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Biology

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/64572
, , , , ,
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology,Harvard Medical School

Summary

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Abstract

La disfunción metabólica de las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) es un impulsor patógeno clave de enfermedades de la retina como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la vitreorretinopatía proliferativa (RVP). Dado que los EPR son células altamente activas metabólicamente, las alteraciones en su estado metabólico reflejan cambios en su salud y función. La respirometría de alta resolución permite el análisis cinético en tiempo real de las dos principales vías bioenergéticas, la glucólisis y la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), a través de la cuantificación de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), respectivamente. El siguiente es un protocolo optimizado para realizar respirometría de alta resolución en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria (H-RPE). Este protocolo proporciona una descripción detallada de los pasos involucrados en la producción de perfiles bioenergéticos de EPR para definir sus capacidades basales y máximas de OXPHOS y glucolíticas. La exposición del H-RPE a diferentes inyecciones de fármacos dirigidos a la maquinaria mitocondrial y glucolítica da como resultado perfiles bioenergéticos definidos, a partir de los cuales se pueden calcular parámetros metabólicos clave. Este protocolo destaca la respuesta mejorada de BAM15 como agente de desacoplamiento en comparación con el cianuro de carbonilo p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) para inducir la capacidad respiratoria máxima en RPE. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el estado bioenergético del EPR en diferentes condiciones de enfermedad y probar la eficacia de nuevos fármacos en la restauración del estado metabólico basal del EPR.

Introduction

Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) existen como una monocapa de células epiteliales pigmentadas ubicadas estratégicamente entre los fotorreceptores y el endotelio fenestrado del coriocapilar. Los EPR son altamente activos metabólicamente con numerosas funciones, que incluyen (1) fagocitosis de discos fotorreceptores desprendidos, (2) reciclaje de pigmento visual para mantener el ciclo visual, (3) transporte de nutrientes, metabolitos, iones y agua, (4) absorción de luz, (5) protección contra la fotooxidación, (6) secreción de factores esenciales para apoyar la integridad de la retina, y (7) formación de la barrera externa sangre-retina1 . La degeneración del EPR se asocia con disfunción metabólica y defectos mitocondriales, lo que lleva a enfermedades oculares cegadoras como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la vitreorretinopatía proliferativa (RVP)2.

Dos vías bioenergéticas clave incluyen la glucólisis, que ocurre en el citoplasma, y la fosforilación oxidativa (OXPHOS), que ocurre en las mitocondrias. Durante la glucólisis, una molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de piruvato y una producción neta de dos moléculas de trifosfato de adenosina (ATP). En contraste con la glucólisis, OXPHOS produce niveles mucho más altos de ATP (~ 32-38 moléculas de ATP por molécula de glucosa). En particular, OXPHOS consume oxígeno y requiere mitocondrias funcionales para ocurrir, mientras que la glucólisis ocurre en el citoplasma y no requiere oxígeno.

Antes de la introducción de técnicas basadas en fluorescencia o fosforescencia para examinar la respiración mitocondrial, los niveles de oxígeno se medían en suspensiones celulares permeabilizadas en cámaras equipadas con un electrodo de oxígeno tipo Clark3. Si bien el electrodo de Clark es mucho más barato que la respirometría basada en fluorescencia y funciona en células no adherentes, tiene un rendimiento relativamente bajo, con cada carrera respiratoria que dura alrededor de 15-20 minutos y requiere cantidades mucho mayores de células para cada muestra3. Por lo tanto, la técnica de respirometría basada en fluorescencia ha reemplazado en gran medida al electrodo de Clark y se ha convertido en una técnica popular en los campos del metabolismo y la investigación mitocondrial.

Este protocolo describe una técnica de respirometría basada en fluorescencia de alto rendimiento y alta resolución que mide cinéticamente los perfiles bioenergéticos OXPHOS y glucolíticos de las células vivas. Dado que el proceso de OXPHOS consume oxígeno, el perfil bioenergético de OXPHOS se produce mediante el mapeo de cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) a lo largo del tiempo4. En esta técnica, dos fluoróforos están incrustados en la funda del cartucho del sensor que está conectada a haces de fibra óptica que emiten luz, excitando los fluoróforos. Los cambios en la emisión de fluoróforos se miden mediante sensores de fluorescencia altamente sensibles y se transmiten a través del haz de fibra óptica para convertirlos en una lectura de OCR5. El fluoróforo se apaga con oxígeno, lo que permite la determinación de los niveles de oxígeno extracelular en los medios de ensayo, conocidos como flujo de oxígeno u OCR. El otro fluoróforo es una sonda sensora de pH sensible a los cambios en el flujo de protones, que se convierte en una medida de la tasa de acidificación extracelular (ECAR). Durante las mediciones, los haces de fibra óptica con fluoróforos integrados se reducen a 200 μm por encima de la monocapa celular, creando una microcámara transitoria que permite lecturas rápidas y en tiempo real. Una vez que se detecta un cambio del 10% en los niveles de oxígeno o protones, los sensores se elevan hacia arriba, lo que permite que un mayor volumen de medios se mezcle con los medios transitorios de la microcámara, restaurando los valores de OCR y ECAR a la línea de base. Cada cartucho sensor está equipado con cuatro puertos para permitir la administración secuencial de hasta cuatro compuestos por pocillo durante el ensayo. Las mediciones se pueden recoger antes y después de la inyección de los compuestos en cada puerto, revelando información clave sobre el estado metabólico de las células.

