Sjablonen in de analysesoftware, selecteer Mito-stresstest en vul de groepsdefinities in.Voer details in over de injectiestrategie (in dit geval wordt deze vooraf ingevoerd als de Mito-stresstestgeneesmiddelen). Invoerdetails met betrekking tot de verschillende experimentele groepen in de test (bijv. Controle of behandeling). Voer details in op de assaymedia (toevoeging van verschillende supplementen en hun specifieke concentraties aan de basistestmedia) en voeg ten slotte het celtype toe. Klik op het volgende tabblad, Plate Map, waar de verschillende groepen die worden onderzocht worden toegewezen aan hun specifieke locatie op de 96-well plate map. Zodra dit is gebeurd, klikt u op het tabblad Protocol om het instrumentprotocol voor het standaard Mito-stresstestprotocol te bekijken.OPMERKING: De standaard Mito Stress Test-sjabloon is klaar voor gebruik, maar kan op elke manier worden aangepast aan het experimentele ontwerp. De standaard meettijd is bijvoorbeeld 3 min, maar dit kan desgewenst worden aangepast naar 5 min. Klik op Run the Assay en plaats de sensorcartridge die is ondergedompeld in de kaliberoplossing in de bedieningsplaat. Dit proces duurt ongeveer 25 minuten. In deze stap wordt elke biosensor onafhankelijk gekalibreerd op basis van de sensoruitgang gemeten in de kaliberoplossing van bekende pH- en zuurstofconcentratie.Zodra dit is gekalibreerd, verwijdert u de gebruiksplaat en plaatst u de celkweekplaat.OPMERKING: De celkweekplaat wordt eerst in evenwicht gebracht, waarna het instrument begint met het mengen van de testmedia en het meten van de OCR- en ECAR-waarden. Deze stap duurt ongeveer 1,5 uur en wordt in het instrument uitgevoerd zonder tussenkomst van de gebruiker. Een basislijnmeting van OCR en ECAR wordt eerst vastgesteld door de testmedia gedurende 3 minuten te mengen en vervolgens OCR en ECAR gedurende 3 minuten te meten. Het instrument voert drie loops van mixen en meten uit. Na de nulmeting injecteert het instrument automatisch de Port A-medicijnoplossing in elke put. Dit wordt gevolgd door drie lussen van mengen en meten (elk 3 minuten). Hetzelfde patroon treedt op na elke volgende medicijninjectie (poorten B en C). Zodra de run is voltooid, verwijdert u de celkweekplaat en sensorcartridge. Zorg er voor kwaliteitscontroledoeleinden voor dat alle medicijnpoorten in de sensorcartridge zijn geïnjecteerd door de poorten te onderzoeken om te controleren of er geen restgeneesmiddel overblijft. Gooi de sensorcartridge en de gebruiksplaat weg omdat het items voor eenmalig gebruik zijn. Onderzoek de cellen in de microplaat van de celkweek onder de microscoop om er zeker van te zijn dat er nog steeds een confluente monolaag van cellen is. Gooi de testmedia weg en vervang deze door 60 μL 1x lysisbuffer in elk putje.OPMERKING: De lysisbuffer is gemaakt van 10x lysisbuffer verdund tot 1x in gedeïoniseerd water met toevoeging van 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Wikkel de randen van de plaat in Parafilm om verdamping te voorkomen en plaats deze in een vriezer van -80 °C om ‘s nachts te helpen bij cellysis, voordat het eiwitgehalte wordt gekwantificeerd met behulp van de BCA-test. Voor gegevensanalyse normaliseert u alle gegevens door de OCR- en ECAR-waarden te delen door het microgram eiwit in elke put. Exporteer de Mito Stress Test-rapportgenerator, die Excel-macro’s gebruikt om automatisch de Mito-stresstestparameters te berekenen met behulp van de gegevensanalysesoftware.OPMERKING: Dit kan worden gebruikt om basale ademhaling, maximale ademhaling, reserve ademhalingscapaciteit, protonenlekkage, ATP-productie en niet-mitochondriale ademhaling te bepalen. De definities van deze berekeningen zijn opgenomen in tabel 3. 