Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Tüm fare deneyleri, Tokyo Üniversitesi (onay numarası PA17-63) ve Osaka Üniversitesi (onay numarası Biken-AP-H30-01) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve kılavuzlarına ve ARRIVE kılavuzlarına (https://arriveguidelines.org) göre gerçekleştirilmiştir. 1. Vektör yapısını hedefleme Bir KI kasetini (CreERT burada, PCR için şablon DNA orijinal olarak ticari bir gen sentez şirketindendir) ve PCR ile 5 ‘veya 3′ homoloji kollarının yaklaşık 1 kb’lik bir parçasını yükseltin. DNA klonlaması için (adım 1.3), her PCR primerinin 5′ ucuna 15-mer örtüşme dizileri ekleyin. PCR DNA fragmanlarını agaroz jel elektroforezi ile saflaştırın, ardından bir DNA saflaştırma kiti kullanarak DNA fragmanının ekstraksiyonunu yapın. Klonlama için çoklu klonlama bölgesinde bir yerde benzersiz bir şekilde sindirilen uygun bir kısıtlama enzimi (leri) kullanarak omurga plazmidini (örneğin, pUC19 veya pBS) doğrusallaştırın. Ardından, sindirilmiş plazmidi bir DNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Her PCR fragmanını (örneğin, 5′-homoloji kolu, 3’-homoloji kolu) ve KI dizisini, üreticinin talimatlarına göre bir DNA klonlama kiti kullanarak sindirilmiş plazmidin içine aynı anda klonlayın. Yetkin hücreleri, bir su banyosunda 1 dakika boyunca 42 ° C’de ısıtarak inşa edilmiş plazmidi (adım 1.3) kullanarak dönüştürün, ardından ampisilin veya kanamisin gibi uygun antibiyotik konsantrasyonunu içeren bir LB plakasına tohumlayın. Dirençli klon seçimleri için onları gece boyunca kültürleyin. 200 μL pipet ucu kullanarak birkaç (dört ila sekiz) ayrı koloni toplayın ve uçları uygun antibiyotikler (100 μg / mL ampisilin veya 20 μL / mL kanamisin) içeren 3 mL sıvı LB içine ve gece boyunca 37 ° C’de sallama ile kültüre aktarın. Plazmidi ertesi gün üreticinin talimatlarına göre endotoksin içermeyen dereceli ticari plazmid saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Plazmiddeki klonlanmış diziyi Sanger dizilimi ile onaylayın. Plazmid konsantrasyonunu nükleaz içermeyen su kullanarak 1 μg DNA / μL’de ayarlayın. Plazmidi gen hedefleme vektörü olarak kullanın. 2. ESC için besleyici hücreler olarak fare embriyonik fibroblastının (MEF) hazırlanması 8-10 haftalık hamile ICR dişi fareleri (14.5 gün postkoitum) servikal çıkık ile feda edin. Sterilizasyon için% 70 (v / v) etanol kullanarak karnı iyice silin, orbital makas ve forseps kullanarak karnı kesin ve fetüs içeren uterusu kurtarın. Rahimi, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren 10 mL fosfat sığır serumu (PBS) içeren 100 mm’lik bir kaba koyun. Plasentaları ve ekstraembriyonik dokuları orbital makas ve forseps kullanarak fetüslerden çıkarın. Orbital makas kullanarak fetüsleri kıyın ve kıyılmış fetal hücreleri içeren PBS çözeltisini 50 mL’lik konik bir tüpe aktarın. 4 °C’de 5 dakika boyunca 280 x g’de santrifüj yapın ve süpernatantı aspirasyonla atın. 10 mL% 0.25 (w / v) tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin, pipetleme ile iyice karıştırın ve daha sonra tripsin sindirimi için bir su banyosu kullanarak 37 ° C’de 10 dakika boyunca inkübe edin. