高分解能肺活量測定法を用いた初代ヒト網膜色素上皮細胞における生体エネルギーのリアルタイム解析

1. 細胞培養プレートへのH-RPEのめっき RPE増殖培地サプリメント(4 mM L-グルタミン、25 ng/mL FGF-2、2% FBS、30 mg/mLゲンタマイシン、および15 μg/mLアムホテリシン)を添加したヒトRPE培地のT25フラスコでH-RPEを解凍します。 加湿インキュベーター内で細胞を37°Cおよび5%CO2 でインキュベートする。翌日培地をリフレッシュし、細胞が少なくとも80%のコンフルエントに達するのを待ってから、T75フラスコに1:3の比率で継代します。 コンフルエントになったら、トリプシン/EDTA 0.025%溶液、トリプシン中和溶液、およびHEPES緩衝生理食塩水(pH 7.0-7.6)からなる継代試薬キットを使用して細胞を継代します。H-RPEを3 mLのHEPES緩衝生理食塩水でやさしくすすいでください。次に、3 mLのトリプシン/ EDTAを加え、5分間(または顕微鏡で観察するように、細胞がフラスコのベースから浮き上がるまで)インキュベートします(37°Cおよび5%CO2)。3 mLのトリプシン中和溶液でトリプシン/EDTAを中和します。 細胞を200 x g で3.5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。上清を注意深く吸引して廃棄します。 細胞をヒトRPE培地に再懸濁し、ウェルあたり100 μLあたり20,000細胞の最終濃度にします。細胞懸濁液が均一であることを確認するために複数回ピペットアップおよびダウンし、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェル細胞培養マイクロプレートへのピペッティングの容易さと一貫性を実現します。ピペットチップをウェル上部の円形リムのすぐ下に置いて、均一で均質な細胞層を作ります。注:細胞はマイクロプレートによく接着するため、コーティングは必要ありません。 バックグラウンド補正ウェルとして機能するために、4つのコーナーウェルに細胞(100 μLの培地のみ)を空のままにしてください(図1A)。注:マイクロプレートは、典型的な96ウェルプレート設計でフォーマットされています。ただし、各ウェルの表面積は0.106 cm2であり、標準の96ウェルプレートよりも40%小さくなっています。この細胞密度では、細胞は翌日100%コンフルエントになるはずです。治療をテストする前に、まず細胞密度最適化実験を実行して、基礎OCRとECARの読み取り値がそれぞれ約50〜100 pmol/分と10〜20 mpH/分であることを確認することをお勧めします。 細胞培養プレートを室温(RT)で1時間放置してから、インキュベーター(5%CO2、37°C、加湿)に戻して、エッジの影響を最小限に抑えます。エッジ効果は、蒸発による96ウェルプレートの周辺境界のウェル内の培地体積の変化である14。注:細胞は一晩接着し、翌日コンフルエントな単層を形成します。H-RPEは、2〜3日ごとに増殖培地の半分をリフレッシュすることにより、プレート内で少なくとも1ヶ月間成熟させる。 培地を交換する前に顕微鏡で細胞を調べて、細胞の形態と色素沈着レベルを確認します。細胞が特徴的な石畳のような形態とコンフルエントであり、Shuらの形態画像に見られるように、時間の経過とともに色素沈着を獲得することを確認します7。 2. アッセイ実施前日 アッセイの前日に、ユーティリティプレートの各ウェルに200 μLの脱イオン水を満たして、センサーカートリッジが水和されていることを確認します。注:ユーティリティプレートの蓋には、各ウェルの酸素およびpHレベルを測定するための蛍光バイオセンサーが含まれています。センサーは、さまざまな励起波長で光を照射し、光学フィルターを介して蛍光信号を光検出器に送信する光ファイバー導波路に結合されています。 水に浸したセンサーカートリッジを、~20 mLのキャリブラント(翌日使用するためにウォームアップするため)とともに、37°Cの加湿オーブン(CO2なし)に一晩入れます。注意: キャリブラントは、センサーカートリッジのキャリブレーション用に設計された独自のソリューションであり、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)と組成が似ている可能性があります。カートリッジの水分補給の最小時間は4時間ですが、一晩の水分補給で最良の結果が得られます。 機器の電源がオンになっていることを確認し、ソフトウェアを起動して、機器が一晩37°Cに安定するようにします(図2)。一般的に、機器は使用しないときでもオンのままにしておくことができます。 3. 