4. Real-time glycolytische stresstest met behulp van de extracellulaire fluxanalysator Voer de glycolytische stresstest uit door dezelfde stappen te volgen als de Mito-stresstest, behalve met behulp van de verschillende assaymediasupplementen en medicijninjecties die worden weergegeven in tabel 1 en tabel 2. Voor gegevensanalyse exporteert u de rapportgenerator voor glycolytische stresstests, die Excel-macro’s gebruikt om automatisch de parameters van de glycolytische stresstest uit de gegevensanalysesoftware te berekenen.OPMERKING: Dit kan worden gebruikt om niet-glycolytische verzuring, glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve te bepalen. De definities van deze berekeningen zijn opgenomen in tabel 3. 5. BCA-eiwitkwantificeringstest OPMERKING: De bicinchonic acid (BCA) eiwitkwantificeringstest (ook bekend als de Smith-assay15) is een op koper gebaseerde colorimetrische test die wordt gebruikt om het totale eiwitgehalte in een monster te bepalen. Het normaliseren van OCR- en ECAR-gegevens naar het microgram eiwit in elke put zorgt ervoor dat verschillende hoeveelheden cellen / eiwitten in elke put de metingen niet scheeftrekken. Het mechanisme van de BCA-test is gebaseerd op twee chemische reacties. Ten eerste reduceren de peptidebindingen in eiwitten koperionen (Cu2+) tot koperionen (Cu+), een temperatuurafhankelijke reactie die wordt bijgestaan door hogere temperaturen (37 tot 60 °C). Als er meer peptidebindingen zijn, waardoor de hoeveelheid Cu2+ evenredig is met het eiwitgehalte in de oplossing16. Deze reactie resulteert in een kleurverandering van groen naar een intens paarse oplossing, met een piekabsorptie bij 562 nm16. Hoe hoger het eiwitgehalte in het monster, hoe hoger de absorptie bij deze golflengte. Het werkbereik van deze kit is 20-2.000 μg / ml. De BCA-testkit bevat 1 ml aliquots runderserumalbumine (BSA) bij 2 mg / ml, die dient als de referentiestandaard voor eiwitconcentratie. Bereid een seriële verdunning in een heldere plaat met 96 putten met platte bodem door te beginnen met de onverdunde BSA van 2 mg / ml en vervolgens de concentratie te halveren door te verdunnen in gedeïoniseerd water (bijv. 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg / ml, enz.). Het gebruik van een bekende eiwitconcentratie maakt de berekening van een standaardcurve mogelijk, die wordt gebruikt om het eiwitgehalte van de experimentele monsters te berekenen. Om de nauwkeurigheid van de berekende eiwitgehaltemetingen te verbeteren, meet u de absorptiemetingen van de referentienormen voor eiwitconcentraties naast de experimentele monsters voor elke test. Pipetteer 25 μL van elke BSA seriële verdunning in tweevoud in de 96-well plaat. Pipetteer 25 μL van de 1x lysisbuffer in tweevoud in de 96-putplaat om als blanco te dienen. Ontdooi de celkweekplaat tot kamertemperatuur en pipetteer 25 μL van elk cellysaat in tweevoud in de 96-putplaat. Bereid het werkende reagens voor in een verhouding van 50:1 van BCA-kitreagentia A:B. Meng grondig door vortexing om eventuele troebelheid in het werkende reagens te verwijderen, zodat het een homogene groene oplossing is. Voeg 200 μL van het werkende reagens toe aan elk putje. Bescherm de plaat tegen licht door de plaat te bedekken met folie en incubeer gedurende 20 minuten in een oven van 37 °C. Meet de absorptie bij 562 nm in een 96-well plaatlezer. Voor gegevensanalyse neemt u het gemiddelde van alle dubbele waarden. Trek de blanco-absorptieniveaus bepaald van de 1x lysisbufferputten af van de metingen van alle monsters. Bepaal de standaardcurve door de absorptie van elke BSA-standaard uit te zetten tot de bekende concentratie in μg/ml. Gebruik de lineaire vergelijking afgeleid van de standaardcurve om de eiwitconcentratie van de experimentele monsters te bepalen.

