JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

تحليل في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية في الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية الأولية باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64572
, , , , ,
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology,Harvard Medical School

Summary

تعكس الحالة الأيضية للخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين البشرية (H-RPE) صحتها ووظيفتها. يظهر هنا بروتوكول محسن لفحص التدفق الأيضي في الوقت الفعلي ل H-RPE باستخدام قياس التنفس عالي الدقة.

Abstract

يعد الخلل الأيضي للخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) محركا رئيسيا مسببا للأمراض لأمراض الشبكية مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR). نظرا لأن RPE هي خلايا نشطة للغاية في التمثيل الغذائي ، فإن التغيرات في حالتها الأيضية تعكس التغيرات في صحتها ووظيفتها. يسمح قياس التنفس عالي الدقة بالتحليل الحركي في الوقت الفعلي لمساري الطاقة الحيوية الرئيسيين ، تحلل السكر والفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) ، من خلال القياس الكمي لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، على التوالي. فيما يلي بروتوكول محسن لإجراء قياس التنفس عالي الدقة على الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية البشرية الأولية (H-RPE). يقدم هذا البروتوكول وصفا تفصيليا للخطوات التي ينطوي عليها إنتاج ملامح الطاقة الحيوية ل RPE لتحديد قدرات OXPHOS الأساسية والقصوى وقدرات تحلل السكر. يؤدي تعريض H-RPE لحقن الأدوية المختلفة التي تستهدف آلية الميتوكوندريا وتحلل السكر إلى ملامح طاقة حيوية محددة ، والتي يمكن من خلالها حساب المعلمات الأيضية الرئيسية. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الاستجابة المعززة ل BAM15 كعامل فصل مقارنة بسيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) للحث على قدرة التنفس القصوى في RPE. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة حالة الطاقة الحيوية ل RPE في ظل ظروف مرضية مختلفة واختبار فعالية الأدوية الجديدة في استعادة الحالة الأيضية الأساسية ل RPE.

Introduction

توجد الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) كطبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة الموجودة بشكل استراتيجي بين المستقبلات الضوئية والبطانة المحصورة للشعيرات الدموية. RPE نشطة للغاية في التمثيل الغذائي مع العديد من الوظائف ، بما في ذلك (1) البلعمة لأقراص مستقبلات الضوء ، (2) إعادة تدوير الصباغ البصري للحفاظ على الدورة البصرية ، (3) نقل العناصر الغذائية والمستقلبات والأيونات والماء ، (4) امتصاص الضوء ، (5) الحماية ضد الأكسدة الضوئية ، (6) إفراز العوامل الأساسية لدعم سلامة الشبكية ، و (7) تكوين الحاجز الدموي الشبكي الخارجي1 . يرتبط تنكس RPE بالخلل الوظيفي الأيضي وعيوب الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى أمراض العين المسببة للعمى مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR)2.

هناك مساران رئيسيان للطاقة الحيوية هما تحلل السكر ، الذي يحدث في السيتوبلازم ، والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) ، والتي تحدث في الميتوكوندريا. أثناء تحلل الجلوكوز ، يتم تحويل جزيء واحد من الجلوكوز إلى جزيئين من البيروفات وإنتاج صافي لجزيئين من أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). على عكس تحلل السكر ، ينتج OXPHOS مستويات أعلى بكثير من ATP (~ 32-38 جزيئا من ATP لكل جزيء جلوكوز). والجدير بالذكر أن OXPHOS يستهلك الأكسجين ويتطلب حدوث الميتوكوندريا الوظيفية ، في حين يحدث تحلل السكر في السيتوبلازم ولا يتطلب الأكسجين.

قبل إدخال التقنيات القائمة على التألق أو الفسفرة لفحص تنفس الميتوكوندريا ، تم قياس مستويات الأكسجين في معلقات الخلايا النفاذية في غرف مجهزة بقطب أكسجين من نوع كلارك3. في حين أن قطب كلارك أرخص بكثير من قياس التنفس القائم على التألق ويعمل في الخلايا غير الملتصقة ، إلا أنه منخفض الإنتاجية نسبيا ، حيث تستغرق كل عملية تنفسية حوالي 15-20 دقيقة وتتطلب كميات أكبر بكثير من الخلايا لكل عينة3. وهكذا ، حلت تقنية قياس التنفس القائمة على التألق محل قطب كلارك الكهربائي إلى حد كبير وأصبحت تقنية شائعة في مجالات التمثيل الغذائي وأبحاث الميتوكوندريا.

يصف هذا البروتوكول تقنية قياس التنفس عالية الإنتاجية وعالية الدقة والقائمة على التألق والتي تقيس حركيا OXPHOS وملامح الطاقة الحيوية المحللة للسكر للخلايا الحية. نظرا لأن عملية OXPHOS تستهلك الأكسجين ، يتم إنتاج ملف تعريف الطاقة الحيوية ل OXPHOS عن طريق رسم خرائط للتغيرات في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) بمرور الوقت4. في هذه التقنية ، يتم تضمين اثنين من الفلوروفورات في غلاف خرطوشة المستشعر المتصل بحزم الألياف البصرية التي تنبعث منها الضوء ، مما يثير الفلوروفور. يتم قياس التغييرات في انبعاث الفلوروفور بواسطة مستشعرات مضان عالية الحساسية وتنتقل عبر حزمة الألياف البصرية ليتم تحويلها إلى قراءات OCR5. يتم إخماد الفلوروفور بواسطة الأكسجين ، مما يتيح تحديد مستويات الأكسجين خارج الخلية في وسائط الفحص ، والمعروفة باسم تدفق الأكسجين أو OCR. الفلوروفور الآخر هو مسبار مستشعر الأس الهيدروجيني الحساس للتغيرات في تدفق البروتون ، والذي يتم تحويله إلى مقياس لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR). أثناء القياسات ، يتم خفض حزم الألياف الضوئية مع الفلوروفورات المدمجة إلى 200 ميكرومتر فوق الطبقة الأحادية للخلية ، مما يخلق غرفة دقيقة عابرة تتيح قراءات سريعة في الوقت الفعلي. بمجرد اكتشاف تغير بنسبة 10٪ في مستويات الأكسجين أو البروتون ، يتم رفع المستشعرات لأعلى ، مما يسمح لحجم أكبر من الوسائط بالاختلاط مع وسائط الغرفة الدقيقة العابرة ، واستعادة قيم OCR و ECAR مرة أخرى إلى خط الأساس. تم تجهيز كل خرطوشة مستشعر بأربعة منافذ للسماح بالإدارة المتسلسلة لما يصل إلى أربعة مركبات لكل بئر أثناء الفحص. يمكن جمع القياسات قبل وبعد حقن المركبات في كل منفذ ، مما يكشف عن المعلومات الأساسية حول الحالة الأيضية للخلايا.