細胞外フラックス分析装置を用いたリアルタイム水戸ストレステスト アッセイ当日、アッセイを実行する少なくとも45分前に、ユーティリティプレート内の水を等量の温めたキャリブラントと交換します。 表1に示すようにサプリメントを添加してフェノールレッドを含まないベース培地を用いて水戸ストレステストアッセイ培地を作製した。メディアを37°Cに温め、pHを7.4に調整し、チューブトップフィルターユニットを使用してメディアを真空ろ過します。フルプレートを実行するには、~25 mLのアッセイ培地を作ります。 ヒトRPE培地を取り出し、新たに調製したアッセイ培地180 μLと交換します(ステップ3.2)。アッセイを開始する前に、細胞培養プレートを加湿した37°Cのオーブン(CO2なし)に1時間入れます。注:これは、セルプレートを脱ガスするために重要であり、CO2 拡散を可能にします。細胞はもはやそれらの増殖培地中になく、もはやCO2を含むインキュベーター中に存在しないので、それらの生存率は時間とともに低下するので、アッセイをできるだけ効率的に実施するように注意すべきである。また、細胞培養プレートに気泡がないように注意する必要があります。ある場合は、ピペットまたは針でポップします。 各センサーカートリッジには、アッセイ中に細胞培養プレートのウェルに試験化合物を注入するためのウェルごとに4つの試薬送達ポートがあります(図1C、D)。 表2に従って、それぞれのアッセイ培地で薬剤ストックを希釈することにより、~3mLの10x薬物溶液を調製します。例えば、Mito Stress Testアッセイ培地に溶解した25 μMのオリゴマイシンをポートAにロードし、薬剤量が機器によってウェルに注入されたときに、各細胞がさらされる最終濃度が2.5 μMになるようにします。 10倍の医薬品原料20 μLをポートAにピペット、 ポートBに22 μL、 ポートCに25 μLを挿入し、各ウェルで指定された最終薬物濃度を達成します。4つの薬剤ポートすべてを必要とするプロトコルの場合は、28 μLをポートDにピペットで入れます。注:ポートA/B/C/Dの正しい向きについては、薬物を薬剤ポートにピペッティングする場合は 、図1B を参照してください。カートリッジの端にあるノッチは、ドラッグポートをロードするときに左下隅に配置する必要があります。各薬剤ポートに斜めにピペッティングすることで、気泡を最小限に抑えることができます。気泡がある場合は、ピペットまたは針でそれらをポップするように注意する必要があります。 分析ソフトの 「テンプレート 」タブを開き、「 水戸ストレステスト」を選択して、 グループ定義を入力します。注射戦略の詳細を入力します(この場合、水戸ストレステスト薬として事前に入力されています)。アッセイ内のさまざまな実験グループに関する詳細を入力します(例:コントロールまたは治療)。アッセイ培地に詳細を入力し(ベースアッセイ培地へのさまざまなサプリメントとその特定の濃度の追加)、最後に細胞タイプを追加します。 次のタブ「プレートマップ」をクリックすると、検査対象のさまざまなグループが96ウェルプレートマップ上の特定の場所に割り当てられます。これが完了したら、[プロトコル]タブをクリックして、デフォルトのMitoストレステストプロトコルの機器プロトコルを確認します。注:デフォルトの Mitoストレステスト テンプレートはすぐに使用できますが、実験デザインに合わせて任意の方法で変更できます。たとえば、デフォルトの測定時間は3分ですが、必要に応じて5分に変更できます。 アッセイの実行をクリックし、キャリブラント溶液に沈められたセンサーカートリッジをユーティリティプレートに挿入します。このプロセスには約25分かかります。このステップでは、各バイオセンサは、既知のpHおよび酸素濃度のキャリブラント溶液中で測定されたセンサ出力に基づいて独立して較正される。これが校正されたら、ユーティリティプレートを取り外し、細胞培養プレートを挿入します。注:細胞培養プレートは最初に平衡化され、その後、装置はアッセイ培地の混合を開始し、OCRおよびECAR値を測定します。このステップには約1.5時間かかり、ユーザーの介入なしに機器内で実行されます。OCRとECARのベースライン読み取り値は、最初にアッセイ媒体を3分間混合し、次にOCRとECARを3分間測定することによって確立されます。この装置は、ミキシングと測定の3つのループを実行します。 ベースライン測定後、機器は自動的にポートA薬液を各ウェルに注入します。これに続いて、混合と測定の3つのループが続きます(それぞれ3分)。同じパターンは、その後の各薬物注射(ポートBおよびC)の後に発生します。 実行が完了したら、細胞培養プレートとセンサーカートリッジを取り外します。品質管理の目的で、センサーカートリッジ内のすべての薬物ポートが注入されていることを確認し、ポートを調べて残留薬物が残っていないことを確認します。