Representative Results

Het instrument meet tegelijkertijd zowel OCR als ECAR voor elke run. Voor de Mito-stresstest zijn parameterberekeningen gebaseerd op OCR-metingen (figuur 3A), terwijl voor de glycolytische stresstest parameterberekeningen zijn gebaseerd op ECAR-metingen (figuur 3B). Figuur 3 toont representatieve grafieken voor de Mito Stress Test OCR-curve in de tijd (Figuur 3C) en parameterberekeningen in de vorm van staafdiagrammen voor H-RPE (Figuur 3D). De glycolytische stresstest wordt weergegeven als een ECAR-curve in de loop van de tijd (figuur 3E) en parameterberekeningen worden weergegeven in staafdiagrammen voor H-RPE (figuur 3F). Basale ademhaling geeft inzicht in de energetische eisen van de cellen onder basale omstandigheden17. De eerste medicijninjectie, oligomycine (Oligo), is een ATP-synthaseremmer en dus is elke vermindering van OCR na de eerste medicijninjectie een maat voor ATP-gekoppelde ademhaling18. Elke resterende basale ademhaling na daaropvolgende medicijninjecties wordt beschouwd als een protonlek omdat het niet is gekoppeld aan ATP-synthese. Verhoogd protonlek kan wijzen op een verhoogde mitochondriale ontkoppeling, die wordt gereguleerd door het ontkoppelen van eiwitten die fysiologisch aanwezig zijn, maar ook in verband zijn gebracht met pathologieën zoals obesitas, kanker, diabetes type 2 en hart- en vaatziekten19. De tweede injectie is van een ontkoppelingsmiddel, zoals BAM15 of FCCP, om het maximale ademhalingspotentieel van de mitochondriën te bepalen. Ontkoppelingsmiddelen storten de protongradiënt in en verminderen de proton-aandrijfkracht over het mitochondriale binnenmembraan. Het resultaat is een ongeremde stroom van elektronen door de elektronentransportketen (ETC), die de snelheid van het zuurstofverbruik verhoogt en ervoor zorgt dat de mitochondriale ademhaling zijn maximale capaciteitbereikt 20. Reserve respiratoire capaciteit (SRC) is het verschil tussen maximale en basale ademhaling, wat het vermogen van de cellen aangeeft om te reageren op veranderingen in energetische eisen wanneer ze worden uitgedaagd, wat de celfitheid aangeeft. Belangrijk is dat BAM15 voor de Mito-stresstest in H-RPE superieur is aan FCCP in het verbeteren van de mitochondriale ademhalingscapaciteit (figuur 4A, B), omdat de maximale ademhaling en reserverespiratoire capaciteit aanzienlijk hoger zijn met 10 μM BAM15 in vergelijking met 500 nM of 1 μM FCCP. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen beide FCCP-doses. De derde en laatste injectie van rotenon en antimycine A (Rot / AA) remmen mitochondriale complexen I en III, respectievelijk, van de ETC, die mitochondriale ademhaling afsluit; eventuele resterende OCR is te wijten aan niet-mitochondriale bronnen21. Tijdens glycolyse wordt één molecuul glucose omgezet in twee moleculen lactaat in afwezigheid van zuurstof. De extrusie van lactaat uit de cel gaat gepaard met de efflux van één proton per lactaatmolecuul, waardoor verzuring van de extracellulaire ruimte ontstaat. De flux van protonproductie in de media wordt gemeten aan de hand van veranderingen in ECAR. Basale glycolyseniveaus worden eerst vastgesteld, waarna glucose wordt geïnjecteerd in de testmedia, die geen glucose bevatten, om glycolyse te