يمكن أن يؤدي استجواب هذين المسارين الأيضيين المتميزين إلى اكتشافات مهمة فيما يتعلق بالحالة الأيضية ل RPE بعد التعرض لمحفزات مسببة للأمراض مختلفة ، وبالتالي يمكن استخدامها لاختبار فعالية الأدوية في استعادة السلامة الأيضية ل RPE6،7،8. حفز ظهور قياس التنفس عالي الإنتاجية وتوافر مثبطات الميتوكوندريا المحددة المزيد من الأبحاث في تحديد ملامح الطاقة الحيوية ل RPE وتحديد العيوب في التمثيل الغذائي والميتوكوندريا أثناء حالات المرض6،7،8،9،10،11،12،13 . سلط قياس التنفس عالي الدقة الضوء على الدور الرئيسي لإعادة البرمجة الأيضية ل RPE في أمراض الشبكية مثل AMD و PVR. اثنان من السيتوكينات الرئيسية المشاركة في التسبب في AMD و PVR هما تحويل عامل النمو بيتا 2 (TGFβ2) وعامل نخر الورم ألفا (TNFα). يرافق تحريض الانتقال الظهاري الوسيط (EMT) بواسطة TGFβ2 خلل في الميتوكوندريا ، وقمع OXPHOS ، وزيادة تعويضية في قدرة تحلل السكر في RPE6. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن السيتوكين المؤيد للالتهابات ، TNFα ، يحفز تنظيما كبيرا ل OXPHOS القاعدي ويقلل من تحلل السكر في H-RPE7. أدى إعطاء ثنائي ميثيل فومارات إلى تثبيط الالتهاب الناجم عن TNFα بشكل كبير في H-RPE واستعادة مورفولوجيا الميتوكوندريا وملامح الطاقة الحيوية القاعدية7. تحفز الملامح الأيضية المتباينة التي يسببها عاملي النمو هذين أسئلة ميكانيكية مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بمشاركة إعادة برمجة التمثيل الغذائي في أمراض الشبكية. يصف البروتوكول التالي خطوات تقييم OXPHOS وملامح الطاقة الحيوية المحللة للسكر في H-RPE باستخدام قياس التنفس عالي الدقة.