Interrogar estas dos vías metabólicas distintas puede producir descubrimientos importantes sobre el estado metabólico del EPR después de la exposición a diferentes estímulos patógenos y, por lo tanto, puede usarse para probar la eficacia de los fármacos en la restauración de la integridad metabólica del EPR 6,7,8. El advenimiento de la respirometría de alto rendimiento y la disponibilidad de inhibidores mitocondriales específicos han estimulado más investigaciones para definir los perfiles bioenergéticos del EPR e identificar defectos en el metabolismo y las mitocondrias durante los estados de enfermedad 6,7,8,9,10,11,12,13 . La respirometría de alta resolución ha puesto de relieve el papel clave de la reprogramación metabólica del EPR en patologías retinianas como la DMAE y la RVP. Dos citocinas clave involucradas en la patogénesis de la DMAE y la RVP son el factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFβ2) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα). La inducción de la transición epitelial-mesenquimal (EMT) por TGFβ2 se acompaña de disfunción mitocondrial, supresión de OXPHOS y un aumento compensatorio de la capacidad glucolítica en RPE6. Más recientemente, se ha demostrado que la citoquina proinflamatoria, TNFα, induce una regulación positiva significativa de OXPHOS basal y reduce la glucólisis en H-RPE7. La administración de dimetilfumarato suprimió significativamente la inflamación inducida por TNFα en H-RPE y restauró la morfología mitocondrial y los perfiles bioenergéticos basales7. Los perfiles metabólicos divergentes inducidos por estos dos factores de crecimiento estimulan preguntas mecanicistas intrigantes sobre la participación de la reprogramación metabólica en las enfermedades de la retina. El siguiente protocolo describe los pasos para evaluar OXPHOS y perfiles bioenergéticos glucolíticos en H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Protocol