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 20 mL MEF ortamı (% 10 (v / v) fetal sığır serumu, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren DMEM) ekleyin, nazik inversiyonla iyice karıştırın ve 4 ° C’de 5 dakika boyunca 280 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspirasyonla atın, 10 mL MEF ortamı ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Hücre süspansiyonunu birkaç yeni 100 mm’lik tabakta tohumlayın (100 mm’lik bir tabak için 10 mL MEF ortamına sahip fetüs sayısıyla aynı sayıda yemek hazırlayın). Bağlanmamış hücreleri çıkarmak ve bağlı MEF’in büyümesine izin vermek için tohumlama sonrası ortamı 4 ila 5 saat arasında değiştirin. Tripsin kullanarak ~% 80 akıcılığa ulaştıklarında hücreleri geçirin. Çoğalan MEF’i içeren kültür kaplarını, tohumlamadan yaklaşık 12-15 gün sonra, bir X-ışını ışınlama cihazında MEF ortamına yerleştirin. Üreticinin talimatına göre hücre döngüsünü durdurmak için MEF’i 50 Gy X-ışını (toplam) ile maruz bırakın. 37 ° C’de 5 dakika boyunca 100 mm’lik bir çanak için 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek ışınlanmış MEF’i tripsinize edin, ardından tripsin sindirimini durdurmak için 4 mL MEF ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu yeni bir 50 mL tüpte toplayın. MEF’i 4 ° C’de 5 dakika boyunca 280 x g’de santrifüjleme yaparak taze bir MEF ortamı ile yıkayın, tripan mavisi boyamalı bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve bunları hücre dondurucu bir ortamda 1,6 x 106 hücre / tüpte dondurun. Kullanıma kadar saklayın; hücreler birkaç yıl boyunca sıvı azotta stabil bir şekilde depolanabilir. 3. Cas9-RNP-DNA karışımı hazırlama TracrRNA ve crisprRNA’yı seyreltme tamponunda (her RNA konsantrasyonu 200 μM’de) pipetleme ile çözün. TracrRNA çözeltisini, crisprRNA çözeltisini ve seyreltme tamponunu (2: 2: 5’te hacim oranı), 10 dakika boyunca 95 ° C’de bir termal döngü kullanarak her RNA’yı hafifçe vurarak ve tavlayarak ve ardından sıcaklık 4 ° C’ye ulaşana kadar 1 ° C / dak basma döngüleri ile karıştırın.NOT: gRNA dizisi CRISPOR, http://crispor.tefor.net kullanılarak tasarlanmıştır. Cas9-RNP kompleksini oluşturmak için tavlanmış RNA’ları, 10 μg / μL Cas9 nükleazını ve elektroporasyon tamponunu 20 dakika boyunca 37 ° C’de 5: 3: 2 hacim oranında karıştırılarak inkübe edin. Rutin çalışmalarda, bir lokus genom düzenlemesi için 1.25 μL tavlanmış RNA, 0.75 μL Cas9 nükleaz ve elektroporasyon tamponunun 0.5 μL’sini karıştırın ve inkübe edin. Aşağıdaki malzemeleri 1,5 mL’lik bir tüpte karıştırın: 10 μL elektroporasyon tamponu, 1 μL Cas9-RNP kompleksi (adım 3.2) ve 1 μL dairesel hedefleme vektörü (1 μg / μL, adım 1.6). Cas9-RNP-DNA karışımının toplam miktarı 12 μL’dir. Cas9-RNP-DNA karışımını elektroporasyona kadar buz üzerinde tutun.NOT: KI’dan sonra gRNA’nın yeniden bölünmesini önlemek için, gRNA’yı, gRNA tanıma dizisinin KI donörünün entegrasyonu ile bölündüğü bir konumda tasarlayın. Eğer gRNA böyle bir yerde tasarlanamazsa, amino asit dizisinin değişmediği birkaç nükleotid sessiz mutasyon, KI donörünün plazmidine dahil edilir. 