induceren en zo de ECAR-niveaus te verbeteren22. Oligomycine wordt geïnjecteerd om de “hoogste” ECAR te induceren omdat het de mitochondriale ATP-productie stopt, waardoor de cel gedwongen wordt zijn ATP af te leiden door glycolyse. Ten slotte wordt glycolyse uitgeschakeld door toevoeging van 2DG, dat hexokinase remt, het eerste enzym van glycolyse23. Elke resterende ECAR is waarschijnlijk te wijten aan andere bronnen van verzuring, zoals CO2-productie door de TCA-cyclus tijdens OXPHOS, en wordt aangeduid als niet-glycolytische ECAR. De glycolytische reserve wordt berekend als het verschil tussen de “hoogste” ECAR en de ECAR in aanwezigheid van glucose. De glycolytische capaciteit is de som van de glycolyse en de glycolytische reserve. Figuur 1: Componenten van de plaat en sensorcartridge . (A) Het instrument, de software voor gegevensanalyse en de interface voor het instellen van het protocol worden weergegeven. In de 96-well cultuurplaatlay-out zijn de cellen verguld in de blauwgekleurde putten en zijn de vier hoekputten zwart gemarkeerd, omdat ze dienen als de rugcorrectieputten die alleen media bevatten (en geen cellen). (B) Er zijn vier medicijnpoorten voor elke put van de sensorcartridge waar geneesmiddelen A, B, C en D kunnen worden geladen. De volumes om in elke poort te pipetten worden vermeld op basis van de berekeningen voor 10x geneesmiddelenvoorraadpreparaten. (C) De sensorcartridge bestaat uit sensorsondes die rechtstreeks in de met kaliber gevulde gebruiksplaat worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Tijdlijn van de test. De cellen worden gezaaid in de celkweekplaat. Eenmaal klaar, omvat de test een procedure van 2 dagen, gevolgd door kwantificering van het eiwitgehalte met behulp van de BCA-test en daaropvolgende gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Representatieve grafieken van de Mito Stress Test en Glycolytic Stress Test. Berekeningen van (A) Mito Stress Test en (B) Glycolytic Stress Test parameters zijn weergegeven in het schema. (C) Representatieve zuurstofverbruik (OCR) curve en (D) Mito Stress Test parameters voor H-RPE worden weergegeven. (E) Representatieve extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) curve en (F) Glycolytische stresstestparameters voor H-RPE worden weergegeven. Foutbalken zijn middelen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Vergelijking van BAM15 versus FCCP als ontkoppelingsmiddel. Mito-stresstest op H-RPE waarin de werkzaamheid van het induceren van maximale ademhaling met behulp van 10 μM BAM15, 500 nM FCCP of 1 μM FCCP wordt vergeleken, waarbij de (A) zuurstofverbruikssnelheid (OCR) curve en (B) Mito-stresstestparameters worden weergegeven. Foutbalken zijn ± SEM. **** p ≤ 0,0001; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Test Glucose (mM) GlutaMax (mM) Natriumpyruvaat (mM) HEPES (mM) Mito Stresstest 25 2 1 1 Glycolytische stresstest Geen 0.5 Geen 1 Tabel 1: Concentratie van supplementen toegevoegd aan de testmedia voor de Mito- en Glycolytische Stresstests.  