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Biology

Analyse en temps réel de la bioénergétique dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines primaires à l’aide de la respirométrie à haute résolution

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64572
, , , , ,
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology,Harvard Medical School

Summary

L’état métabolique des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines (H-RPE) reflète leur santé et leur fonction. Un protocole optimisé pour examiner le flux métabolique en temps réel de H-RPE à l’aide de la respirométrie à haute résolution est présenté ici.

Abstract

Le dysfonctionnement métabolique des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) est un facteur pathogène clé des maladies rétiniennes telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la vitréorétinopathie proliférative (RVP). Étant donné que les EPR sont des cellules hautement métaboliquement actives, les altérations de leur statut métabolique reflètent les changements dans leur santé et leur fonction. La respirométrie à haute résolution permet une analyse cinétique en temps réel des deux principales voies bioénergétiques, la glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS), grâce à la quantification du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et du taux de consommation d’oxygène (OCR), respectivement. Ce qui suit est un protocole optimisé pour effectuer une respirométrie à haute résolution sur les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines primaires (H-RPE). Ce protocole fournit une description détaillée des étapes impliquées dans la production de profils bioénergétiques de RPE pour définir leurs capacités OXPHOS et glycolytiques basales et maximales. L’exposition de l’HP-RPE à différentes injections de médicaments ciblant la machinerie mitochondriale et glycolytique permet d’obtenir des profils bioénergétiques définis, à partir desquels les paramètres métaboliques clés peuvent être calculés. Ce protocole met en évidence la réponse accrue de BAM15 en tant qu’agent de découplage par rapport au cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) pour induire la capacité respiratoire maximale dans l’EPR. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le statut bioénergétique de l’EPR dans différentes conditions pathologiques et tester l’efficacité de nouveaux médicaments dans la restauration de l’état métabolique de base de l’EPR.

Introduction

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) existent sous la forme d’une monocouche de cellules épithéliales pigmentées stratégiquement situées entre les photorécepteurs et l’endothélium fenêtré du choriocapillaire. Les EPR sont hautement métaboliquement actifs avec de nombreuses fonctions, y compris (1) la phagocytose des disques photorécepteurs excrétés, (2) le recyclage des pigments visuels pour maintenir le cycle visuel, (3) le transport des nutriments, des métabolites, des ions et de l’eau, (4) l’absorption de la lumière, (5) la protection contre la photooxydation, (6) la sécrétion de facteurs essentiels pour soutenir l’intégrité de la rétine, et (7) la formation de la barrière hémato-rétinienne externe1 . La dégénérescence de l’EPR est associée à un dysfonctionnement métabolique et à des défauts mitochondriaux, entraînant des maladies oculaires cécitant telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la vitréorétinopathie proliférative (RVP)2.

Deux voies bioénergétiques clés comprennent la glycolyse, qui se produit dans le cytoplasme, et la phosphorylation oxydative (OXPHOS), qui se produit dans les mitochondries. Au cours de la glycolyse, une molécule de glucose est convertie en deux molécules de pyruvate et une production nette de deux molécules d’adénosine triphosphate (ATP). Contrairement à la glycolyse, OXPHOS produit des niveaux beaucoup plus élevés d’ATP (~32-38 molécules d’ATP par molécule de glucose). Notamment, OXPHOS consomme de l’oxygène et nécessite des mitochondries fonctionnelles pour se produire, alors que la glycolyse se produit dans le cytoplasme et ne nécessite pas d’oxygène.

Avant l’introduction de techniques basées sur la fluorescence ou la phosphorescence pour examiner la respiration mitochondriale, les niveaux d’oxygène étaient mesurés dans des suspensions cellulaires perméabilisées dans des chambres équipées d’une électrode d’oxygène de type Clark3. Bien que l’électrode Clark soit beaucoup moins chère que la pneumométrie à fluorescence et fonctionne dans les cellules non adhérentes, elle a un débit relativement faible, chaque passage respiratoire durant environ 15 à 20 minutes et nécessitant des quantités beaucoup plus élevées de cellules pour chaque échantillon3. Ainsi, la technique de respirométrie basée sur la fluorescence a largement remplacé l’électrode Clark et est devenue une technique populaire dans les domaines du métabolisme et de la recherche mitochondriale.

Ce protocole décrit une technique de respirométrie à haut débit et à haute résolution basée sur la fluorescence qui mesure cinétiquement les profils bioénergétiques OXPHOS et glycolytiques des cellules vivantes. Étant donné que le processus d’OXPHOS consomme de l’oxygène, le profil bioénergétique d’OXPHOS est produit en cartographiant les changements dans le taux de consommation d’oxygène (OCR) au fil du temps4. Dans cette technique, deux fluorophores sont intégrés dans le manchon de la cartouche du capteur qui est connecté à des faisceaux de fibres optiques qui émettent de la lumière, excitant les fluorophores. Les changements dans l’émission de fluorophores sont mesurés par des capteurs de fluorescence très sensibles et transmis à travers le faisceau de fibres optiques pour être convertis en lecture OCR5. Le fluorophore est éteint par l’oxygène, permettant ainsi la détermination des niveaux d’oxygène extracellulaire dans le milieu de dosage, connu sous le nom de flux d’oxygène ou OCR. L’autre fluorophore est une sonde de pH sensible aux changements dans l’efflux de protons, qui est convertie en une mesure du taux d’acidification extracellulaire (ECAR). Pendant les mesures, les faisceaux de fibres optiques avec fluorophores intégrés sont abaissés à 200 μm au-dessus de la monocouche cellulaire, créant une micro-chambre transitoire qui permet des lectures rapides et en temps réel. Une fois qu’un changement de 10% des niveaux d’oxygène ou de protons est détecté, les capteurs sont soulevés vers le haut, ce qui permet à un plus grand volume de fluide de se mélanger aux milieux transitoires à micro-chambre, rétablissant les valeurs OCR et ECAR à la ligne de base. Chaque cartouche de capteur est équipée de quatre ports pour permettre l’administration séquentielle de jusqu’à quatre composés par puits pendant le test. Les mesures peuvent être recueillies avant et après l’injection des composés dans chaque orifice, révélant des informations clés sur l’état métabolique des cellules.