4. ESC’lerin gen hedeflemesi Jelatin kaplı hücre kültürü kaplarını hazırlamak için, 60 mm’lik bir tabak için 2 mL’de% 0.1 (w / v) jelatin çözeltisi, 24 delikli bir tabak için 500 μL, 96 delikli bir plaka için 100 μL ekleyin ve nemli bir inkübatörde 2 saat boyunca inkübe edin. Jelatin çözeltisini çıkarın, aynı miktarda PBS ile iki kez yıkayın ve kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın. 1 dakika boyunca 37 ° C’lik bir su banyosu kullanarak mitotik olarak inaktive edilmiş dondurulmuş MEF stoğunu (adım 2.2) çözün ve MEF’i ESC tohumlamasından 1 gün önce jelatin kaplı 60 mm’lik bir tabağa (iki 60 mm tabak için 1.6 x 106 hücre içeren bir dondurulmuş MEF stok tüpü, adım 2.2) yerleştirin. Dondurulmuş bir ESC stok tüpünü (2 x 10 5 ESC / tüpte saklanır; hücre sayımı bir hücre sayacı kullanılarak gerçekleştirildi) 1 dakika boyunca 37 ° C’lik bir su banyosu kullanarak çözün ve önceden tohumlanmış MEF içeren 60 mm’lik bir kaba 1 x 105 ESC yerleştirin (adım 4.1). 4 mL ESC kültür ortamında kültür (ESCM, (v/v) fetal sığır serumu ile DMEM bazlı modifiye ortam, 2 mM L-glutamin substratı, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 0.1 mM 2-merkaptoetanol, lösemi inhibitör faktör ve t2i (0.2 μM PD0325901 ve 3 μM CHIR99021) ile ESC11’in pluripotensini koruyan 37 °C’de %5 CO2 ile ESC ila yakınlığa ulaşana kadar.NOT: Üç farklı ESC hattı kullanıyoruz: JM8. B6N’den A3, B6-129 F1’den V6.5 ve şirket içinde BALB/c ESC geliştirildi. Bu makaledeki aynı KI protokolleri tüm ESC hatları için kullanılmaktadır. Kültür ESC’sini 4 mL PBS ile yıkayın, ardından sindirim için 37 ° C’de 5 dakika boyunca 800 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile muamele edin. Tripsini inaktive etmek için 1 mL ESCM ekleyin ve pipetleme ile ESC’leri tek hücrelere ayırın. ESC içeren çözeltiyi 280 x g’de 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın, ESC’leri taze 1 mL ESCM’de yeniden askıya alın ve tripan mavisi boyamalı bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. 1 x 10 5 ESC’yi yeni bir1,5 mL tüpe aktarın ve 500 x g, 4 °C’de santrifüjleme yoluyla PBS ile üç kez yıkayın. ESC peletini 12 μL Cas9-RNP-DNA karışımında (adım 3.3) yeniden askıya alın ve köpürmeyi önlemek için nazik pipetleme ile iyice karıştırın. Elektroporasyon için yeniden askıya alınmış ESC’yi servis edin. Elektroporasyon sistemi, Cas9-RNP-DNA transdüksiyonu için 1.400 V ve 30 ms’de tek bir darbe kullanır (Şekil 1). Elektroporated ESC’leri, mitotik olarak inaktive edilmiş MEF ile 4 mL ESCM içeren 60 mm’lik bir kapta kültürleyin (bölüm 4.2). Ortamı her gün değiştirin. ESC’leri elektroporasyondan 3 ila 5 gün sonra 4 mL PBS ile yıkayın, ardından sindirim için nemli bir inkübatörde 5 dakika boyunca 37 ° C’de 800 μL% 0.25 tripsin-EDTA ve kültür ile muamele edin. Tripsin sindirimini durdurmak için 2 mL ESCM ekleyin ve hücre karışımını 5 dakika boyunca 280 x g’de santrifüj edin. Süper natantı atın, ESC’leri 1 mL taze ESCM’de yeniden askıya alın ve tripan mavisi boyamalı bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu sayın. ESC’leri, ESCM ve besleyici MEF içeren 60 mm’lik çanak başına 1 x 103 ESC’de geçirin. Koloni toplanana kadar ortamı her gün değiştirin.NOT: ESC’nin toplanmadan önce bir kez geçmesinin nedeni, genom düzenlemesinin ESC bölünmesinden sonra gerçekleşmeye devam edebilmesiydi, bu nedenle ilk koloni birçok durumda her zaman klon değildir. Bu nedenle, koloni toplamadan önce ESC’nin ilk geçişi, tek klonları almak için önemli bir adımdır. 