1. Recubrimiento de H-RPE en la placa de cultivo celular Descongelar el H-RPE en un matraz T25 en medio de EPR humano suplementado con suplementos de medio de crecimiento del EPR (4 mM de L-glutamina, 25 ng/ml de FGF-2, 2% de FBS, 30 mg/ml de gentamicina y 15 μg/ml de anfotericina). Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora humidificada. Refresque los medios al día siguiente y espere a que las células alcancen al menos el 80% de confluencia antes de pasar a una proporción de 1:3 a un matraz T75. Una vez confluentes, pasar las células utilizando el kit de subcultivo de reactivos que consiste en tripsina/EDTA solución al 0,025%, solución neutralizante de tripsina y solución salina tamponada HEPES (pH 7,0-7,6).Enjuague suavemente el H-RPE con 3 ml de solución salina tamponada HEPES. A continuación, añadir 3 ml de tripsina/EDTA e incubar (37 °C y 5% deCO2) durante 5 min (o hasta que las células se hayan levantado de la base del matraz, como se observa en el microscopio). Neutralizar la tripsina/EDTA con 3 ml de solución neutralizante de tripsina. Centrifugar las células a 200 x g durante 3,5 min para formar el pellet celular. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las células en medio RPE humano a una concentración final de 20.000 células por 100 μL por pocillo.Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para garantizar que la suspensión celular sea homogénea, utilizando una pipeta multicanal para facilitar y consistir el pipeteo en la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos. Apoye la punta de la pipeta justo debajo del borde circular en la parte superior del pocillo para obtener una capa celular uniforme y homogénea.NOTA: No se requiere recubrimiento ya que las células se adhieren bien a la microplaca. Asegúrese de dejar los cuatro pocillos de esquina vacíos de celdas (solo 100 μL de medios) para que sirvan como pozos de corrección de fondo (Figura 1A).NOTA: La microplaca está formateada en un diseño típico de placa de 96 pocillos; Sin embargo, el área de superficie de cada pozo es de 0,106 cm2, que es un 40% más pequeña que una placa estándar de 96 pocillos. En esta densidad celular, las células deben ser 100% confluentes al día siguiente. Se recomienda realizar un experimento de optimización de la densidad celular antes de probar los tratamientos para garantizar que las lecturas basales de OCR y ECAR sean de alrededor de 50-100 pmol / min y 10-20 mpH / min, respectivamente. Deje la placa de cultivo celular a temperatura ambiente (RT) durante 1 h antes de volver a colocarla en la incubadora (5%CO2, 37 °C, humidificada) para ayudar a minimizar los efectos de borde. Los efectos de borde son cambios en el volumen de medios en los pocillos de los bordes periféricos de la placa de 96 pocillos debido a la evaporación14.NOTA: Las células se adherirán durante la noche y formarán una monocapa confluente al día siguiente. Los H-RPE se maduran en la placa durante al menos 1 mes refrescando la mitad de los medios de crecimiento cada 2-3 días. Examine las células bajo el microscopio antes de cambiar los medios para verificar su morfología y nivel de pigmentación. Asegurar que las células sean confluentes con una morfología característica de adoquines y adquieran pigmentación con el tiempo, como se ve en las imágenes morfológicas de Shu et al.7. 2. El día antes de realizar el ensayo Asegúrese de que el cartucho sensor esté hidratado el día anterior al ensayo llenando cada pocillo de la placa de utilidad con 200 μL de agua desionizada.NOTA: La tapa de la placa de utilidad contiene biosensores fluorescentes para medir los niveles de oxígeno y pH para cada pozo. Los sensores están acoplados a guías de onda de fibra óptica que entregan luz en varias longitudes de onda de excitación y transmiten una señal fluorescente a través de filtros ópticos a los fotodetectores. Coloque el cartucho sensor sumergido en agua en la placa de utilidad junto con ~20 ml del calibrante (para calentar para usar al día siguiente) en un horno humidificado a 37 °C (sin CO2) durante la noche.NOTA: El calibrante es una solución patentada diseñada para la calibración de cartuchos de sensores y es probablemente similar en composición a la solución salina tamponada con fosfato (PBS). El tiempo mínimo para la hidratación del cartucho es de 4 h, pero los mejores resultados se obtienen con la hidratación nocturna. Asegúrese de que el instrumento esté encendido e inicie el software para permitir que el instrumento se estabilice a 37 °C durante la noche (Figura 2). Generalmente, el instrumento se puede dejar encendido incluso cuando no está en uso. 3. Prueba de esfuerzo Mito en tiempo real utilizando el analizador de flujo extracelular El día del ensayo, reemplace el agua de la placa de utilidad con un volumen igual de calibrante calentado al menos 45 minutos antes de ejecutar el ensayo. Haga el medio de ensayo Mito Stress Test utilizando el medio base sin rojo de fenol agregando suplementos, como se muestra en la Tabla 1. Caliente el medio a 37 °C, ajuste el pH a 7,4 y filtre al vacío el medio con una unidad de filtro superior de tubo. Para ejecutar una placa completa, haga ~ 25 ml de medios de ensayo. Retire el medio RPE humano y sustitúyalo por 180 μL de medios de ensayo recién preparados (paso 3.2). Colocar la placa de cultivo celular en un horno humidificado a 37 °C (sinCO2) durante 1 h antes de iniciar el ensayo.NOTA: Esto es importante para desgasificar la placa celular, permitiendo la difusión deCO2 . Dado que las células ya no están en sus medios de crecimiento y ya no en una incubadora conCO2, su viabilidad se deteriorará con el tiempo, por lo tanto, se debe tener cuidado de realizar el ensayo de la manera más eficiente posible. También se debe tener cuidado para asegurarse de que no haya burbujas en la placa de cultivo celular; Si hay alguno presente, hágalos estallar con una pipeta o aguja. Cada cartucho sensor tiene cuatro puertos de suministro de reactivo por pocillo para la inyección de compuestos de prueba en los pocillos de la placa de cultivo celular durante el ensayo (Figura 1C, D). Prepare ~ 3 ml de las soluciones de medicamentos 10x diluyendo las existencias de medicamentos en los medios de ensayo respectivos de acuerdo con la Tabla 2. Por ejemplo, cargue el puerto A con 25 μM de oligomicina disuelta en el medio de ensayo Mito Stress Test, de modo que cuando el instrumento inyecte el volumen del fármaco en el pozo, la concentración final a la que está expuesta cada célula sea de 2,5 μM. Pipetear 20 μL del stock de fármaco 10x en el puerto A, 22 μL en el puerto B, y 25 μL en el puerto C, para alcanzar la concentración final especificada del fármaco en cada pocillo. Para los protocolos que requieren los cuatro puertos de fármaco, pipetear 28 μL en el puerto D.NOTA: Consulte la Figura 1B al pipetear los medicamentos en los puertos de drogas para la orientación correcta de los puertos A/B/C/D. La muesca en el borde del cartucho debe ubicarse en la esquina inferior izquierda al cargar los puertos de drogas. Al pipetear en ángulo en cada puerto de drogas, las burbujas se pueden minimizar. Si hay burbujas presentes, se debe tener cuidado de hacerlas estallar con una pipeta o aguja. Abra la pestaña Plantillas en el software de análisis, seleccione Mito Stress Test y complete las Definiciones de grupo.Detalles de entrada sobre la estrategia de inyección (en este caso, se ingresa previamente como los medicamentos de prueba de esfuerzo de Mito). Detalles de entrada sobre los diferentes grupos experimentales en el ensayo (por ejemplo, Control o Tratamiento). Ingrese detalles en los medios de ensayo (adición de