Test Poort A Poort B Poort C Mito Stresstest Oligomycine 2,5 μM FCCP 500 nM OF BAM15 10 μM Rotenon 2 μM EN Antimycine A 2 μM Glycolytische stresstest Glucose 10 mM Oligomycine 2 μM 2-Deoxyglucose 50 mM Tabel 2: Concentraties van drugspoortinjecties voor de Mito- en glycolytische stresstests. Het is belangrijk op te merken dat dit de uiteindelijke concentraties zijn waaraan de cellen worden blootgesteld na injectie van de geneesmiddelen in elke put. De medicijnen moeten 10x sterker worden bereid bij het laden van de drugspoorten. Term Definitie Kalibrant Het kaliber is een oplossing die wordt gebruikt voor het kalibreren van de sensorcartridge. De formulering is gepatenteerd en heeft een vergelijkbare samenstelling als PBS. Sensor Cartridge De sensorcartridge bevat twee fluoroforen ingebed in de cartridgehuls van de sensor die zijn verbonden met glasvezelbundels die licht uitzenden, waardoor de fluoroforen worden opgewonden. De ene fluorofoor meet de zuurstofflux en de andere meet de protonenflux. Elke sensorcartridge is ook uitgerust met 4 poorten om de sequentiële toediening van maximaal 4 verbindingen per put tijdens de test mogelijk te maken. Gebruiksplaat De gebruiksplaat (ook bekend als de kaliberplaat) wordt gebruikt voor het kalibreren van de sensoren. De Calibrant-oplossing wordt in de Utility Plate geplaatst. Mito Stresstest De Mito-stresstest is de naam voor de test die het mitochondriale bio-energetische ademhalingsprofiel biedt door veranderingen in OCR in de loop van de tijd uit te zetten. Glycolytische stresstest De Glycolytische Stress Test is de naam van de test die het glycolytische bio-energetische profiel levert door veranderingen in ECAR in de loop van de tijd te plotten. Zuurstofverbruik (OCR) Zuurstofverbruik is een maat voor de zuurstofflux (pmol/min) en geeft de mitochondriale metabole status aan. Extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) Extracellulaire verzuringssnelheid is een maat voor protonefflux (mpH / min) en geeft de glycolytische metabole status aan. Wave-software De Wave Software wordt gebruikt voor het programmeren van de assay en de daaropvolgende data-analyse Niet-mitochondriaal zuurstofverbruik Minimale snelheidsmeting na Rotenon/antimycine A-injectie Basale ademhaling (Laatste snelheidsmeting vóór de eerste injectie) – (Niet-mitochondriale ademhalingsfrequentie) Maximale ademhaling (Maximale snelheidsmeting na FCCP-injectie) – (Niet-mitochondriale ademhaling) H+ (Proton) Lek (Minimale snelheidsmeting na oligomycine-injectie) – (Niet-mitochondriale ademhaling ATP-productie (Laatste snelheidsmeting vóór oligomycine-injectie) – (Minimale snelheidsmeting na oligomycine-injectie) Reserve ademhalingscapaciteit (Maximale ademhaling) – (Basale ademhaling) Reserve ademhalingscapaciteit in % (Maximale ademhaling) / (Basale ademhaling) × 100 Efficiëntie van de koppeling ATP-productiesnelheid) / (basale ademhalingssnelheid) × 100 Glycolyse (Maximale snelheidsmeting vóór oligomycine-injectie) – (Laatste snelheidsmeting vóór glucose-injectie) Glycolytische capaciteit (Maximale snelheidsmeting na oligomycine-injectie) – (Laatste snelheidsmeting vóór glucose-injectie) Glycolytische reserve (Glycolytische capaciteit) – (Glycolyse) Glycolytische reserve in % (Glycolytische capaciteitssnelheid) /(Glycolyse) × 100 Niet-glycolytische verzuring Laatste snelheidsmeting voorafgaand aan glucose-injectie Tabel 3: Lijst van definities van de belangrijkste componenten van de test.