5. Hedeflenen ESC’lerin PCR genotiplemesi ESC kültür kabından ESCM’yi ilk geçişten 5 ila 7 gün sonra aspire edin (adım 4.9) ve 4 mL PBS ekleyin. Stereomikroskop altında 20 μL’lik pipet kullanarak 5 μL PBS’li tek ESC kolonilerini toplayın (30x ila 40x büyütme). Bireysel kolonileri, 15 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi içeren yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. 96 kuyucuklu plakayı, 48 ayrı koloni toplanana kadar buz üzerinde tutun. 96 delikli plakayı 37 °C nemli% 5 CO2 inkübatöründe 5 dakika boyunca inkübe edin, ardından tripsin sindirimini durdurmak ve ESC kolonilerini pipetleme yoluyla tek hücrelere ayırmak için 80 μL ESCM ekleyin.NOT: Bu yöntemin KI verimliliği genellikle% 10 -% 50 olduğundan, rutin olarak 48 klon alırız ve önce 24’ünü kullanarak genotipleme yaparız. Bu noktada birden fazla KI klonu elde edilemezse, kalan 24 klonu kullanarak KI’yı daha fazla tararız. PCR genotiplemesi için kuyucuk başına 50 μL ESCM içeren jelatin kaplı besleyici içermeyen 96 delikli bir plakaya 40 μL ESC süspansiyonunu (adım 5) aktarın. Dondurulmuş ESC stoğunu yapmak için kalan 60 μL ESC süspansiyonunu, 500 μL ESCM ve besleyici MEF içeren jelatin kaplı 24 delikli bir plakadaki bir kuyuya aktarın. 24 delikli plakada (adım 5.3) kültürlenmiş bireysel ESC klonlarını% 60 ila% 80 akıcılığa ulaşana kadar stoklayın. Yukarıda belirtildiği gibi tripsinizasyon ile bireysel ESC klonlarını kurtarın, hücreleri yeni bir 1.5 mL tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 280 x g’de santrifüj yapın. Süper natantı atın, hücreleri 500 μL hücre dondurma ortamında yeniden askıya alın ve -80 ° C derin dondurucu kullanarak dondurun. PCR genotiplemesi için, kültür ESC, ESC% 90’dan fazla akıcıya ulaşana kadar 96 kuyucuklu besleyicisiz plakada (adım 5.3) klonlanır. ESCM’yi her bir kuyucuktan aspirasyonla çıkarın ve 100 μL PBS ile iki kez yıkayın. PBS’yi aspire edin ve proteinaz K içeren 100 μL lizis tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve ESC lizatını yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. ESC lizatını 65 °C’de bir ısı odası kullanarak en az 1 saat ısıtın. Geleneksel bir fenol-kloroform DNA saflaştırma yöntemi ve ardından etanol çökeltmesi kullanarak genomik DNA’yı çıkarın ve saflaştırın. Çökeltilmiş DNA’yı 20 μL DNaz içermeyen suda çözün ve bir spektrofotometre kullanarak DNA’nın saflığını ve konsantrasyonunu belirleyin. Hedef bölgeyi yükseltmek için lokusa özgü primer setleri kullanarak genomik PCR gerçekleştirin. Ardından, diziyi kontrol edin ve istediğiniz KI dizilerine sahip ESC klonlarını seçin. 