diferentes suplementos y sus concentraciones específicas a los medios de ensayo base) y finalmente agregue el tipo de célula. Haga clic en la siguiente pestaña, Mapa de placas, donde los diferentes grupos que se examinan se asignarán a su ubicación específica en el mapa de placas de 96 pocillos. Una vez hecho esto, haga clic en la pestaña Protocolo para revisar el protocolo del instrumento para el protocolo predeterminado de prueba de esfuerzo de Mito .NOTA: La plantilla predeterminada de prueba de esfuerzo de Mito está lista para usar, pero se puede modificar de cualquier manera para adaptarse al diseño experimental. Por ejemplo, el tiempo de medición predeterminado es de 3 minutos, pero esto se puede modificar a 5 minutos si se desea. Haga clic en Ejecutar el ensayo e inserte el cartucho del sensor que está sumergido en la solución calibrante en la placa de utilidad. Este proceso dura alrededor de 25 minutos. En este paso, cada biosensor se calibra de forma independiente en función de la salida del sensor medida en la solución calibrante de pH y concentración de oxígeno conocidos.Una vez que esté calibrado, retire la placa de utilidad e inserte la placa de cultivo celular.NOTA: La placa de cultivo celular se equilibra primero, después de lo cual, el instrumento comienza a mezclar los medios de ensayo y medir los valores de OCR y ECAR. Este paso dura alrededor de 1,5 h y se lleva a cabo dentro del instrumento sin ninguna intervención del usuario. Primero se establece una lectura de referencia de OCR y ECAR mezclando los medios de ensayo durante 3 min y luego midiendo OCR y ECAR durante 3 min. El instrumento realiza tres bucles de mezcla y medición. Después de la medición de referencia, el instrumento inyecta automáticamente la solución de fármaco del Puerto A en cada pocillo. Esto es seguido por tres bucles de mezcla y medición (3 minutos cada uno). El mismo patrón ocurre después de cada inyección de fármaco posterior (puertos B y C). Una vez completada la ejecución, retire la placa de cultivo celular y el cartucho del sensor. Para fines de control de calidad, asegúrese de que todos los puertos de medicamento en el cartucho del sensor se hayan inyectado examinando los puertos para verificar que no quede ningún medicamento residual. Deseche el cartucho del sensor y la placa de utilidad, ya que son artículos de un solo uso. Examine las células en la microplaca de cultivo celular bajo el microscopio para asegurarse de que todavía hay una monocapa confluente de células. Deseche el medio de ensayo y reemplácelo con 60 μL de tampón de lisis 1x en cada pocillo.NOTA: El tampón de lisis está hecho de tampón de lisis 10x diluido a 1x en agua desionizada con la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) de 1 mM. Envuelva los bordes de la placa en Parafilm para evitar la evaporación y colóquela en un congelador de -80 °C para ayudar en la lisis celular durante la noche, antes de cuantificar el contenido de proteína utilizando el ensayo BCA. Para el análisis de datos, normalice todos los datos dividiendo los valores de OCR y ECAR por el microgramo de proteína en cada pocillo. Exporte el generador de informes Mito Stress Test, que utiliza macros de Excel para calcular automáticamente los parámetros de Mito Stress Test utilizando el software de análisis de datos.NOTA: Esto se puede utilizar para determinar la respiración basal, la respiración máxima, la capacidad respiratoria de repuesto, la fuga de protones, la producción de ATP y la respiración no mitocondrial. Las definiciones de estos cálculos se enumeran en la Tabla 3. 4. Prueba de estrés glucolítico en tiempo real utilizando el analizador de flujo extracelular Realice la prueba de esfuerzo glucolítico siguiendo los mismos pasos que la prueba de esfuerzo de Mito, excepto utilizando los diferentes suplementos de medios de ensayo e inyecciones de medicamentos que se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2. Para el análisis de datos, exporte el generador de informes de prueba de esfuerzo glucolítico, que utiliza macros de Excel para calcular automáticamente los parámetros de la prueba de esfuerzo glucolítico desde el software de análisis de datos.NOTA: Esto se puede utilizar para determinar la acidificación no glucolítica, la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva glucolítica. Las definiciones de estos cálculos se enumeran en la Tabla 3. 5. Ensayo de cuantificación de proteínas BCA NOTA: El ensayo de cuantificación de proteínas de ácido bicinchónico (BCA) (también conocido como ensayoSmith 15) es un ensayo colorimétrico a base de cobre utilizado para determinar el contenido total de proteína en una muestra. La normalización de los datos de OCR y ECAR al microgramo de proteína en cada pocillo garantiza que las diferentes cantidades de células / proteínas en cada pocillo no sesguen las lecturas. El mecanismo del ensayo BCA se basa en dos reacciones químicas. En primer lugar, los enlaces peptídicos en las proteínas reducen los iones cúpricos (Cu2+) a iones cuprosos (Cu+), que es una reacción dependiente de la temperatura asistida por temperaturas más altas (37 a 60 °C). Si hay más enlaces peptídicos, la cantidad de Cu2+ es proporcional al contenido de proteína en la solución16. Esta reacción da como resultado un cambio de color de verde a una solución de color púrpura intenso, con una absorbancia máxima a 562 nm16. Cuanto mayor sea el contenido de proteína en la muestra, mayor será la absorbancia en esta longitud de onda. El rango de trabajo de este kit es de 20-2.000 μg/mL. El kit de ensayo de BCA contiene 1 ml de alícuotas de albúmina sérica bovina (BSA) a 2 mg/ml, que sirve como patrón de referencia de concentración de proteínas. Prepare una dilución en serie en una placa transparente de fondo plano de 96 pocillos comenzando con la BSA de 2 mg/ml sin diluir y posteriormente reduciendo a la mitad la concentración diluyendo en agua desionizada (por ejemplo, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 mg/ml, etc.). El uso de una concentración conocida de proteína permite el cálculo de una curva estándar, que se utiliza para calcular el contenido de proteína de las muestras experimentales. Para mejorar la precisión de las mediciones calculadas del contenido de proteínas, mida las lecturas de absorbancia de los estándares de referencia de concentración de proteínas junto con las muestras experimentales para cada ensayo. Pipetear 25 μL de cada dilución en serie BSA por duplicado en la placa de 96 pocillos. Pipetear 25 μL del tampón de lisis 1x por duplicado en la placa de 96 pocillos para que sirva como pieza en blanco. Descongele la placa de cultivo celular a temperatura ambiente y pipete 25 μL de cada lisado celular por duplicado en la placa de 96 pocillos. Prepare el reactivo de trabajo en una proporción de 50:1 de reactivos del kit BCA A:B. Mezcle bien con vórtice para eliminar cualquier turbidez en el reactivo de trabajo, de modo que sea una solución verde homogénea. Agregue 200 μL del reactivo de trabajo a cada pocillo. Proteger la placa de la luz cubriéndola con papel de aluminio e incubar en un horno a 37 °C durante 20 min. Mida la absorbancia a 562 nm en un lector de placas de 96 pocillos. Para el análisis de datos, promedie todos los valores duplicados. Reste los niveles de absorbancia en blanco determinados de los pozos amortiguadores de lisis 1x de las mediciones de todas las muestras. Determine la curva estándar trazando la absorbancia de cada patrón BSA a su concentración conocida en μg/ml. Utilice la ecuación lineal derivada de la curva estándar para determinar la concentración de proteínas de las muestras experimentales.