L’interrogation de ces deux voies métaboliques distinctes peut donner lieu à d’importantes découvertes concernant l’état métabolique de l’EPR à la suite d’une exposition à différents stimuli pathogènes, et peut donc être utilisée pour tester l’efficacité des médicaments dans la restauration de l’intégrité métabolique de l’EPR 6,7,8. L’avènement de la respirométrie à haut débit et la disponibilité d’inhibiteurs mitochondriaux spécifiques ont stimulé davantage de recherches dans la définition des profils bioénergétiques de l’EPR et l’identification des défauts du métabolisme et des mitochondries au cours des états pathologiques 6,7,8,9,10,11,12,13 . La respirométrie à haute résolution a mis en évidence le rôle clé de la reprogrammation métabolique de l’EPR dans les pathologies rétiniennes telles que la DMLA et la RVP. Deux cytokines clés impliquées dans la pathogenèse de la DMLA et de la PVR sont le facteur de croissance transformant bêta 2 (TGFβ2) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα). L’induction de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) par TGFβ2 s’accompagne d’un dysfonctionnement mitochondrial, d’une suppression d’OXPHOS et d’une augmentation compensatoire de la capacité glycolytique dans l’EPR6. Plus récemment, il a été démontré que la cytokine pro-inflammatoire, TNFα, induisait une régulation positive significative de l’OXPHOS basal et une glycolyse réduite dans H-RPE7. L’administration de fumarate de diméthyle a significativement supprimé l’inflammation induite par le TNFα dans H-RPE et restauré la morphologie mitochondriale et les profils bioénergétiques basaux7. Les profils métaboliques divergents induits par ces deux facteurs de croissance suscitent des questions mécanistes intrigantes concernant l’implication de la reprogrammation métabolique dans les maladies de la rétine. Le protocole suivant décrit les étapes d’évaluation d’OXPHOS et des profils bioénergétiques glycolytiques dans l’HP-RPE à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Protocol