センサーカートリッジとユーティリティプレートは使い捨てのアイテムであるため、廃棄してください。 顕微鏡下で細胞培養マイクロプレート内の細胞を調べて、細胞のコンフルエントな単層がまだあることを確認します。アッセイ培地を廃棄し、各ウェルに60 μLの1x溶解バッファーを入れ替えます。注:溶解バッファーは、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を添加した脱イオン水中で1xに希釈した10x溶解バッファーから作られています。 プレートの端をパラフィルムで包み、蒸発を防ぎ、-80°Cの冷凍庫に入れて一晩細胞溶解を助けてから、BCAアッセイを使用してタンパク質含有量を定量します。 データ解析では、OCR値とECAR値を各ウェルのタンパク質のマイクログラムで割って、すべてのデータを正規化します。データ分析ソフトウェアを使用してMitoストレステストパラメータを自動的に計算するExcelマクロを利用するMitoストレステストレポートジェネレーターをエクスポートします。注:これは、基礎呼吸、最大呼吸、予備呼吸容量、陽子漏れ、ATP産生、および非ミトコンドリア呼吸を決定するために使用できます。これらの計算の定義を 表 3 に示します。 4. 細胞外フラックス分析装置を用いたリアルタイム解糖系ストレス試験 表 1 および 表2に示す異なるアッセイ培地サプリメントおよび薬物注射を使用すること以外は、水戸ストレス試験と同じ手順に従って解糖系ストレス試験を実施する。 データ分析のために、Excelマクロを利用してデータ分析ソフトウェアから解糖系ストレステストパラメータを自動的に計算する解糖系ストレステストレポートジェネレーターをエクスポートします。注:これは、非解糖系酸性化、解糖系、解糖能力、および解糖系予備能を決定するために使用できます。これらの計算の定義を 表 3 に示します。 5. BCAタンパク質定量アッセイ 注:ビシンチョン酸(BCA)タンパク質定量アッセイ(スミスアッセイ15とも呼ばれます)は、サンプル中の総タンパク質含有量を決定するために使用される銅ベースの比色アッセイです。OCRおよびECARデータを各ウェルのタンパク質のマイクログラムに正規化することで、各ウェル内の異なる量の細胞/タンパク質が測定値を歪めないようにします。BCAアッセイのメカニズムは、2つの化学反応に基づいています。まず、タンパク質中のペプチド結合は、第二銅イオン(Cu2+)を第一銅イオン(Cu +)に還元しますが、これは高温(37〜60°C)によって支援される温度依存反応です。より多くのペプチド結合がある場合は、Cu2+の量を溶液16中のタンパク質含量に比例させる。この反応により、緑色から強烈な紫色の溶液に色が変化し、562nmにピーク吸光度がもたらされます16。サンプル中のタンパク質含有量が高いほど、この波長での吸光度は高くなります。このキットの動作範囲は20〜2,000μg/mLです。 BCAアッセイキットには、タンパク質濃度の標準物質であるウシ血清アルブミン(BSA)を2 mg/mLで1 mLアリコートで含有しています。希釈していない2 mg/mL BSAから始めて、透明な平底96ウェルプレートで段階希釈液を調製し、その後、脱イオン水(2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mLなど)で希釈して濃度を半分にします。既知の濃度のタンパク質を使用すると、実験サンプルのタンパク質含有量を計算するために使用される標準曲線の計算が可能になります。計算されたタンパク質含有量測定の精度を向上させるには、各アッセイの実験サンプルと一緒にタンパク質濃度参照標準の吸光度測定値を測定します。 各BSA段階希釈液25 μLを96ウェルプレートに25 μLずつピペットで入れます。 25 μLの1x溶解バッファーを96ウェルプレートに複製してピペットし、ブランクとして使用します。 細胞培養プレートを室温まで解凍し、各細胞ライセート25 μLを96ウェルプレートに25 μLずつピペットで入れます。 BCAキット試薬A:Bの50:1の比率で作業試薬を調製し、ボルテックスによって完全に混合して作業試薬の濁りを取り除き、均質な緑色の溶液にします。200 μLの作業試薬を各ウェルに加えます。 プレートをホイルで覆ってプレートを光から保護し、37°Cのオーブンで20分間インキュベートします。 96ウェルプレートリーダーで562 nmの吸光度を測定します。 データ分析では、重複するすべての値を平均します。すべてのサンプルの測定から1x溶解バッファーウェルから決定されたブランク吸光度レベルを差し引きます。各BSA標準物質の吸光度を既知の濃度(μg/mL)にプロットすることにより、検量線を決定します。検量線から導出された一次方程式を使用して、実験サンプルのタンパク質濃度を決定します。