Representative Results

El instrumento mide simultáneamente OCR y ECAR para cada ejecución. Para la prueba de esfuerzo de Mito, los cálculos de parámetros se basan en lecturas de OCR (Figura 3A), mientras que para la prueba de esfuerzo glucolítico, los cálculos de parámetros se basan en lecturas ECAR (Figura 3B). La Figura 3 muestra gráficos representativos para la curva OCR de la prueba de esfuerzo de Mito a lo largo del tiempo (Figura 3C) y cálculos de parámetros en forma de gráficos de barras para H-RPE (Figura 3D). La prueba de esfuerzo glucolítico se representa como una curva ECAR a lo largo del tiempo (Figura 3E), y los cálculos de parámetros se muestran en gráficos de barras para H-RPE (Figura 3F). La respiración basal proporciona una comprensión de las demandas energéticas de las células en condiciones basales17. La primera inyección de fármaco, oligomicina (Oligo), es un inhibidor de la ATP sintasa y, por lo tanto, cualquier reducción de OCR después de la primera inyección del fármaco es una medida de la respiración ligada al ATP18. Cualquier respiración basal restante después de inyecciones posteriores del fármaco se considera una fuga de protones, ya que no está acoplada a la síntesis de ATP. El aumento de la fuga de protones puede indicar un aumento del desacoplamiento mitocondrial, que está regulado por proteínas de desacoplamiento que están fisiológicamente presentes, pero que también se han relacionado con patologías como la obesidad, el cáncer, la diabetes tipo 2 y las enfermedades cardiovasculares19. La segunda inyección es de un agente de desacoplamiento, como BAM15 o FCCP, para determinar el potencial respiratorio máximo de las mitocondrias. Los agentes de desacoplamiento colapsan el gradiente de protones y reducen la fuerza motriz del protón a través de la membrana interna mitocondrial. El resultado es un flujo desinhibido de electrones a través de la cadena de transporte de electrones (ETC), que eleva la tasa de consumo de oxígeno y hace que la respiración mitocondrial alcance su capacidad máxima20. La capacidad respiratoria sobrante (SRC) es la diferencia entre la respiración máxima y basal, lo que indica la capacidad de las células para responder a los cambios en las demandas energéticas cuando se desafía, lo que indica la aptitud celular. Es importante destacar que para la prueba de esfuerzo de Mito en H-RPE, BAM15 es superior a FCCP para mejorar la capacidad respiratoria mitocondrial (Figura 4A, B), ya que la respiración máxima y la capacidad respiratoria de repuesto son significativamente mayores con 10 μM BAM15 en comparación con 500 nM o 1 μM FCCP. No se observaron diferencias significativas entre ninguna de las dosis de FCCP. La tercera y última inyección de rotenona y antimicina A (Rot/AA) inhibe los complejos mitocondriales I y III, respectivamente, del CTE, que cierra la respiración mitocondrial; cualquier OCR residual se debe a fuentes no mitocondriales21. Durante la glucólisis, una molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de lactato en ausencia de oxígeno. La extrusión de lactato de la célula se acompaña del flujo de un protón por molécula de lactato, lo que provoca la acidificación del espacio extracelular. El flujo de producción de protones en los medios se mide por los cambios en ECAR. Primero se establecen los niveles de glucólisis basal, después de lo cual se inyecta glucosa en el medio de ensayo, que carece de glucosa, para inducir la glucólisis y así mejorar los niveles de ECAR22. La oligomicina se inyecta para inducir el ECAR “más alto”, ya que detiene la producción de ATP mitocondrial, lo que obliga a la célula a derivar su ATP a través de la glucólisis. Finalmente, la glucólisis se cierra agregando 2DG, que inhibe la hexoquinasa, la primera enzima de la glucólisis23. Cualquier ECAR restante es probablemente debido a otras fuentes de acidificación, como la producción deCO2 por el ciclo de TCA durante OXPHOS, y se denota como ECAR no glucolítico. La reserva glucolítica se calcula como la diferencia entre el ECAR “más alto” y el ECAR en presencia de glucosa. La capacidad glucolítica es la suma de la glucólisis y la reserva glucolítica. Figura 1: Componentes de la placa y cartucho del sensor . (A) Se muestran el instrumento, el software de análisis de datos y la interfaz de configuración del protocolo. En el diseño de la placa de cultivo de 96 pocillos, las celdas están chapadas en los pozos de color azul y los cuatro pozos de esquina están marcados en negro, ya que sirven como pozos de corrección posterior que contienen solo medios (y no células). (B) Hay cuatro puertos de drogas para cada pocillo del cartucho del sensor donde se pueden cargar las drogas A, B, C y D. Los volúmenes para pipetear en cada puerto se enumeran en función de los cálculos para preparaciones de stock de medicamentos 10x. (C) El cartucho del sensor consiste en sondas de sensor que se colocan directamente en la placa de utilidad llena de calibrante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Cronología del ensayo. Las células se siembran en la placa de cultivo celular. Una vez listo, el ensayo implica un procedimiento de 2 días seguido