1. Placage de H-RPE dans la plaque de culture cellulaire Décongeler l’HP-RPE dans une fiole T25 dans un milieu EPR humain complété par des suppléments de milieu de croissance EPR (4 mM de L-glutamine, 25 ng/mL de FGF-2, 2 % de FBS, 30 mg/mL de gentamicine et 15 μg/mL d’amphotéricine). Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. Rafraîchir le média le lendemain et attendre que les cellules atteignent au moins 80% de confluence avant de passer dans un rapport de 1:3 dans une fiole T75. Une fois confluentes, faire passer les cellules à l’aide du kit de réactifs de sous-culture composé d’une solution de trypsine/EDTA à 0,025 %, d’une solution neutralisante de trypsine et d’une solution saline tamponnée HEPES (pH 7,0-7,6).Rincer doucement le H-RPE avec 3 ml de solution saline tamponnée HEPES. Ajouter ensuite 3 mL de trypsine/EDTA et incuber (37 °C et 5 % de CO2) pendant 5 min (ou jusqu’à ce que les cellules se soient détachées de la base de la fiole, comme observé au microscope). Neutraliser la trypsine/EDTA avec 3 mL de solution neutralisante de trypsine. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3,5 min pour former la pastille de cellule. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Resuspendre les cellules dans un milieu EPR humain jusqu’à une concentration finale de 20 000 cellules par 100 μL par puits.Pipeter plusieurs fois de haut en bas pour s’assurer que la suspension cellulaire est homogène, en utilisant une pipette multicanal pour faciliter et uniformiser le pipetage dans la microplaque de culture cellulaire à 96 puits. Posez l’extrémité de la pipette juste en dessous du bord circulaire au sommet du puits pour obtenir une couche cellulaire uniforme et homogène.REMARQUE: Aucun revêtement n’est nécessaire car les cellules adhèrent bien à la microplaque. Assurez-vous de laisser les quatre puits d’angle vides de cellules (100 μL de média seulement) pour servir de puits de correction de fond (figure 1A).REMARQUE: La microplaque est formatée dans une conception typique de plaque à 96 puits; Cependant, la surface de chaque puits est de 0,106 cm2, ce qui est 40% plus petit qu’une plaque standard de 96 puits. À cette densité cellulaire, les cellules devraient être confluentes à 100% le lendemain. Il est recommandé d’effectuer une expérience d’optimisation de la densité cellulaire avant de tester les traitements pour s’assurer que les lectures OCR basales et ECAR sont d’environ 50-100 pmol / min et 10-20 mpH / min, respectivement. Laisser la plaque de culture cellulaire à température ambiante (RT) pendant 1 h avant de la remettre dans l’incubateur (5 % de CO2, 37 °C, humidifié) pour aider à minimiser les effets de bord. Les effets de bord sont des changements de volume de média dans les puits des bordures périphériques de la plaque de 96 puits dus à l’évaporation14.REMARQUE: Les cellules adhèrent pendant la nuit et forment une monocouche confluente le lendemain. Les H-RPE sont mûris dans la plaque pendant au moins 1 mois en rafraîchissant la moitié du milieu de croissance tous les 2-3 jours. Examinez les cellules au microscope avant de changer le milieu pour vérifier leur morphologie et leur niveau de pigmentation. S’assurer que les cellules sont confluentes avec une morphologie pavée caractéristique et acquièrent une pigmentation au fil du temps, comme le montrent les images morphologiques de Shu et al.7. 2. La veille de l’exécution du test Assurez-vous que la cartouche du capteur est hydratée la veille de l’essai en remplissant chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 μL d’eau désionisée.REMARQUE: Le couvercle de la plaque utilitaire contient des biocapteurs fluorescents pour mesurer les niveaux d’oxygène et de pH pour chaque puits. Les capteurs sont couplés à des guides d’ondes à fibre optique qui fournissent de la lumière à différentes longueurs d’onde d’excitation et transmettent un signal fluorescent à travers des filtres optiques aux photodétecteurs. Placez la cartouche du capteur immergée dans l’eau dans la plaque utilitaire avec ~20 ml d’étalonnage (à réchauffer pour une utilisation le lendemain) dans un four humidifié à 37 °C (sans CO2) pendant la nuit.REMARQUE: L’étalonnage est une solution exclusive conçue pour l’étalonnage des cartouches de capteur et sa composition est probablement similaire à celle de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Le temps minimum d’hydratation de la cartouche est de 4 h, mais les meilleurs résultats sont obtenus avec l’hydratation de nuit. Assurez-vous que l’instrument est allumé et démarrez le logiciel pour lui permettre de se stabiliser à 37 °C pendant la nuit (Figure 2). Généralement, l’instrument peut être laissé allumé même lorsqu’il n’est pas utilisé. 