Protocol

1. طلاء H-RPE في لوحة ثقافة الخلية ذوبان H-RPE في دورق T25 في وسط RPE البشري المكمل بمكملات RPE المتوسطة (4 مليمول L-glutamine ، 25 نانوغرام / مل FGF-2 ، 2٪ FBS ، 30 مجم / مل جنتاميسين ، و 15 ميكروغرام / مل أمفوتريسين). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة مرطبة. قم بتحديث الوسائط في اليوم التالي وانتظر حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ على الأقل قبل المرور بنسبة 1: 3 في قارورة T75. بمجرد أن تتلاقى ، قم بمرور الخلايا باستخدام مجموعة كواشف الاستزراع الفرعي التي تتكون من محلول التربسين / EDTA 0.025٪ ، ومحلول تحييد التربسين ، ومحلول ملحي مخزن HEPES (درجة الحموضة 7.0-7.6).اشطف H-RPE برفق باستخدام 3 مل من محلول ملحي HEPES مخزن. ثم أضف 3 مل من التربسين / EDTA واحتضان (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 5 دقائق (أو حتى ترفع الخلايا عن قاعدة القارورة ، كما لوحظ تحت المجهر). تحييد التربسين / EDTA مع 3 مل من محلول معادلة التربسين. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 × غرام لمدة 3.5 دقيقة لتشكيل بيليه الخلية. نضح بعناية وتجاهل طاف . إعادة تعليق الخلايا في وسط RPE البشري إلى تركيز نهائي يبلغ 20000 خلية لكل 100 ميكرولتر لكل بئر.ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للتأكد من أن تعليق الخلية متجانس ، باستخدام ماصة متعددة القنوات لسهولة واتساق السحب في الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا. ضع طرف الماصة أسفل الحافة الدائرية مباشرة في الجزء العلوي من البئر للحصول على طبقة خلية متجانسة ومتساوية.ملاحظة: لا يلزم الطلاء لأن الخلايا تلتصق جيدا بالصفيحة الدقيقة. تأكد من ترك آبار الزوايا الأربعة فارغة من الخلايا (100 ميكرولتر من الوسائط فقط) لتكون بمثابة آبار تصحيح الخلفية (الشكل 1 أ).ملاحظة: تم تنسيق الصفيحة الدقيقة بتصميم نموذجي للوحة 96 بئرا ؛ ومع ذلك ، تبلغ مساحة سطح كل بئر 0.106 سم2 ، وهي أصغر بنسبة 40٪ من لوحة 96 بئرا القياسية. عند كثافة الخلية هذه ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 100٪ في اليوم التالي. يوصى بإجراء تجربة تحسين كثافة الخلايا أولا قبل اختبار العلاجات للتأكد من أن قراءات OCR و ECAR القاعدية تتراوح بين 50-100 pmol / min و 10-20 mpH / min ، على التوالي. اترك لوحة زراعة الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة قبل وضعها مرة أخرى في الحاضنة (5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية ، مرطبة) للمساعدة في تقليل تأثيرات الحافة. تأثيرات الحافة هي تغيرات في حجم الوسائط في آبار الحدود المحيطية للوحة 96 بئرا بسبب التبخر14.ملاحظة: سوف تلتصق الخلايا بين عشية وضحاها وتشكل طبقة أحادية متقاربة في اليوم التالي. يتم نضج H-RPE في اللوحة لمدة شهر واحد على الأقل عن طريق تحديث نصف وسائط النمو كل 2-3 أيام. افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر قبل تغيير الوسائط للتحقق من مورفولوجيتها ومستوى تصبغها. تأكد من أن الخلايا متقاربة مع مورفولوجيا مميزة تشبه الحصى وتكتسب تصبغا بمرور الوقت ، كما هو موضح في الصور المورفولوجية في Shu et al.7. 2. في اليوم السابق لتشغيل الفحص تأكد من ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق للفحص عن طريق ملء كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.ملاحظة: يحتوي غطاء لوحة المرافق على مستشعرات حيوية فلورية لقياس مستويات الأكسجين والأس الهيدروجيني لكل بئر. تقترن المستشعرات بأدلة موجات الألياف الضوئية التي توفر الضوء بأطوال موجية مختلفة للإثارة وتنقل إشارة الفلورسنت من خلال المرشحات الضوئية إلى أجهزة الكشف الضوئي. ضع خرطوشة المستشعر مغمورة في الماء في لوحة المرافق مع ~ 20 مل من المعايرة (للتسخين للاستخدام في اليوم التالي) في فرن مرطب 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) طوال الليل.ملاحظة: المعايرة هي حل خاص مصمم لمعايرة خرطوشة المستشعر ومن المحتمل أن يكون مشابها في تكوينه للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS). الحد الأدنى لوقت ترطيب الخرطوشة هو 4 ساعات ، ولكن يتم الحصول على أفضل النتائج مع الترطيب طوال الليل. تأكد من تشغيل الجهاز وابدأ تشغيل البرنامج للسماح للأداة بالاستقرار إلى 37 درجة مئوية طوال الليل (الشكل 2). بشكل عام ، يمكن ترك الأداة قيد التشغيل حتى عندما لا تكون قيد الاستخدام. 3. اختبار Mito Stress في الوقت الفعلي باستخدام محلل التدفق خارج الخلية في يوم الفحص ، استبدل الماء الموجود في لوحة المرافق بحجم متساو من المعايرة الدافئة قبل 45 دقيقة على الأقل من تشغيل الفحص. اصنع وسائط فحص اختبار Mito Stress باستخدام الوسط الأساسي بدون الفينول الأحمر عن طريق إضافة مكملات ، كما هو موضح في الجدول 1. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، وقم بتصفية الوسائط بالمكنسة الكهربائية باستخدام وحدة مرشح أعلى الأنبوب. لتشغيل لوحة كاملة ، اصنع ~ 25 مل من وسائط الفحص. قم بإزالة وسائط RPE البشرية واستبدلها ب 180 ميكرولتر من وسائط الفحص المعدة حديثا (الخطوة 3.2). ضع طبق زراعة الخلايا في فرن مرطب 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 1 ساعة قبل بدء الفحص.ملاحظة: هذا مهم لإزالة الغازات من لوحة الخلية ، مما يسمح بانتشار CO2 . نظرا لأن الخلايا لم تعد في وسائط نموها ولم تعد في حاضنة تحتوي على CO2 ، فسوف تتدهور صلاحيتها بمرور الوقت ، لذلك يجب توخي الحذر لإجراء الفحص بأكبر قدر ممكن من الكفاءة. يجب أيضا توخي الحذر لضمان عدم وجود فقاعات في لوحة زراعة الخلايا ؛ في حالة وجود أي منها ، قم بفرقعتها باستخدام ماصة أو إبرة. تحتوي كل خرطوشة مستشعر على أربعة منافذ توصيل كاشف لكل بئر لحقن مركبات الاختبار في آبار لوحة زراعة الخلايا أثناء الفحص (الشكل 1C ، D). قم بإعداد ~ 3 مل من محاليل الأدوية 10x عن طريق تخفيف مخزون الأدوية في وسائط الفحص المعنية وفقا للجدول 2. على سبيل المثال ، قم بتحميل المنفذ A ب 25 ميكرومتر من oligomycin المذاب في وسائط فحص اختبار Mito Stress Test ، بحيث عندما يتم حقن حجم الدواء في البئر بواسطة الأداة ، يكون التركيز النهائي الذي تتعرض له كل خلية 2.5 ميكرومتر. ماصة 20 ميكرولتر من مخزون الدواء 10x في المنفذ A ، 22 ميكرولتر في المنفذ B ، و 25 ميكرولتر في المنفذ C ، لتحقيق تركيز الدواء النهائي المحدد في كل بئر. بالنسبة للبروتوكولات التي تتطلب جميع منافذ الأدوية الأربعة ، فإن الماصة 28 ميكرولتر في المنفذ D.ملاحظة: راجع الشكل 1B عند سحب الأدوية في منافذ الدواء من أجل التوجيه الصحيح للمنافذ A / B / C / D. يجب وضع الشق الموجود على حافة الخرطوشة في الزاوية اليسرى السفلية عند تحميل منافذ الدواء. من خلال السحب بزاوية في كل منفذ دواء ، يمكن تقليل الفقاعات. في حالة وجود أي فقاعات ، يجب توخي الحذر لفرقعتها باستخدام ماصة أو إبرة. افتح علامة التبويب القوالب في برنامج التحليل ، وحدد Mito Stress Test ، واملأ تعريفات المجموعة.