6. Sekiz hücreli aşama embriyonun hazırlanması ve ESC’lerin mikroenjeksiyonu Yetişkin ICR kadınlarına intraperitoneal olarak 5 IU hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) enjekte edin. 48 saat sonra, aynı dişilere 5 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte edin, ardından hormonla tedavi edilen kadınları ICR erkekleriyle eşleştirin. Ertesi gün vajinadaki çiftleşme tıkacını kontrol edin (embriyonik gün 0.5, ED0.5).NOT: Kimerizmi kat renk oranlarına göre değerlendirmek için, siyah veya agouti kaplama rengi arka planına sahip bir ESC için alıcı olarak ICR suşundan blastosist veya albino arka plana sahip bir ESC için alıcı olarak C57BL / 6 suşundan blastosist kullanın. Yumurta kanalını ED1.5’te toplayın ve HEPES tamponlu orta (FHM) damlalarına yerleştirin. İki hücreli veya dört hücreli aşama embriyolarını, infundibuluma yerleştirilen bir yıkama iğnesi kullanarak yumurta kanalını FHM ile yıkayarak geri kazanın. Toplanan embriyoları bir ağız pipeti kullanarak birkaç taze FHM damlasına taşıyarak yıkayın. 50 μL KSOM’daki embriyoları, 37 ° C’de mineral yağ ile kaplı 35 mm’lik bir hücre kültürü kabına, sekiz hücreli veya morula aşamasına (ED2.5 ) ulaşılana kadar 1 gün boyunca% 5 CO 2 inkübatöre bırakın. Embriyolar bir sonraki toplama gününde kullanılmazsa, CARD protokolüne (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) göre vitrifikasyon yoluyla dondurun ve kullanıma kadar sıvı azotta saklayın. Bir çektirme ve mikroforge kullanarak embriyoları (80-100 μm dış çap) ve ESC enjeksiyonunu (yaklaşık 13 μm çapında) tutmak için cam pipetler hazırlayın. FHM içeren bir tutma pipetini, mikromanipülatörün sol tarafına monte edilmiş ve bir mikroenjektöre bağlı kılcal tutucuya entegre edin. Bir enjeksiyon pipetini başka bir mikro enjektöre bağlayın ve sağ tarafa yerleştirin. İki pipeti mikroskop görüş alanında düz bir şekilde hizalayın. FHM ortamında (w/v) polivinilpirolidon (PVP) ve 5 μL FHM damla 5 μL damlayı 60 mm’lik bir kabın aynı kapağına yan yana dağıtın ve damlaları mineral yağ ile örtün. Embriyoları 5 μL FHM damlasına aktarın ve embriyo içeren FHM damlasına ESC süspansiyonunun 1-5 μL’sini ekleyin.NOT: Damla hazırlığından önce ESC ve MEF süspansiyonunu 60 mm kültür kabındaki 4 mL ESM’de 30 dakika bekletin. MEF’ler tabana ESC’lerden daha hızlı yapıştığından, bu 30 dakikalık inkübasyon, süpernatanttaki bağlanmamış ES hücrelerinin konsantrasyonuna izin verir. Enjeksiyon pipetinin içini PVP ile yıkayın, ardından embriyoları ve ESC’leri içeren damlaya geçin. Enjeksiyon pipetinde hücre bölünmesini (altı hücre) yeni bitirmiş üç ayrı ECS çiftini alın. Sıkıştırmayı tamamlamış sekiz hücreli veya morula evreli bir embriyoyu, tutma pipeti ile aspirasyonla tutun. Piezoelektrik darbeli zona pellucida’da bir delik açın (yoğunluk: 3; hız: 3). Zona pellucida’nın içindeki altı hücreli ESC’yi dışarı atın ve pipeti embriyolardan çekin. ESC enjekte edilen embriyoları bir ağız pipeti kullanarak birkaç KSOM damlası ile hafifçe yıkayın ve embriyolar blastosist aşamasına gelene kadar% 5 CO2 olan 37 ° C’de mineral yağ ile kaplı yeni bir 50 μL KSOM damlasında inkübe edin. ESC enjekte edilen 10 blastosisti, psödohamile dişi farelerin her bir uterus boynuzuna aktarın (2.5 gün postkoitum, kafa başına 20 blastosist). Taşıyıcı anne doğum yaptıktan sonra, en yüksek kimerizm oranına sahip en az iki erkek kimera seçin (ceket rengiyle doğrulandığı gibi% 70 veya daha yüksek) ve ardından F1 heterozigot KI elde etmek için uygun suş dişileriyle çiftleşin. İstenilen genotip (ler) e veya araştırmaya uygun genetik geçmişlere sahip fareler elde etmek için bireysel KI farelerini uygun ortaklarla yetiştirin.