3. Test de stress Mito en temps réel à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Le jour de l’essai, remplacer l’eau de la plaque utilitaire par un volume égal d’étalonnage chauffé au moins 45 minutes avant l’essai. Fabriquer le milieu d’essai Mito Stress Test en utilisant le milieu de base sans rouge phénol en ajoutant des suppléments, comme indiqué dans le tableau 1. Réchauffez le média à 37 °C, réglez le pH à 7,4 et filtrez le média sous vide à l’aide d’une unité de filtration supérieure tubulaire. Pour faire fonctionner une plaque pleine, faire ~25 mL de milieu de dosage. Retirer le milieu humain EPR et le remplacer par 180 μL de milieu de dosage fraîchement préparé (étape 3.2). Placer la plaque de culture cellulaire dans un four humidifié à 37 °C (sans CO2) pendant 1 h avant de commencer le dosage.REMARQUE: Ceci est important pour le dégazage de la plaque cellulaire, permettant la diffusion du CO2 . Étant donné que les cellules ne sont plus dans leur milieu de croissance et ne sont plus dans un incubateur contenant duCO2, leur viabilité se détériorera avec le temps, par conséquent, il faut prendre soin de mener le test aussi efficacement que possible. Il faut également veiller à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans la plaque de culture cellulaire; S’il y en a, faites-les sauter avec une pipette ou une aiguille. Chaque cartouche de capteur dispose de quatre orifices de distribution de réactifs par puits pour l’injection de composés d’essai dans les puits de la plaque de culture cellulaire pendant l’essai (Figure 1C,D). Préparer ~3 ml des solutions médicamenteuses 10x en diluant les stocks de médicaments dans les milieux de dosage respectifs conformément au tableau 2. Par exemple, charger l’orifice A avec 25 μM d’oligomycine dissoute dans le milieu d’essai du test de résistance Mito, de sorte que lorsque le volume de médicament est injecté dans le puits par l’instrument, la concentration finale à laquelle chaque cellule est exposée est de 2,5 μM. Pipeter 20 μL du stock de médicament 10x dans le port A, 22 μL dans le port B, et 25 μL dans le port C, pour atteindre la concentration finale spécifiée dans chaque puits. Pour les protocoles nécessitant les quatre orifices de médicament, pipeter 28 μL dans le port D.REMARQUE : Reportez-vous à la figure 1B lorsque vous pipetez les médicaments dans les orifices pour connaître l’orientation appropriée des orifices A/B/C/D. L’encoche sur le bord de la cartouche doit être située dans le coin inférieur gauche lors du chargement des ports de médicament. En pipetant à un angle dans chaque port de drogue, les bulles peuvent être minimisées. S’il y a des bulles présentes, il faut prendre soin de les faire éclater avec une pipette ou une aiguille. Ouvrez l’onglet Modèles dans le logiciel d’analyse, sélectionnez Test de contrainte Mito et remplissez les définitions de groupe.Entrez des détails sur la stratégie d’injection (dans ce cas, il est pré-entré en tant que médicament Mito Stress Test). Entrez les détails concernant les différents groupes expérimentaux dans l’essai (p. ex., témoin ou traitement). Entrez les détails sur le milieu de dosage (ajout de différents suppléments et de leurs concentrations spécifiques au milieu de dosage de base) et enfin ajoutez le type de cellule. Cliquez sur l’onglet suivant, Carte des plaques, où les différents groupes examinés seront affectés à leur emplacement spécifique sur la carte des plaques à 96 puits. Une fois cela fait, cliquez sur l’onglet Protocole pour examiner le protocole d’instrument pour le protocole de test de résistance Mito par défaut.REMARQUE: Le modèle de test de contrainte Mito par défaut est prêt à l’emploi mais peut être modifié de quelque manière que ce soit pour s’adapter à la conception expérimentale. Par exemple, le temps de mesure par défaut est de 3 min, mais il peut être modifié à 5 min si vous le souhaitez. Cliquez sur Exécuter le test et insérez la cartouche de capteur immergée dans la solution d’étalonnage dans la plaque utilitaire. Ce processus prend environ 25 min. Dans cette étape, chaque biocapteur est étalonné indépendamment en fonction de la sortie du capteur mesurée dans la solution d’étalonnage dont le pH et la concentration en oxygène sont connus.Une fois celle-ci calibrée, retirez la plaque utilitaire et insérez la plaque de culture cellulaire.REMARQUE: La plaque de culture cellulaire est d’abord équilibrée, après quoi l’instrument commence à mélanger le milieu de dosage et à mesurer les valeurs OCR et ECAR. Cette étape dure environ 1,5 h et est effectuée à l’intérieur de l’instrument sans aucune intervention de l’utilisateur. Une lecture de référence de l’OCR et de l’ECAR est d’abord établie en mélangeant le milieu de dosage pendant 3 minutes, puis en mesurant l’OCR et l’ECAR pendant 3 min. L’instrument effectue trois boucles de mixage et de mesure. Après la mesure de base, l’instrument injecte automatiquement la solution médicamenteuse de Port A dans chaque puits. Suivent trois boucles de mélange et de mesure (3 min chacune). Le même schéma se produit après chaque injection subséquente de médicament (ports B et C). Une fois l’exécution terminée, retirez la plaque de culture cellulaire et la cartouche du capteur. À des fins de contrôle de la qualité, assurez-vous que tous les ports de médicament dans la cartouche de capteur ont été injectés en examinant les orifices pour vérifier qu’il ne reste aucun médicament résiduel. Jetez la cartouche du capteur et la plaque utilitaire car il s’agit d’articles à usage unique. Examiner les cellules de la microplaque de culture cellulaire au microscope pour s’assurer qu’il y a toujours une monocouche confluente