de la cuantificación del contenido de proteína utilizando el ensayo BCA y el posterior análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Gráficos representativos de la prueba de esfuerzo de Mito y la prueba de esfuerzo glucolítico. Los cálculos de (A) la prueba de esfuerzo de Mito y (B) los parámetros de la prueba de esfuerzo glucolítico se representan en el esquema. (C) Se muestran la curva representativa de consumo de oxígeno (OCR) y (D) los parámetros de la prueba de esfuerzo de Mito para H-RPE. (E) Se muestran la curva representativa de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y (F) los parámetros de la prueba de esfuerzo glucolítico para H-RPE. Las barras de error son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Comparación de BAM15 versus FCCP como agente de desacoplamiento. Prueba de esfuerzo de Mito en H-RPE comparando la eficacia de inducir la respiración máxima utilizando 10 μM BAM15, 500 nM FCCP o 1 μM FCCP, mostrando la curva (A) de tasa de consumo de oxígeno (OCR) y (B) parámetros de la prueba de esfuerzo de Mito. Las barras de error son medias ± SEM. **** p ≤ 0.0001; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Prueba Glucosa (mM) GlutaMax (mM) Piruvato de sodio (mM) HEPES (mM) Prueba de esfuerzo de Mito 25 2 1 1 Prueba de esfuerzo glucolítico Ninguno 0.5 Ninguno 1 Tabla 1: Concentración de suplementos añadidos a los medios de ensayo para las pruebas de esfuerzo de Mito y glucolítico.  Prueba Puerto A Puerto B Puerto C Prueba de esfuerzo de Mito Oligomicina 2.5 μM FCCP 500 nM O BAM15 10 μM Rotenona 2 μM Y Antimicina A 2 μM Prueba de esfuerzo glucolítico Glucosa 10 mM Oligomicina 2 μM 2-Desoxiglucosa 50 mM Tabla 2: Concentraciones de inyecciones de puerto de fármaco para las pruebas de esfuerzo de Mito y glucolítico. Es importante tener en cuenta que estas son las concentraciones finales a las que están expuestas las células después de la inyección de los medicamentos en cada pocillo. Los medicamentos deben prepararse 10 veces más fuertes al cargar los puertos de medicamentos. Término Definición Calibrante El calibrante es una solución que se utiliza para calibrar el cartucho del sensor. Su formulación es patentada y tiene una composición similar a PBS. Cartucho sensor El cartucho del sensor contiene dos fluoróforos incrustados en el manguito del cartucho del sensor que están conectados a haces de fibra óptica que emiten luz, excitando los fluoróforos. Un fluoróforo mide el flujo de oxígeno y el otro mide el flujo de protones. Cada cartucho sensor también está equipado con 4 puertos para permitir la administración secuencial de hasta 4 compuestos por pocillo durante el ensayo. Placa de utilidad La placa de utilidad (también conocida como placa calibrante) se utiliza para calibrar los sensores. La solución Calibrant se coloca en la placa de utilidad. Prueba de esfuerzo de Mito La prueba de esfuerzo de Mito es el nombre del ensayo que proporciona el perfil bioenergético de la respiración mitocondrial al trazar los cambios en el OCR a lo largo del tiempo. Prueba de esfuerzo glucolítico La prueba de esfuerzo glucolítico es el nombre del ensayo que proporciona el perfil bioenergético glucolítico al trazar los cambios en ECAR a lo largo del tiempo. Tasa de consumo de oxígeno (OCR) La tasa de consumo de oxígeno es una medida del flujo de oxígeno (pmol/min) e indica el estado metabólico mitocondrial. Tasa de acidificación extracelular (ECAR) La tasa de acidificación extracelular es una medida del eflujo de protones (mpH/min) e indica el estado metabólico glucolítico. Wave Software El software Wave se utiliza para la programación del ensayo y el posterior análisis de datos Consumo de oxígeno no mitocondrial Medición de la velocidad mínima después de la inyección de rotenona/antimicina A Respiración basal (Última medición de la velocidad antes de la primera inyección) – (Tasa de respiración no mitocondrial) Respiración máxima (Medición de la frecuencia máxima después de la inyección de FCCP) – (Respiración no mitocondrial) Fuga H+ (protón) (Medición de la tasa mínima después de la inyección de oligomicina) – (Respiración no mitocondrial Producción de ATP (Última medición de velocidad antes de la inyección de oligomicina) – (Medición de velocidad mínima después de la inyección de oligomicina) Capacidad respiratoria sobrante (Respiración máxima) – (Respiración basal) Capacidad respiratoria sobrante como % (Respiración máxima) / (Respiración basal) × 100 Eficiencia de acoplamiento Tasa de producción de ATP) / (Tasa de respiración basal) × 100 Glucólisis (Medición de la velocidad máxima antes de la inyección de oligomicina) – (Última medición de la velocidad antes de la inyección de glucosa) Capacidad glucolítica (Medición de la velocidad máxima después de la inyección de oligomicina) – (Última medición de la velocidad antes de la inyección de glucosa) Reserva glucolítica (Capacidad glucolítica) – (Glucólisis) Reserva glucolítica como % (Tasa de capacidad glucolítica) /(Glucólisis) × 100 Acidificación no glucolítica Última medición de velocidad antes de la inyección de glucosa Tabla 3: Lista de definiciones de componentes clave del ensayo.