Discussion

Dit geoptimaliseerde protocol voor hoge-resolutie respirometrie van H-RPE omvat het gebruik van BAM15 als ontkoppelaar in plaats van de veelgebruikte FCCP. Terwijl eerdere studies over hoge-resolutie respirometrie van RPE FCCP 9,24 gebruikten, lijkt BAM15 een robuustere inductie van maximale ademhalingsniveaus in H-RPE te induceren in vergelijking met FCCP. Hoewel zowel FCCP als BAM15 veilig zijn om in cellen te gebruiken, wordt gemeld dat BAM15 minder bijwerkingen heeft in normale cellen in vergelijking met FCCP of carbonylcyanide-3-chloorfenylhydrazon (CCCP)25. Kenwood et al. toonden aan dat BAM15 mitochondriën depolariseert zonder het plasmamembraanpotentiaal te beïnvloeden, waardoor een aanhoudende maximale mitochondriale ademhalingssnelheid wordt geïnduceerd bij lage cytotoxiciteit26. FCCP, aan de andere kant, depolariseert zowel mitochondriën als het plasmamembraan en vertoont een hogere cytotoxiciteit26.

Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, waaronder ervoor zorgen dat de cellen op de juiste manier zijn geplateerd in een confluente, gelijkmatige en homogene monolaag van RPE in alle experimentele putten van de microplaat. Volwassen RPE zijn sterk afhankelijk van OXPHOS voor energieopwekking, en daarom moeten de cellen ten minste 1 maand kunnen rijpen om ervoor te zorgen dat de RPE tijdens de test de juiste basale en maximale OCR-metingen genereert. Het ontgassen van de celkweekplaat gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde oven (zonder CO 2) voordat deze in het instrument wordt geplaatst, is cruciaal voor nauwkeurige ECAR-metingen, omdat CO2 de pH van de testmedia kan beïnvloeden. Het is belangrijk om te onthouden om de sensorcartridge de dag voor de test te hydrateren om ervoor te zorgen dat deze betrouwbare OCR- en ECAR-metingen levert op de dag van de test. Er moet voor worden gezorgd dat de te injecteren geneesmiddelen op de juiste wijze worden gereconstitueerd en dat de gereconstitueerde geneesmiddelenvoorraden in kleinere volumes worden opgenomen voor langdurige opslag om vries- / dooicycli te minimaliseren. Het is van cruciaal belang om 10x geneesmiddeloplossingen te bereiden die worden verdund in de respectieve testmedia (bijv. Verdunnen in Mito-stresstesttestmedia voor de Mito-stresstest) om rekening te houden met de verdunning van injectie van het geneesmiddel in elke put gevuld met testmedia. Bij elke volgende medicijninjectie is er meer media in elke put, en dus nemen de volumes van het geneesmiddel dat wordt geladen toe met elke injectie, en er moet voor worden gezorgd dat de volumes worden gevolgd die in het protocol zijn gespecificeerd. Het is belangrijk om kwaliteitscontroles uit te voeren na voltooiing van het experiment door de sensorcartridge te onderzoeken om er zeker van te zijn dat er geen restgeneesmiddel zichtbaar is en de celkweekplaat onder een microscoop te observeren om ervoor te zorgen dat de confluente en homogene celmonolaag blijft.

Wijzigingen in dit protocol omvatten het injecteren van verschillende medicijnen in de havens en het bepalen hoe deze medicijnen de OCR- en ECAR-metingen beïnvloeden. Een populaire modificatie is om een experimenteel medicijn naar keuze als Port A te injecteren voordat de gebruikelijke Mito- of Glycolytische stresstestgeneesmiddelen worden geïnjecteerd. Dit type protocol geeft inzicht in hoe een acute injectie van het medicijn van keuze de daaropvolgende OXPHOS- en glycolytische parameters beïnvloedt. Andere modificaties omvatten het onderzoeken van verschillende celtypen; dit vereist initiële probleemoplossing van de optimale zaaiceldichtheid en optimalisatie van de testmedia door ervoor te zorgen dat basale metingen variëren van 50-100 pmol / min voor OCR en 10-20 mpH / min voor ECAR. De optimale concentraties van de geïnjecteerde geneesmiddelen moeten voor elk nieuw celtype worden bepaald door de OCR- en ECAR-reacties op een seriële verdunning van de geneesmiddelen te observeren.

Een belangrijke beperking van het protocol is dat de levensvatbaarheid van cellen in de loop van de tijd afneemt, omdat de cellen zich niet in een CO 2-incubator in hun normale groeimedia bevinden, en dus moet de test binnen 3-4 uur worden voltooid om maximale levensvatbaarheid van de cel te garanderen. Bovendien kan blootstelling aan mitochondriale toxines die in elke put worden geïnjecteerd, de levensvatbaarheid van cellen in de loop van de tijd verder verminderen. Zodra de test is voltooid, moeten de cellen worden gelyseerd voor evaluatie van het eiwitgehalte om OCR- en ECAR-metingen te normaliseren, en dus kunnen dezelfde cellen niet worden geoogst voor latere moleculaire biologietests.