de cellules. Jetez le milieu de dosage et remplacez-le par 60 μL de tampon de lyse 1x dans chaque puits.REMARQUE: Le tampon de lyse est fabriqué à partir de tampon de lyse 10x dilué à 1x dans de l’eau désionisée avec l’ajout de 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Enveloppez les bords de la plaque dans du parafilm pour éviter l’évaporation et placez-la dans un congélateur à -80 °C pour faciliter la lyse cellulaire pendant la nuit, avant de quantifier la teneur en protéines à l’aide du dosage BCA. Pour l’analyse des données, normalisez toutes les données en divisant les valeurs OCR et ECAR par le microgramme de protéine dans chaque puits. Exportez le générateur de rapports Mito Stress Test, qui utilise des macros Excel pour calculer automatiquement les paramètres du Mito Stress Test à l’aide du logiciel d’analyse de données.REMARQUE: Cela peut être utilisé pour déterminer la respiration basale, la respiration maximale, la capacité respiratoire de réserve, la fuite de protons, la production d’ATP et la respiration non mitochondriale. Les définitions de ces calculs sont présentées au tableau 3. 4. Test de stress glycolytique en temps réel à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Effectuer le test de stress glycolytique en suivant les mêmes étapes que le test de stress de Mito, sauf en utilisant les différents suppléments de milieux de dosage et injections de médicaments indiqués dans les tableaux 1 et 2. Pour l’analyse des données, exportez le générateur de rapports Glycolytic Stress Test, qui utilise des macros Excel pour calculer automatiquement les paramètres du test de stress glycolytique à partir du logiciel d’analyse de données.NOTE: Cela peut être utilisé pour déterminer l’acidification non glycolytique, la glycolyse, la capacité glycolytique et la réserve glycolytique. Les définitions de ces calculs sont présentées au tableau 3. 5. Dosage de quantification des protéines BCA REMARQUE : Le test de quantification des protéines de l’acide bicinchonique (BCA) (également connu sous le nom de testSmith 15) est un test colorimétrique à base de cuivre utilisé pour déterminer la teneur totale en protéines d’un échantillon. La normalisation des données OCR et ECAR au microgramme de protéines dans chaque puits garantit que différentes quantités de cellules/protéines dans chaque puits ne faussent pas les lectures. Le mécanisme du test BCA est basé sur deux réactions chimiques. Tout d’abord, les liaisons peptidiques dans les protéines réduisent les ions cuivriques (Cu2+) en ions cupreux (Cu+), qui est une réaction dépendante de la température assistée par des températures plus élevées (37 à 60 °C). S’il y a plus de liaisons peptidiques, rendre la quantité de Cu2+ proportionnelle à la teneur en protéines dans la solution16. Cette réaction entraîne un changement de couleur du vert à une solution violette intense, avec une absorbance maximale à 562 nm16. Plus la teneur en protéines de l’échantillon est élevée, plus l’absorbance à cette longueur d’onde est élevée. La plage de travail de ce kit est de 20 à 2 000 μg/mL. La trousse de dosage BCA contient 1 mL d’aliquotes d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 mg/mL, qui sert d’étalon de référence pour la concentration de protéines. Préparer une dilution en série dans une plaque transparente à fond plat de 96 puits en partant de la BSA non diluée de 2 mg/mL, puis en réduisant de moitié la concentration en diluant dans de l’eau désionisée (p. ex. 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/mL, etc.). L’utilisation d’une concentration connue de protéines permet de calculer une courbe standard, qui est utilisée pour calculer la teneur en protéines des échantillons expérimentaux. Pour améliorer la précision des mesures de la teneur en protéines calculées, mesurer les lectures d’absorbance des étalons de référence de concentration en protéines à côté des échantillons expérimentaux pour chaque essai. Pipeter 25 μL de chaque dilution en série BSA en double dans la plaque de 96 puits. Pipeter 25 μL du tampon de lyse 1x en double dans la plaque de 96 puits pour servir d’ébauche. Décongeler la plaque de culture cellulaire à température ambiante et pipeter 25 μL de chaque lysat cellulaire en double dans la plaque de 96 puits. Préparer le réactif de travail dans un rapport de 50:1 de réactifs du kit BCA A:B. Bien mélanger par vortex pour éliminer toute turbidité dans le réactif de travail, de sorte qu’il s’agisse d’une solution verte homogène. Ajouter 200 μL du réactif fonctionnel à chaque puits. Protéger la plaque de la lumière en la recouvrant de papier d’aluminium et incuber dans un four à 37 °C pendant 20 min. Mesurer l’absorbance à 562 nm dans un lecteur de plaques à 96 puits. Pour l’analyse des données, faites la moyenne de toutes les valeurs dupliquées. Soustrayez les niveaux d’absorbance à blanc déterminés à partir des puits tampons de lyse 1x des mesures de tous les échantillons. Déterminer la courbe étalon en traçant l’absorbance de chaque étalon BSA jusqu’à sa concentration connue en μg/mL. Utilisez l’équation linéaire dérivée de la courbe standard pour déterminer la concentration en protéines des échantillons expérimentaux.