تفاصيل الإدخال حول استراتيجية الحقن (في هذه الحالة ، يتم إدخالها مسبقا كعقاقير اختبار Mito Stress). تفاصيل الإدخال المتعلقة بالمجموعات التجريبية المختلفة في الفحص (على سبيل المثال ، التحكم أو العلاج). أدخل تفاصيل حول وسائط الفحص (إضافة مكملات مختلفة وتركيزاتها المحددة إلى وسائط الفحص الأساسية) وأخيرا أضف نوع الخلية. انقر فوق علامة التبويب التالية ، خريطة اللوحة ، حيث سيتم تعيين المجموعات المختلفة التي يتم فحصها إلى موقعها المحدد على خريطة اللوحة المكونة من 96 بئرا. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق علامة التبويب البروتوكول لمراجعة بروتوكول الأداة لبروتوكول Mito Stress Test الافتراضي.ملاحظة: قالب Mito Stress Test الافتراضي جاهز للاستخدام ولكن يمكن تعديله بأي طريقة ليناسب التصميم التجريبي. على سبيل المثال ، وقت القياس الافتراضي هو 3 دقائق ، ولكن يمكن تعديله إلى 5 دقائق إذا رغبت في ذلك. انقر فوق تشغيل الفحص وأدخل خرطوشة المستشعر المغمورة في محلول المعايرة في لوحة المرافق. تستغرق هذه العملية حوالي 25 دقيقة. في هذه الخطوة ، تتم معايرة كل مستشعر حيوي بشكل مستقل بناء على خرج المستشعر المقاس في محلول المعايرة بتركيز الأس الهيدروجيني والأكسجين المعروف.بمجرد معايرة ذلك ، قم بإزالة لوحة المرافق وأدخل لوحة زراعة الخلية.ملاحظة: تتم موازنة لوحة زراعة الخلايا أولا ، وبعد ذلك ، تبدأ الأداة في خلط وسائط الفحص وقياس قيم OCR و ECAR. تستغرق هذه الخطوة حوالي 1.5 ساعة ويتم إجراؤها داخل الجهاز دون أي تدخل من المستخدم. يتم إنشاء قراءة أساسية ل OCR و ECAR أولا عن طريق خلط وسائط الفحص لمدة 3 دقائق ثم قياس OCR و ECAR لمدة 3 دقائق. تقوم الأداة بثلاث حلقات من الخلط والقياس. بعد قياس خط الأساس ، تقوم الأداة تلقائيا بحقن محلول الدواء Port A في كل بئر. يتبع ذلك ثلاث حلقات من الخلط والقياس (3 دقائق لكل منها). يحدث نفس النمط بعد كل حقن دواء لاحق (المنفذان B و C). بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة لوحة زراعة الخلايا وخرطوشة المستشعر. لأغراض مراقبة الجودة ، تأكد من حقن جميع منافذ الدواء في خرطوشة المستشعر عن طريق فحص المنافذ للتحقق من عدم وجود دواء متبقي. تخلص من خرطوشة المستشعر ولوحة المرافق لأنهما عناصر تستخدم مرة واحدة. افحص الخلايا الموجودة في الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنه لا يزال هناك طبقة أحادية متقاربة من الخلايا. تخلص من وسائط الفحص واستبدلها ب 60 ميكرولتر من محلول تحلل 1x في كل بئر.ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للتحلل من 10x محلول تحلل مخفف إلى 1x في ماء منزوع الأيونات مع إضافة 1 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF). لف حواف اللوحة في Parafilm لمنع التبخر وضعها في مجمد -80 درجة مئوية للمساعدة في تحلل الخلية طوال الليل ، قبل تحديد كمية محتوى البروتين باستخدام مقايسة BCA. لتحليل البيانات ، قم بتطبيع جميع البيانات بقسمة قيم OCR و ECAR على ميكروغرام البروتين في كل بئر. قم بتصدير منشئ تقرير Mito Stress Test ، الذي يستخدم وحدات ماكرو Excel لحساب معلمات Mito Stress Test تلقائيا باستخدام برنامج تحليل البيانات.ملاحظة: يمكن استخدام هذا لتحديد التنفس القاعدي ، والتنفس الأقصى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية ، وتسرب البروتون ، وإنتاج ATP ، والتنفس غير الميتوكوندريا. وترد تعاريف هذه الحسابات في الجدول 3. 4. اختبار الإجهاد تحلل السكر في الوقت الحقيقي باستخدام محلل التدفق خارج الخلية قم بإجراء اختبار الإجهاد المحلل للسكر باتباع نفس الخطوات مثل اختبار Mito Stress ، باستثناء استخدام مكملات وسائط الفحص المختلفة وحقن الأدوية الموضحة في الجدول 1 والجدول 2. لتحليل البيانات ، قم بتصدير منشئ تقرير اختبار الإجهاد السكري ، والذي يستخدم وحدات ماكرو Excel لحساب معلمات اختبار الإجهاد تحلل السكر تلقائيا من برنامج تحليل البيانات.ملاحظة: يمكن استخدام هذا لتحديد التحمض غير المحلل للسكر ، وتحلل السكر ، والقدرة على تحلل السكر ، واحتياطي تحلل السكر. وترد تعاريف هذه الحسابات في الجدول 3. 5. مقايسة كمية البروتين BCA ملاحظة: مقايسة القياس الكمي للبروتين بحمض البيسينتشونيك (BCA) (المعروف أيضا باسم مقايسة سميث15) هي مقايسة لونية قائمة على النحاس تستخدم لتحديد إجمالي محتوى البروتين في العينة. يضمن تطبيع بيانات OCR و ECAR إلى ميكروغرام البروتين في كل بئر أن الكميات المختلفة من الخلايا / البروتين في كل بئر لا تشوه القراءات. تعتمد آلية فحص BCA على تفاعلين كيميائيين. أولا ، تقلل الروابط الببتيدية في البروتينات الأيونات النحاسية (Cu2+) إلى أيونات النحاس (Cu +) ، وهو تفاعل يعتمد على درجة الحرارة بمساعدة درجات حرارة أعلى (37 إلى 60 درجة مئوية). إذا كان هناك المزيد من الروابط الببتيدية ، مما يجعل كمية النحاس2+ تتناسب مع محتوى البروتين في المحلول16. ينتج عن هذا التفاعل تغير اللون من الأخضر إلى محلول أرجواني مكثف ، مع ذروة امتصاص عند 562 نانومتر16. كلما زاد محتوى البروتين في العينة، زاد الامتصاص عند هذا الطول الموجي. نطاق عمل هذه المجموعة هو 20-2000 ميكروغرام / مل. تحتوي مجموعة مقايسة BCA على 1 مل من قسمة مصل الدم البقري (BSA) عند 2 مجم / مل ، والتي تعمل كمعيار مرجعي لتركيز البروتين. قم بإعداد تخفيف تسلسلي في صفيحة 96 بئرا شفافة مسطحة القاع عن طريق البدء من 2 مجم / مل BSA غير مخفف ثم خفض التركيز إلى النصف عن طريق التخفيف في الماء منزوع الأيونات (على سبيل المثال ، 2 ، 1 ، 0.5 ، 0.25 ، 0.125 مجم / مل ، إلخ). يسمح استخدام تركيز معروف من البروتين بحساب منحنى قياسي ، والذي يستخدم لحساب محتوى البروتين في العينات التجريبية. لتحسين دقة قياسات محتوى البروتين المحسوبة ، قم بقياس قراءات الامتصاص للمعايير المرجعية لتركيز البروتين جنبا إلى جنب مع العينات التجريبية لكل فحص. ماصة 25 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي BSA في نسختين في لوحة 96 بئر. ماصة 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1x في نسختين في لوحة 96 بئرا لتكون بمثابة فارغة. قم بإذابة لوحة زراعة الخلايا إلى درجة حرارة الغرفة وماصة 25 ميكرولتر من كل خلية محللة في نسختين في لوحة 96 بئرا. قم بإعداد كاشف العمل بنسبة 50: 1 من كواشف مجموعة BCA A: B. اخلطها جيدا عن طريق الدوامة لإزالة أي تعكر في كاشف العمل ، بحيث يكون محلولا أخضر متجانسا. أضف 200 ميكرولتر من كاشف العمل إلى كل بئر. احمي الطبق من الضوء عن طريق تغطية الطبق بورق القصدير واحتضانه في فرن 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر في قارئ لوحة 96 بئرا. لتحليل البيانات ، متوسط جميع القيم المكررة. اطرح مستويات الامتصاص الفارغة المحددة من الآبار العازلة للتحلل 1x من قياسات جميع العينات. حدد المنحنى القياسي عن طريق رسم امتصاص كل معيار من معايير BSA إلى تركيزه المعروف في ميكروغرام / مل. استخدم المعادلة الخطية المشتقة من المنحنى القياسي لتحديد تركيز البروتين في العينات التجريبية.