Discussion

Este protocolo optimizado para la respirometría de alta resolución de H-RPE implica el uso de BAM15 como desacoplador en lugar del FCCP comúnmente utilizado. Mientras que los estudios previos sobre respirometría de alta resolución del EPR utilizaron FCCP 9,24, BAM15 parece inducir una inducción más robusta de los niveles máximos de respiración en H-RPE en comparación con FCCP. Si bien tanto FCCP como BAM15 son seguros de usar en células, se informa que BAM15 tiene menos efectos secundarios en células normales en comparación con FCCP o carbonilcianuro-3-clorofenilhidrazona (CCCP)25. Kenwood et al. demostraron que BAM15 despolariza las mitocondrias sin afectar el potencial de la membrana plasmática, induciendo así una tasa de respiración mitocondrial máxima sostenida con baja citotoxicidad26. El FCCP, por otro lado, despolariza tanto las mitocondrias como la membrana plasmática y muestra mayor citotoxicidad26.

Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluida la garantía de que las células estén correctamente chapadas en una monocapa confluente, uniforme y homogénea de RPE en todos los pocillos experimentales de la microplaca. Los EPR maduros dependen en gran medida de OXPHOS para la generación de energía y, por lo tanto, se debe permitir que las células maduren durante al menos 1 mes para garantizar que el EPR genere lecturas adecuadas de OCR basales y máximas durante el ensayo. La desgasificación de la placa de cultivo celular durante 1 h a 37 °C en un horno humidificado (sin CO2) antes de colocarla en el instrumento es crucial para obtener lecturas ECAR precisas, ya que elCO2 puede afectar el pH de los medios de ensayo. Es importante recordar hidratar el cartucho del sensor el día antes del ensayo para asegurarse de que proporciona lecturas fiables de OCR y ECAR el día del ensayo. Se debe tener cuidado de reconstituir adecuadamente los medicamentos que se inyectarán y alícuota las existencias de medicamentos reconstituidos en volúmenes más pequeños para su almacenamiento a largo plazo a fin de minimizar los ciclos de congelación / descongelación. Es fundamental preparar 10 veces las soluciones farmacológicas que se diluyen en los medios de ensayo respectivos (por ejemplo, diluir en los medios de ensayo de prueba de esfuerzo de Mito para la prueba de esfuerzo de Mito) para tener en cuenta la dilución de la inyección del fármaco en cada pocillo lleno de medios de ensayo. Con cada inyección de fármaco posterior hay más medios en cada pocillo y, por lo tanto, los volúmenes de fármaco que se cargan aumentan con cada inyección, y se debe tener cuidado de seguir los volúmenes especificados en el protocolo. Es importante realizar controles de calidad al finalizar el experimento examinando el cartucho sensor para asegurarse de que no hay fármaco residual evidente y observando la placa de cultivo celular bajo un microscopio para garantizar que la monocapa celular confluente y homogénea permanezca.