Representative Results

L’instrument mesure simultanément l’OCR et l’ECAR pour chaque course. Pour le test de contrainte de Mito, les calculs de paramètres sont basés sur les lectures OCR (Figure 3A), tandis que pour le test de stress glycolytique, les calculs de paramètres sont basés sur les lectures ECAR (Figure 3B). La figure 3 montre des graphiques représentatifs de la courbe OCR du test de contrainte de Mito au fil du temps (figure 3C) et des calculs de paramètres sous forme de graphiques à barres pour H-RPE (figure 3D). Le test de stress glycolytique est représenté sous la forme d’une courbe ECAR au fil du temps (figure 3E), et les calculs de paramètres sont affichés dans des graphiques à barres pour H-RPE (figure 3F). La respiration basale permet de comprendre les demandes énergétiques des cellules dans des conditions basales17. La première injection de médicament, l’oligomycine (Oligo), est un inhibiteur de l’ATP synthase et, par conséquent, toute réduction de l’OCR après la première injection de médicament est une mesure de la respiration liée à l’ATP18. Toute respiration basale restante après des injections ultérieures de médicament est considérée comme une fuite de protons car elle n’est pas couplée à la synthèse de l’ATP. Une fuite accrue de protons peut indiquer une augmentation du découplage mitochondrial, qui est régulé par le découplage de protéines physiologiquement présentes, mais qui ont également été liées à des pathologies telles que l’obésité, le cancer, le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires19. La deuxième injection est d’un agent de découplage, tel que BAM15 ou FCCP, pour déterminer le potentiel respiratoire maximal des mitochondries. Les agents de découplage réduisent le gradient de protons et réduisent la force motrice du proton à travers la membrane interne mitochondriale. Le résultat est un flux non inhibé d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons (ETC), ce qui élève le taux de consommation d’oxygène et permet à la respiration mitochondriale d’atteindre sa capacité maximale20. La capacité respiratoire de réserve (SRC) est la différence entre la respiration maximale et la respiration basale, indiquant la capacité des cellules à répondre aux changements dans les demandes énergétiques lorsqu’elles sont mises au défi, indiquant l’aptitude cellulaire. Il est important de noter que pour le test d’effort de Mito dans l’HP-RPE, BAM15 est supérieur au FCCP pour améliorer la capacité respiratoire mitochondriale (Figure 4A, B), car la respiration maximale et la capacité respiratoire de réserve sont significativement plus élevées avec 10 μM BAM15 par rapport à 500 nM ou 1 μM FCCP. Aucune différence significative n’a été observée entre les deux doses de FCCP. La troisième et dernière injection de roténone et d’antimycine A (Rot/AA) inhibe respectivement les complexes mitochondriaux I et III de l’ETC, ce qui arrête la respiration mitochondriale; toute OCR résiduelle est due à des sources non mitochondriales21. Au cours de la glycolyse, une molécule de glucose est convertie en deux molécules de lactate en l’absence d’oxygène. L’extrusion de lactate de la cellule s’accompagne de l’efflux d’un proton par molécule de lactate, provoquant ainsi une acidification de l’espace extracellulaire. Le flux de production de protons dans les milieux est mesuré par les changements dans l’ECAR. Les niveaux de glycolyse basale sont établis en premier, après quoi le glucose est injecté dans le milieu de dosage, qui est dépourvu de glucose, pour induire la glycolyse et ainsi augmenter les niveaux d’ECAR22. L’oligomycine est injectée pour induire l’ECAR « le plus élevé » car il arrête la production d’ATP mitochondrial, forçant ainsi la cellule à dériver son ATP par glycolyse. Enfin, la glycolyse est arrêtée par l’ajout de 2DG, qui inhibe l’hexokinase, la première enzyme de la glycolyse23. Tout ECAR restant est probablement dû à d’autres sources d’acidification, telles que la production de CO2 par le cycle TCA pendant OXPHOS, et est noté ECAR non glycolytique. La réserve glycolytique est calculée comme la différence entre l’ECAR « le plus élevé » et l’ECAR en présence de glucose. La capacité glycolytique est la somme de la glycolyse et de la réserve glycolytique. Figure 1 : Composants de la plaque et de la cartouche du capteur. (A) L’instrument, le logiciel d’analyse de données et l’interface de configuration du protocole sont affichés. Dans la disposition des plaques de culture de 96 puits, les cellules sont plaquées dans les puits de couleur bleue et les quatre puits d’angle sont marqués en noir, car ils servent de puits de correction arrière qui ne contiennent que des milieux (et pas de cellules). (B) Il y a quatre ports de médicament pour chaque puits de la cartouche de capteur où les médicaments A, B, C et D peuvent être chargés. Les volumes à pipeter dans chaque port sont répertoriés en fonction des calculs pour 10x les préparations de stock de médicaments. (C) La cartouche de capteur est constituée de sondes de capteur qui sont placées directement dans la plaque utilitaire remplie d’étalonnage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Chronologie de l’essai. Les cellules sont ensemencées dans la plaque de culture cellulaire. Une fois prêt, le test implique une procédure de 2 jours suivie d’une quantification de la teneur en protéines à l’aide du test BCA et d’une analyse ultérieure des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Graphiques représentatifs du test de stress de Mito et du test de stress glycolytique. Les calculs des paramètres (A) du test de contrainte de Mito et (B) du test de stress glycolytique sont décrits dans le schéma. (C) Courbe représentative de consommation d’oxygène (OCR) et (D) paramètres de l’essai de contrainte de Mito pour le H-RPE sont indiqués. (E) Courbe représentative du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et (F) paramètres de l’essai de stress glycolytique pour le H-RPE sont indiqués. Les barres d’erreur sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Comparaison entre BAM15 et FCCP en tant qu’agent de découplage. Test de stress de Mito sur H-RPE comparant l’efficacité de l’induction d’une respiration maximale en utilisant 10 μM BAM15, 500 nM FCCP ou 1 μM FCCP, montrant la courbe (A) du taux de consommation d’oxygène (OCR) et (B) les paramètres du test de stress de Mito. Les barres d’erreur sont des moyennes ± SEM. **** p ≤ 0,0001; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Test Glucose (mM) GlutaMax (mM) Pyruvate de sodium (mM) HEPES (mM) Test de résistance Mito 25 2 1 1 Test d’effort glycolytique Aucun 0.5 Aucun 1 Tableau 1 : Concentration des suppléments ajoutés au milieu d’essai pour les tests de résistance de Mito et de glycolyse.  Test Port A Port B Port C Test de résistance Mito Oligomycine 2,5 μM FCCP 500 nM OU BAM15 10 μM Roténone 2 μM ET Antimycine A 2 μM Test d’effort glycolytique Glucose 10 mM Oligomycine 2 μM 2-Désoxyglucose 50 mM Tableau 2 : Concentrations des injections au port de médicament pour les tests de résistance de Mito et de glycolyse. Il est important de noter que ce sont les concentrations finales auxquelles les cellules sont exposées après l’injection des médicaments dans chaque puits. Les médicaments doivent être préparés 10 fois plus fort lors du chargement des ports de drogue. Terme Définition Calibrant Le calibrant est une solution utilisée pour étalonner la cartouche du capteur. Sa formulation est exclusive et a une composition similaire à celle du PBS. Cartouche de capteur La cartouche de capteur contient deux fluorophores intégrés dans le manchon de la cartouche de capteur qui sont connectés à des faisceaux de fibres optiques qui émettent de la lumière, excitant les fluorophores. Un fluorophore mesure le flux d’oxygène et l’autre mesure le flux de protons. Chaque cartouche de capteur est également équipée de 4 ports pour permettre l’administration séquentielle de jusqu’à 4 composés par puits pendant le test. Plaque utilitaire La plaque utilitaire (également connue sous le nom de plaque d’étalonnage) est utilisée pour étalonner les capteurs. La solution Calibrant est placée dans la plaque utilitaire. Test de résistance Mito Le test de stress de Mito est le nom du test qui fournit le profil bioénergétique de la respiration mitochondriale en traçant les changements dans l’OCR au fil du temps. Test d’effort glycolytique Le test de stress glycolytique est le nom du test qui fournit le profil bioénergétique glycolytique en traçant les changements dans l’ECAR au fil du temps. Taux de consommation d’oxygène (TCO) Le taux de consommation d’oxygène est une mesure du flux d’oxygène (pmol / min) et indique l’état métabolique mitochondrial. Taux d’acidification extracellulaire (ECAR) Le taux d’acidification extracellulaire est une mesure de l’efflux de protons (mpH/min) et indique l’état métabolique glycolytique. Logiciel Wave Le logiciel Wave est utilisé pour la programmation du test et l’analyse ultérieure des données Consommation d’oxygène non mitochondrial Mesure du taux minimal après injection de roténone/antimycine A Respiration basale (Dernière mesure du taux avant la première injection) – (Taux de respiration non mitochondriale) Respiration maximale (Mesure du taux maximal après injection de FCCP) – (Respiration non mitochondriale) Fuite H+ (proton) (Mesure du taux minimum après injection d’oligomycine) – (Respiration non mitochondriale Production d’ATP (Dernière mesure du taux avant l’injection d’oligomycine) – (Mesure du taux minimum après injection d’oligomycine) Capacité respiratoire de rechange (Respiration maximale) – (Respiration basale) Capacité respiratoire inutilisée en % (Respiration maximale) / (Respiration basale) × 100 Efficacité du couplage Taux de production d’ATP) / (Taux de respiration basale) × 100 Glycolyse (Mesure du taux maximum avant injection d’oligomycine) – (Dernière mesure du taux avant l’injection de glucose) Capacité glycolytique (Mesure du débit maximum après injection d’oligomycine) – (Dernière mesure du taux avant l’injection de glucose) Réserve glycolytique (Capacité glycolytique) – (Glycolyse) Réserve glycolytique en % (Taux de capacité glycolytique) /(Glycolyse) × 100 Acidification non glycolytique Dernière mesure du taux avant l’injection de glucose Tableau 3 : Liste des définitions des éléments clés de l’essai.