Representative Results

تقيس الأداة في وقت واحد كلا من OCR و ECAR لكل تشغيل. بالنسبة لاختبار إجهاد ميتو ، تستند حسابات المعلمات إلى قراءات التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 3 أ) ، بينما بالنسبة لاختبار الإجهاد المحللة للسكر ، تستند حسابات المعلمات إلى قراءات ECAR (الشكل 3 ب). يوضح الشكل 3 الرسوم البيانية التمثيلية لمنحنى Mito Stress Test OCR بمرور الوقت (الشكل 3C) وحسابات المعلمات في شكل رسوم بيانية شريطية ل H-RPE (الشكل 3D). يتم تمثيل اختبار الإجهاد تحلل السكر كمنحنى ECAR بمرور الوقت (الشكل 3E) ، ويتم عرض حسابات المعلمات في الرسوم البيانية الشريطية ل H-RPE (الشكل 3F). يوفر التنفس القاعدي فهما للمتطلبات الحيوية للخلايا في ظل الظروف القاعدية17. حقن الدواء الأول ، oligomycin (Oligo) ، هو مثبط ATP synthase ، وبالتالي ، فإن أي انخفاض في OCR بعد حقن الدواء الأول هو مقياس للتنفس المرتبط ب ATP18. يعتبر أي تنفس قاعدي متبقي بعد حقن الدواء اللاحقة تسربا للبروتون لأنه لا يقترن بتخليق ATP. قد تشير زيادة تسرب البروتون إلى زيادة فصل الميتوكوندريا ، والذي يتم تنظيمه عن طريق فصل البروتينات الموجودة من الناحية الفسيولوجية ولكن تم ربطها أيضا بأمراض مثل السمنة والسرطان والسكري من النوع 2 وأمراض القلب والأوعية الدموية19. الحقن الثاني هو عامل فصل ، مثل BAM15 أو FCCP ، لتحديد أقصى جهد تنفس للميتوكوندريا. تعمل عوامل الفصل على انهيار تدرج البروتون وتقليل القوة الدافعة للبروتون عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. والنتيجة هي تدفق غير مقيد للإلكترونات عبر سلسلة نقل الإلكترونات (ETC) ، مما يرفع معدل استهلاك الأكسجين ويتسبب في وصول تنفس الميتوكوندريا إلى سعته القصوى20. القدرة التنفسية الاحتياطية (SRC) هي الفرق بين التنفس الأقصى والتنفس القاعدي ، مما يشير إلى قدرة الخلايا على الاستجابة للتغيرات في متطلبات الطاقة عند تحديها ، مما يشير إلى لياقة الخلية. الأهم من ذلك ، بالنسبة لاختبار Mito Stress في H-RPE ، يتفوق BAM15 على FCCP في تعزيز قدرة التنفس الميتوكوندريا (الشكل 4A ، B) ، حيث أن التنفس الأقصى والقدرة التنفسية الاحتياطية أعلى بكثير مع 10 ميكرومتر BAM15 مقارنة ب 500 نانومتر أو 1 ميكرومتر FCCP. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين أي من جرعتي FCCP. الحقن الثالث والأخير من الروتينون ومضاد الميسين A (Rot / AA) يثبط مجمعات الميتوكوندريا I و III ، على التوالي ، من ETC ، الذي يغلق التنفس الميتوكوندريا. أي OCR المتبقية يرجع إلى مصادر غير الميتوكوندريا21. أثناء تحلل السكر ، يتم تحويل جزيء واحد من الجلوكوز إلى جزيئين من اللاكتات في غياب الأكسجين. ويرافق قذف اللاكتات من الخلية تدفق بروتون واحد لكل جزيء اللاكتات ، مما تسبب في تحمض الفضاء خارج الخلية. يتم قياس تدفق إنتاج البروتون في الوسائط من خلال التغيرات في ECAR. يتم تحديد مستويات تحلل السكر القاعدي أولا ، وبعد ذلك يتم حقن الجلوكوز في وسائط الفحص ، والتي تخلو من الجلوكوز ، للحث على تحلل السكر وبالتالي تعزيز مستويات ECAR22. يتم حقن Oligomycin للحث على “أعلى” ECAR لأنه يوقف إنتاج ATP الميتوكوندريا ، مما يجبر الخلية على اشتقاق ATP من خلال تحلل السكر. أخيرا ، يتم إيقاف تحلل السكر بإضافة 2DG ، الذي يثبط الهيكسوكيناز ، وهو أول إنزيم لتحلل السكر23. من المحتمل أن يكون أي ECAR متبق بسبب مصادر أخرى للتحمض ، مثل إنتاج CO2 بواسطة دورة TCA خلال OXPHOS ، ويشار إليه على أنه ECAR غير محلل للسكري. يتم حساب احتياطي تحلل السكر على أنه الفرق بين ECAR “الأعلى” و ECAR في وجود الجلوكوز. قدرة تحلل السكر هي مجموع تحلل السكر واحتياطي تحلل السكر. الشكل 1: مكونات اللوحة وخرطوشة المستشعر . (أ) يتم عرض الجهاز وبرنامج تحليل البيانات وواجهة إعداد البروتوكول. في تخطيط لوحة الاستزراع المكونة من 96 بئرا ، يتم طلاء الخلايا في الآبار ذات اللون الأزرق ويتم تمييز الآبار ذات الزوايا الأربع باللون الأسود ، لأنها تعمل كآبار تصحيح خلفية تحتوي على وسائط فقط (ولا تحتوي على خلايا). (ب) توجد أربعة منافذ أدوية لكل بئر من خرطوشة المستشعر حيث يمكن تحميل الأدوية A و B و C و D. يتم سرد الأحجام إلى ماصة في كل منفذ بناء على حسابات الاستعدادات 10x مخزون المخدرات. (ج) تتكون خرطوشة المستشعر من مجسات مستشعر توضع مباشرة في لوحة المرافق المملوءة بالمعايرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الجدول الزمني للفحص. يتم زرع الخلايا في لوحة زراعة الخلايا. بمجرد أن تصبح جاهزا ، يتضمن الفحص إجراء لمدة 2 يوما متبوعا بالقياس الكمي لمحتوى البروتين باستخدام