Alternatieven voor het zeepaardje voor bio-energetische profilering zijn de Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 en Resipher (Lucid Scientific)7. De Oroboros O2k is een gesloten tweekamerrespirometer die gebruik maakt van S1 Clark-type polarografische zuurstofelektroden. Terwijl de Oroboros O2k zeer gevoelige metingen van real-time metabole flux produceert, is het apparaat arbeidsintensief omdat de operator elk medicijn handmatig moet injecteren30. De BaroFuse is een nieuw meerkanaals microfluïdisch perfusiesysteem dat gasdruk gebruikt om meerdere parallelle perfusie-experimenten mogelijk te maken en is gekoppeld aan een zuurstofdetectiesysteem om OCR te meten. Het voordeel van dit stromingskweeksysteem is dat de weefselfunctie en levensvatbaarheid behouden blijven, in tegenstelling tot het zeepaardje waar de levensvatbaarheid van cellen afneemt gedurende langere testen. De Resipher maakt gebruik van zeer gevoelige optische zuurstofsensoren om OCR te meten terwijl de cellen zich in een 96-well plaat in de incubator bevinden, waardoor continue OCR-metingen gedurende enkele weken tot maanden mogelijk zijn. Met name meten deze instrumenten geen ECAR, en dus heeft het zeepaardje het voordeel van gelijktijdige exploratie van zowel OXPHOS als glycolyse.

Het ondervragen van real-time bio-energetische profielen van OXPHOS en glycolyse komt naar voren als een belangrijke factor bij het karakteriseren van de gezondheid en functie van RPE. Respirometrie met hoge resolutie maakt een efficiënte manier mogelijk om de metabole status van normale en zieke RPE te vergelijken, waardoor nieuwe wegen worden geopend voor het screenen van de werkzaamheid van geneesmiddelen voor netvliesaandoeningen zoals AMD en PVR. Toekomstige richtingen voor hoge-resolutie respirometrie op RPE omvatten het optimaliseren van een protocol om bio-energetische profielen te onderzoeken voor sterk gepolariseerde RPE-monolagen gekweekt op transwell-filters. Calton et al. (2016) hebben dit met succes bereikt door een driehoekig gedeelte van de gepolariseerde RPE-monolaag te snijden die op transwell-filters is gekweekt31. Verdere uitbreiding van de methodologie omvat het onderzoeken van de bio-energetische profielen van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide RPE (iPSC-RPE), geïsoleerd van patiënten met verschillende retinale degeneratieve aandoeningen32. Onderzoek naar hoe pathogene cytokines die betrokken zijn bij AMD en PVR de dynamische aard van het RPE-metabolisme beïnvloeden, kan metabole kwetsbaarheden onthullen die de identificatie van nieuwe druggable targets kunnen informeren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van: de Fight for Sight Leonard &; Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); BrightFocus Foundation Postdoctoraal Fellowship-programma in maculadegeneratie-onderzoek (M2021010F, D.Y.S.); Department of Defense, Spinal Vision Research Program onder Award nr. VR180132 (M.S.-G. en L.A.K.); National Eye Institute van de National Institutes of Health onder Award no. R01EY027739 (L.A.K.). Dankbetuiging aan de donateurs van het Macular Degeneration Research M2021010F, een programma van de BrightFocus Foundation, ter ondersteuning van dit onderzoek. Schema’s zijn gemaakt met Biorender.com

Materials

2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S  Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
  2. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
  3. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
  4. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  5. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  6. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
  7. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
  8. Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
  9. Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
  10. Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
  11. Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
  12. Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
  13. Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
  14. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
  17. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
  18. Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
  19. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
  20. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  21. Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
  22. Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
  23. Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
  24. Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
  25. Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
  26. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  27. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  28. Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
  29. Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
  30. Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
  31. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
  32. Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).

Tags

Real-time BioenergeticsPrimary Human Retinal Pigment Epithelial CellsHigh-resolution RespirometryOxphosGlycolysisAMDCell CultureRespirometry InstrumentMito Stress Test Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fitch, T. C., Frank, S. I., Li, Y. K., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (192), e64572, doi:10.3791/64572 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image