Discussion

Ce protocole optimisé pour la respirométrie haute résolution de H-RPE implique l’utilisation de BAM15 comme découpleur au lieu du FCCP couramment utilisé. Alors que les études précédentes sur la respirométrie à haute résolution de l’EPR utilisaient FCCP 9,24, BAM15 semble induire une induction plus robuste des niveaux respiratoires maximaux dans l’HP-RPE par rapport au FCCP. Bien que le FCCP et le BAM15 puissent être utilisés en toute sécurité dans les cellules, le BAM15 aurait moins d’effets secondaires dans les cellules normales que le FCCP ou le carbonylcyanure-3-chlorophénylhydrazone (CCCP)25. Kenwood et al. ont montré que BAM15 dépolarise les mitochondries sans impacter le potentiel de la membrane plasmique, induisant ainsi un taux de respiration mitochondriale maximal soutenu à faible cytotoxicité26. FCCP, d’autre part, dépolarise à la fois les mitochondries et la membrane plasmique et affiche une cytotoxicité plus élevée26.

Le protocole comporte plusieurs étapes critiques, notamment s’assurer que les cellules sont correctement plaquées dans une monocouche confluente, uniforme et homogène d’EPR dans tous les puits expérimentaux de la microplaque. Les EPR matures dépendent fortement d’OXPHOS pour la production d’énergie, et les cellules doivent donc être autorisées à mûrir pendant au moins 1 mois pour s’assurer que l’EPR génère des lectures OCR basales et maximales appropriées pendant le test. Dégazer la plaque de culture cellulaire pendant 1 h à 37 °C dans un four humidifié (sans CO 2) avant de la placer dans l’instrument est crucial pour des lectures précises de l’ECAR, car le CO2 peut avoir un impact sur le pH du milieu de dosage. Il est important de ne pas oublier d’hydrater la cartouche du capteur la veille du test pour s’assurer qu’elle fournit des lectures fiables de l’OCR et de l’ECAR le jour du test. Il faut prendre soin de reconstituer correctement les drogues à injecter et aliquote les stocks de médicaments reconstitués en plus petits volumes pour un stockage à long terme afin de minimiser les cycles de congélation et de décongélation. Il est essentiel de préparer des solutions médicamenteuses 10x qui sont diluées dans les milieux d’essai respectifs (p. ex., diluées dans les milieux d’essai Mito Stress Test pour le Mito Stress Test) pour tenir compte de la dilution de l’injection du médicament dans chaque puits rempli de milieux d’essai. À chaque injection de médicament subséquente, il y a plus de milieux dans chaque puits, et donc les volumes de médicament chargés augmentent à chaque injection, et il faut prendre soin de suivre les volumes spécifiés dans le protocole. Il est important d’effectuer des contrôles de qualité à la fin de l’expérience en examinant la cartouche du capteur pour s’assurer qu’aucun médicament résiduel n’est évident et en observant la plaque de culture cellulaire au microscope pour s’assurer que la monocouche cellulaire confluente et homogène reste.