مقايسة BCA وتحليل البيانات اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: التمثيلات البيانية التمثيلية لاختبار الإجهاد التاجي واختبار الإجهاد المحلل . يتم تصوير حسابات (أ) اختبار إجهاد ميتو و (ب) معلمات اختبار الإجهاد تحلل السكر في التخطيط. (C) يتم عرض منحنى استهلاك الأكسجين التمثيلي (OCR) و (D) معلمات اختبار إجهاد ميتو ل H-RPE. (ه) يتم عرض منحنى معدل التحمض خارج الخلية التمثيلي (ECAR) و (F) معلمات اختبار الإجهاد التحلل للسكر ل H-RPE. أشرطة الخطأ تعني ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: مقارنة بين BAM15 مقابل FCCP كعامل فصل. اختبار إجهاد ميتو على H-RPE يقارن فعالية تحفيز التنفس الأقصى باستخدام 10 ميكرومتر BAM15 أو 500 نانومتر FCCP أو 1 ميكرومتر FCCP ، مع إظهار منحنى (A) معدل استهلاك الأكسجين (OCR) و (B) معلمات اختبار إجهاد ميتو. أشرطة الخطأ تعني ± SEM. **** p ≤ 0.0001 ؛ NS ، ليست كبيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. اختبر الجلوكوز (مللي مول) جلوتاماكس (مللي مول) بيروفات الصوديوم (mM) هيبس (مللي أم) ميتو اختبار الإجهاد 25 2 1 1 اختبار الإجهاد حال للسكر اي 0.5 اي 1 الجدول 1: تركيز المكملات المضافة إلى وسائط الفحص لاختبارات ميتو والإجهاد المحلل للسكتري.  اختبر المنفذ أ المنفذ ب المنفذ ج ميتو اختبار الإجهاد أوليغوميسين 2.5 ميكرومتر FCCP 500 نانومتر أو BAM15 10 ميكرومتر روتينون 2 ميكرومتر وأنتيمايسين أ 2 ميكرومتر اختبار الإجهاد حال للسكر الجلوكوز 10 مللي متر أوليغوميسين 2 ميكرومتر 2-ديوكسي جلوكوز 50 مللي متر الجدول 2: تركيزات حقن منفذ الدواء لاختبارات ميتو والإجهاد المحلل للسكريا. من المهم ملاحظة أن هذه هي التركيزات النهائية التي تتعرض لها الخلايا بعد حقن الأدوية في كل بئر. يجب تحضير الأدوية أقوى 10 مرات عند تحميل منافذ الدواء. مصطلح تعريف كاليبرانت المعاير هو حل يستخدم لمعايرة خرطوشة المستشعر. صياغته هي الملكية ولها تكوين مماثل ل PBS. خرطوشة الاستشعار تحتوي خرطوشة المستشعر على اثنين من الفلوروفورات المضمنة في غلاف خرطوشة المستشعر المتصلين بحزم الألياف الضوئية التي تنبعث منها الضوء ، مما يثير الفلوروفور. يقيس أحد الفلوروفور تدفق الأكسجين ويقيس الآخر تدفق البروتون. تم تجهيز كل خرطوشة مستشعر أيضا ب 4 منافذ للسماح بالإدارة المتسلسلة لما يصل إلى 4 مركبات لكل بئر أثناء الفحص. لوحة المرافق تستخدم لوحة المرافق (المعروفة أيضا باسم لوحة المعايرة) لمعايرة المستشعرات. يتم وضع محلول Calibrant في لوحة المرافق. ميتو اختبار الإجهاد اختبار Mito Stress هو اسم الفحص الذي يوفر ملف الطاقة الحيوية لتنفس الميتوكوندريا عن طريق رسم التغييرات في التعرف الضوئي على الحروف بمرور الوقت. اختبار الإجهاد حال للسكر اختبار الإجهاد تحلل السكر هو اسم الفحص الذي يوفر ملف تعريف الطاقة الحيوية تحلل السكر عن طريق رسم التغييرات في ECAR بمرور الوقت. معدل استهلاك الأكسجين (OCR) معدل استهلاك الأكسجين هو مقياس لتدفق الأكسجين (pmol / min) ويشير إلى حالة التمثيل الغذائي للميتوكوندريا. معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) معدل التحمض خارج الخلية هو مقياس لتدفق البروتون (mpH / min) ويشير إلى حالة التمثيل الغذائي للسكري. برنامج الموجة يستخدم برنامج Wave لبرمجة الفحص وتحليل البيانات اللاحق استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا الحد الأدنى لقياس المعدل بعد حقن روتينون / أنتيمايسين أ التنفس القاعدي (قياس المعدل الأخير قبل الحقن الأول) – (معدل التنفس غير الميتوكوندريا) التنفس الأقصى (الحد الأقصى لقياس المعدل بعد حقن FCCP) – (التنفس غير الميتوكوندريا) تسرب H+ (بروتون) (الحد الأدنى لقياس المعدل بعد حقن Oligomycin) – (التنفس غير الميتوكوندريا إنتاج ATP (قياس المعدل الأخير قبل حقن أوليغومايسين) – (الحد الأدنى لقياس المعدل بعد حقن أوليغوميسين) سعة تنفسية احتياطية (التنفس الأقصى) – (التنفس القاعدي) القدرة التنفسية الاحتياطية كنسبة مئوية (التنفس الأقصى) / (التنفس القاعدي) × 100 كفاءة اقتران معدل إنتاج ATP) / (معدل التنفس القاعدي) × 100 تحلل (الحد الأقصى لقياس المعدل قبل حقن Oligomycin) – (قياس المعدل الأخير قبل حقن الجلوكوز) قدرة تحلل السكر (الحد الأقصى لقياس المعدل بعد حقن Oligomycin) – (قياس المعدل الأخير قبل حقن الجلوكوز) احتياطي تحلل السكر (قدرة تحلل السكر) – (تحلل السكر) احتياطي حال للسكر كنسبة مئوية (معدل قدرة تحلل السكر) / (تحلل السكر) × 100 تحمض غير تحلل السكر آخر معدل قياس قبل حقن الجلوكوز الجدول 3: قائمة تعاريف المكونات الرئيسية للفحص.