Las modificaciones a este protocolo incluyen inyectar diferentes drogas en los puertos y determinar cómo estas drogas afectan las lecturas de OCR y ECAR. Una modificación popular es inyectar un medicamento experimental de elección como Puerto A antes de inyectar los medicamentos habituales Mito o Prueba de Esfuerzo Glucolítico. Este tipo de protocolo proporciona información sobre cómo una inyección aguda del fármaco de elección afecta el OXPHOS posterior y los parámetros glucolíticos. Otras modificaciones incluyen el examen de diferentes tipos de células; esto requiere la resolución inicial de problemas de la densidad óptima de células de siembra y la optimización de los medios de ensayo asegurando que las lecturas basales oscilen entre 50-100 pmol/min para OCR y 10-20 mpH/min para ECAR. Las concentraciones óptimas de los fármacos inyectados deben determinarse para cada nuevo tipo de célula examinado observando las respuestas OCR y ECAR a una dilución en serie de los fármacos.

Una limitación clave del protocolo es que la viabilidad celular disminuye con el tiempo, ya que las células no están en una incubadora deCO2 en sus medios de crecimiento normales y, por lo tanto, el ensayo debe completarse dentro de las 3-4 h para garantizar la máxima viabilidad celular. Además, la exposición a toxinas mitocondriales inyectadas en cada pocillo puede disminuir aún más la viabilidad celular con el tiempo. Una vez que se completa el ensayo, las células deben ser lisadas para la evaluación del contenido de proteína para normalizar las lecturas de OCR y ECAR, y por lo tanto las mismas células no pueden ser cosechadas para ensayos posteriores de biología molecular.

Las alternativas al caballito de mar para el perfil bioenergético incluyen el Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 y Resipher (Lucid Scientific)7. El Oroboros O2k es un respirómetro cerrado de dos cámaras que utiliza electrodos polarográficos de oxígeno tipo Clark S1. Mientras que el Oroboros O2k produce mediciones altamente sensibles del flujo metabólico en tiempo real, el dispositivo requiere mucha mano de obra ya que el operador debe inyectar manualmente cada medicamento30. El BaroFuse es un novedoso sistema de perfusión microfluídica multicanal que utiliza la presión del gas para permitir múltiples experimentos de perfusión paralela y está vinculado a un sistema de detección de oxígeno para medir OCR. La ventaja de este sistema de cultivo de flujo es que se mantiene la función y viabilidad del tejido, a diferencia del caballito de mar, donde la viabilidad celular disminuye en ensayos más largos. El Resipher utiliza sensores ópticos de oxígeno altamente sensibles para medir OCR mientras las células están en una placa de 96 pocillos en la incubadora, lo que permite mediciones continuas de OCR durante varias semanas o meses. En particular, estos instrumentos no miden ECAR, y por lo tanto el Seahorse tiene la ventaja de la exploración simultánea de OXPHOS y glucólisis.

Interrogar los perfiles bioenergéticos en tiempo real de OXPHOS y glucólisis está emergiendo como un factor clave en la caracterización de la salud y función del EPR. La respirometría de alta resolución permite un medio eficiente para comparar el estado metabólico del EPR normal y enfermo, abriendo así nuevas vías de detección de la eficacia de los fármacos para enfermedades de la retina como la DMAE y la RVP. Las direcciones futuras para la respirometría de alta resolución en RPE incluyen la optimización de un protocolo para examinar perfiles bioenergéticos para monocapas de RPE altamente polarizadas cultivadas en filtros transwell. Calton et al. (2016) lograron esto con éxito cortando una sección triangular de la monocapa de EPR polarizada cultivada en filtros transwell31. La ampliación adicional de la metodología incluye el examen de los perfiles bioenergéticos del EPR derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-RPE), aislados de pacientes con diferentes condiciones degenerativas de la retina32. La exploración de cómo las citoquinas patógenas involucradas en la DMAE y la RVP afectan la naturaleza dinámica del metabolismo del EPR puede revelar vulnerabilidades metabólicas que pueden informar la identificación de nuevos objetivos farmacológicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones de: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); Programa de becas postdoctorales de la Fundación BrightFocus en investigación de la degeneración macular (M2021010F, D.Y.S.); Departamento de Defensa, Programa de Investigación de la Visión Espinal bajo el Premio no. VR180132 (MS-G. y L.A.K.); Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio No. R01EY027739 (L.A.K.). Se agradece a los donantes de la Macular Degeneration Research M2021010F, un programa de la Fundación BrightFocus, por apoyar esta investigación. Los esquemas se crearon con Biorender.com

Materials

2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S  Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay
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References

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Fitch, T. C., Frank, S. I., Li, Y. K., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (192), e64572, doi:10.3791/64572 (2023).
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