Les modifications apportées à ce protocole comprennent l’injection de différents médicaments dans les ports et la détermination de l’impact de ces médicaments sur les lectures OCR et ECAR. Une modification populaire consiste à injecter un médicament expérimental de votre choix comme le Port A avant d’injecter les médicaments habituels Mito ou Glycolytic Stress Test. Ce type de protocole donne un aperçu de la façon dont une injection aiguë du médicament de choix affecte les paramètres OXPHOS et glycolytiques ultérieurs. D’autres modifications comprennent l’examen de différents types de cellules; cela nécessite un dépannage initial de la densité optimale des cellules d’ensemencement et l’optimisation du milieu de dosage en veillant à ce que les lectures basales varient de 50 à 100 pmol / min pour l’OCR et de 10 à 20 mpH / min pour l’ECAR. Les concentrations optimales des drogues injectables doivent être déterminées pour chaque nouveau type de cellule examiné en observant les réponses OCR et ECAR à une dilution en série des médicaments.

L’une des principales limites du protocole est que la viabilité cellulaire diminue avec le temps, car les cellules ne sont pas dans un incubateur de CO2 dans leur milieu de croissance normal, et donc le test doit être terminé dans les 3-4 heures pour assurer une viabilité cellulaire maximale. De plus, l’exposition aux toxines mitochondriales injectées dans chaque puits peut encore diminuer la viabilité cellulaire au fil du temps. Une fois le test terminé, les cellules doivent être lysées pour l’évaluation de la teneur en protéines afin de normaliser les lectures OCR et ECAR, et donc les mêmes cellules ne peuvent pas être récoltées pour des tests de biologie moléculaire ultérieurs.

Les alternatives à l’hippocampe pour le profilage bioénergétique comprennent l’Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, le BaroFuse28,29 et le Resipher (Lucid Scientific)7. L’Oroboros O2k est un respiromètre fermé à deux chambres qui utilise des électrodes d’oxygène polarographiques de type S1 Clark. Alors que l’Oroboros O2k produit des mesures très sensibles du flux métabolique en temps réel, le dispositif nécessite beaucoup de main-d’œuvre car l’opérateur doit injecter manuellement chaque médicament30. Le BaroFuse est un nouveau système de perfusion microfluidique multicanal qui utilise la pression du gaz pour permettre plusieurs expériences de perfusion parallèles et est relié à un système de détection d’oxygène pour mesurer l’OCR. L’avantage de ce système de culture en flux est que la fonction et la viabilité des tissus sont maintenues, contrairement à l’hippocampe où la viabilité cellulaire diminue au cours de tests plus longs. Le Resipher utilise des capteurs optiques d’oxygène très sensibles pour mesurer l’OCR pendant que les cellules sont dans une plaque de 96 puits dans l’incubateur, permettant ainsi des mesures OCR continues sur plusieurs semaines à plusieurs mois. Notamment, ces instruments ne mesurent pas l’ECAR, et donc l’hippocampe a l’avantage d’explorer simultanément à la fois l’OXPHOS et la glycolyse.

L’interrogation des profils bioénergétiques en temps réel d’OXPHOS et de glycolyse est en train de devenir un facteur clé dans la caractérisation de la santé et de la fonction des EPR. La respirométrie à haute résolution permet de comparer efficacement l’état métabolique de l’EPR normale et malade, ouvrant ainsi de nouvelles voies de dépistage de l’efficacité des médicaments pour les maladies rétiniennes telles que la DMLA et la RVP. Les orientations futures pour la respirométrie à haute résolution sur l’EPR comprennent l’optimisation d’un protocole pour examiner les profils bioénergétiques des monocouches d’EPR hautement polarisées cultivées sur des filtres transwell. Calton et al. (2016) y sont parvenus en coupant une section triangulaire de la monocouche RPE polarisée cultivée sur des filtres transwell31. L’élargissement de la méthodologie comprend l’examen des profils bioénergétiques de l’EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (iPSC-RPE), isolée chez des patients atteints de différentes maladies dégénératives de la rétine32. L’exploration de la façon dont les cytokines pathogènes impliquées dans la DMLA et la RVP influent sur la nature dynamique du métabolisme de l’EPR peut révéler des vulnérabilités métaboliques qui peuvent éclairer l’identification de nouvelles cibles médicamentables.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée en partie par des subventions de : la bourse postdoctorale Leonard & Robert Weintraub (D.Y.S.) Fight for Sight; Programme de bourses postdoctorales de la Fondation BrightFocus en recherche sur la dégénérescence maculaire (M2021010F, D.Y.S.); Département de la Défense, Programme de recherche sur la vision de la colonne vertébrale sous le numéro d’attribution VR180132 (M.S.-G. et L.A.K.); National Eye Institute des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01EY027739 (L.A.K.). Nous remercions les donateurs du programme de recherche sur la dégénérescence maculaire M2021010F, un programme de la Fondation BrightFocus, pour leur soutien à cette recherche. Les schémas ont été créés avec Biorender.com

Materials

2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S  Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay
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References

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Fitch, T. C., Frank, S. I., Li, Y. K., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (192), e64572, doi:10.3791/64572 (2023).
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