Discussion

يتضمن هذا البروتوكول المحسن لقياس التنفس عالي الدقة ل H-RPE استخدام BAM15 كأداة فك بدلا من FCCP شائعة الاستخدام. في حين أن الدراسات السابقة حول قياس التنفس عالي الدقة ل RPE استخدمت FCCP 9,24 ، يبدو أن BAM15 يحفز تحريضا أكثر قوة لمستويات التنفس القصوى في H-RPE مقارنة ب FCCP. في حين أن كلا من FCCP و BAM15 آمنان للاستخدام في الخلايا ، فقد تم الإبلاغ عن أن BAM15 له آثار جانبية أقل في الخلايا الطبيعية مقارنة ب FCCP أو الكربونيل سيانيد -3-كلوروفينيلهيدرازون (CCCP) 25. أظهر كينوود وآخرون أن BAM15 يزيل استقطاب الميتوكوندريا دون التأثير على إمكانات غشاء البلازما ، مما يؤدي إلى معدل تنفس أقصى مستدام للميتوكوندريا عند سمية خلويةمنخفضة 26. من ناحية أخرى ، يزيل FCCP استقطاب كل من الميتوكوندريا وغشاء البلازما ويعرض سمية خلوية أعلى26.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول ، بما في ذلك ضمان طلاء الخلايا بشكل صحيح في طبقة أحادية متقاربة ومتساوية ومتجانسة من RPE في جميع الآبار التجريبية للصفيحة الدقيقة. تعتمد RPE الناضجة بشكل كبير على OXPHOS لتوليد الطاقة ، وبالتالي يجب السماح للخلايا بالنضوج لمدة 1 شهر على الأقل لضمان أن RPE يولد قراءات OCR أساسية وقصوى مناسبة أثناء الفحص. يعد التخلص من الغازات من لوحة زراعة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في فرن مرطب (بدون ثاني أكسيد الكربون 2) قبل وضعها في الجهاز أمرا بالغ الأهمية لقراءات ECAR الدقيقة ، حيث يمكن أن يؤثر CO2 على الرقم الهيدروجيني لوسائط الفحص. من المهم أن تتذكر ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق للفحص للتأكد من أنها توفر قراءات OCR و ECAR موثوقة في يوم الفحص. وينبغي الحرص على إعادة تكوين العقاقير المراد حقنها على النحو السليم وتحويل مخزونات الأدوية المعاد تشكيلها إلى أحجام أصغر للتخزين الطويل الأجل لتقليل دورات التجميد/الذوبان إلى أدنى حد. من الأهمية بمكان تحضير 10x محاليل دوائية مخففة في وسائط الفحص المعنية (على سبيل المثال ، مخففة في وسائط فحص اختبار Mito Stress لاختبار Mito Stress) لعامل التخفيف من حقن الدواء في كل بئر مملوءة بوسائط الفحص. مع كل حقنة دواء لاحقة ، هناك المزيد من الوسائط في كل بئر ، وبالتالي تزداد أحجام الدواء التي يتم تحميلها مع كل حقنة ، ويجب توخي الحذر لمتابعة الأحجام المحددة في البروتوكول. من المهم إجراء فحوصات الجودة عند الانتهاء من التجربة من خلال فحص خرطوشة المستشعر للتأكد من عدم وجود دواء متبقي واضح ومراقبة لوحة زراعة الخلايا تحت المجهر لضمان بقاء الطبقة الأحادية للخلية المتقاربة والمتجانسة.

تشمل التعديلات على هذا البروتوكول حقن عقاقير مختلفة في الموانئ وتحديد كيفية تأثير هذه الأدوية على قراءات OCR و ECAR. أحد التعديلات الشائعة هو حقن دواء تجريبي من اختيارك مثل Port A قبل حقن أدوية اختبار Mito أو Glycolytic Stress Test المعتادة. يوفر هذا النوع من البروتوكول نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير الحقن الحاد للدواء المفضل على OXPHOS اللاحق ومعلمات تحلل السكر. وتشمل التعديلات الأخرى فحص أنواع مختلفة من الخلايا. يتطلب ذلك استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية لكثافة خلية البذر المثلى وتحسين وسائط الفحص من خلال ضمان أن القراءات القاعدية تتراوح من 50-100 بمول / دقيقة ل OCR و 10-20 ميل في الساعة / دقيقة ل ECAR. يجب تحديد التركيزات المثلى للأدوية المحقونة لكل نوع جديد من الخلايا التي تم فحصها من خلال مراقبة استجابات OCR و ECAR للتخفيف التسلسلي للأدوية.

أحد القيود الرئيسية للبروتوكول هو أن صلاحية الخلية تتضاءل بمرور الوقت ، حيث أن الخلايا ليست في حاضنة CO2 في وسائط نموها الطبيعية ، وبالتالي يجب إكمال الفحص في غضون 3-4 ساعات لضمان أقصى قدر من بقاء الخلية. علاوة على ذلك ، فإن التعرض لسموم الميتوكوندريا المحقونة في كل بئر يمكن أن يقلل من صلاحية الخلية بمرور الوقت. بمجرد اكتمال الفحص ، يجب تحليل الخلايا لتقييم محتوى البروتين لتطبيع قراءات OCR و ECAR ، وبالتالي لا يمكن حصاد نفس الخلايا لفحوصات البيولوجيا الجزيئية اللاحقة.

تشمل بدائل فرس البحر للتوصيف بالطاقة الحيوية Oroboros Oxygraph 2k (O2k) 27 و BaroFuse28،29 و Resipher (Lucid Scientific) 7. Oroboros O2k عبارة عن مقياس تنفس مغلق من غرفتين يستخدم أقطاب الأكسجين البولاروغرافية من نوع S1 Clark. في حين أن Oroboros O2k ينتج قياسات حساسة للغاية للتدفق الأيضي في الوقت الفعلي ، فإن الجهاز كثيف العمالة حيث يطلب من المشغل حقن كل دواء يدويا30. BaroFuse هو نظام جديد متعدد القنوات لنضح الموائع الدقيقة يستخدم ضغط الغاز لتمكين تجارب التروية المتوازية المتعددة ويرتبط بنظام الكشف عن الأكسجين لقياس التعرف الضوئي على الحروف. تتمثل ميزة نظام ثقافة التدفق هذا في الحفاظ على وظيفة الأنسجة وصلاحيتها ، على عكس فرس البحر حيث تتضاءل صلاحية الخلية على مدى مقايسات أطول. يستخدم Resipher مستشعرات أكسجين بصرية حساسة للغاية لقياس التعرف الضوئي على الحروف أثناء وجود الخلايا في لوحة 96 بئرا في الحاضنة ، مما يتيح قياسات OCR المستمرة على مدار عدة أسابيع إلى أشهر. والجدير بالذكر أن هذه الأدوات لا تقيس ECAR ، وبالتالي فإن فرس البحر يتمتع بميزة الاستكشاف المتزامن لكل من OXPHOS وتحلل السكر.

يبرز استجواب ملامح الطاقة الحيوية في الوقت الفعلي ل OXPHOS وتحلل السكر كعامل رئيسي في توصيف صحة RPE ووظيفتها. يتيح قياس التنفس عالي الدقة وسيلة فعالة لمقارنة الحالة الأيضية ل RPE الطبيعي والمريض ، وبالتالي فتح طرق جديدة لفحص فعالية الدواء لأمراض الشبكية مثل AMD و PVR. تشمل الاتجاهات المستقبلية لقياس التنفس عالي الدقة على RPE تحسين بروتوكول لفحص ملامح الطاقة الحيوية لطبقات RPE أحادية الاستقطاب للغاية المزروعة على مرشحات transwell. نجح Calton et al. (2016) في تحقيق ذلك عن طريق قطع مقطع مثلث من الطبقة الأحادية RPE المستقطبة المزروعة على مرشحات transwell31. يشمل التوسع الإضافي في المنهجية فحص ملامح الطاقة الحيوية ل RPE المستحث المشتق من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC-RPE) ، المعزولة من المرضى الذين يعانون من حالات تنكسية مختلفة في شبكيةالعين 32. يمكن أن يكشف استكشاف كيفية تأثير السيتوكينات المسببة للأمراض المشاركة في AMD و PVR على الطبيعة الديناميكية لعملية التمثيل الغذائي RPE عن نقاط الضعف الأيضية التي يمكن أن تفيد في تحديد أهداف جديدة قابلة للدواء.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة جزئيا بمنح من: زمالة Fight for Sight Leonard و Robert Weintraub لما بعد الدكتوراه (D.Y.S.) ؛ برنامج زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة برايت فوكس في أبحاث التنكس البقعي (M2021010F ، D.Y.S.) ؛ وزارة الدفاع ، برنامج أبحاث الرؤية الشوكية بموجب الجائزة رقم VR180132 (MS-G. و L.A.K.) ؛ المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01EY027739 (L.A.K.). يتم تقديم شكر وتقدير للمانحين لأبحاث التنكس البقعي M2021010F ، وهو برنامج تابع لمؤسسة BrightFocus ، لدعم هذا البحث. تم إنشاء المخططات باستخدام Biorender.com

Materials

2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S  Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
  2. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
  3. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
  4. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  5. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  6. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
  7. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
  8. Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
  9. Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
  10. Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
  11. Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
  12. Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
  13. Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
  14. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
  17. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
  18. Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
  19. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
  20. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  21. Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
  22. Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
  23. Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
  24. Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
  25. Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
  26. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  27. Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
  28. Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
  29. Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
  30. Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
  31. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
  32. Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).

Tags

Real-time BioenergeticsPrimary Human Retinal Pigment Epithelial CellsHigh-resolution RespirometryOxphosGlycolysisAMDCell CultureRespirometry InstrumentMito Stress Test Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fitch, T. C., Frank, S. I., Li, Y. K., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (192), e64572, doi:10.3791/64572 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image