CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Alle muisexperimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Tokio (goedkeuringsnummer PA17-63) en Osaka University (goedkeuringsnummer Biken-AP-H30-01) en uitgevoerd volgens hun richtlijnen en de ARRIVE-richtlijnen (https://arriveguidelines.org). 1. Vectorconstructie richten Amplify een KI-cassette (CreERT hier, sjabloon-DNA voor de PCR is oorspronkelijk van een commercieel gensynthesebedrijf) en een ongeveer 1 kb fragment van 5′- of 3′-homologiearmen door PCR. Voeg voor DNA-klonen (stap 1.3) 15-mer overlapsequenties toe aan het 5′-uiteinde van elke PCR-primer. Zuiver de PCR DNA-fragmenten door agarose gel-elektroforese, gevolgd door extractie van het DNA-fragment met behulp van een DNA-zuiveringskit. Lineariseer het backbone plasmide (bijv. pUC19 of pBS) met behulp van een geschikt restrictie-enzym (en) dat op unieke wijze ergens op de multi-kloonplaats verteert voor klonen. Zuiver vervolgens het verteerde plasmide met behulp van een DNA-zuiveringskit. Kloon elk PCR-fragment (bijv. 5′-homologiearm, 3′-homologiearm) en KI-sequentie tegelijkertijd in het verteerde plasmide met behulp van een DNA-kloonkit volgens de instructies van de fabrikant. Transformeer de competente cellen met behulp van het geconstrueerde plasmide (stap 1.3) door gedurende 1 minuut in een waterbad op 42 °C te verwarmen en zaai ze vervolgens op een LB-plaat met de juiste concentratie antibiotica zoals ampicilline of kanamycine. Kweek ze ‘s nachts voor resistente kloonselecties. Pak verschillende (vier tot acht) individuele kolonies op met behulp van 200 μL pipetpunten en breng de tips over in 3 ml vloeibare LB met geschikte antibiotica (100 μg / ml ampicilline of 20 μL / ml kanamycine) en kweek ‘s nachts bij 37 ° C met schudden. Zuiver het plasmide de volgende dag met behulp van een endotoxinevrije commerciële plasmidezuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Bevestig de gekloonde sequentie in het plasmide door Sanger-sequencing. Stel de plasmideconcentratie in op 1 μg DNA/μL met nucleasevrij water. Gebruik het plasmide als de gen-targeting vector. 2. Bereiding van de embryonale fibroblast (MEF) van de muis als feedercellen voor ESC Offer 8-10 weken oude zwangere ICR vrouwelijke muizen (14,5 dagen postcoitum) door cervicale dislocatie. Veeg de buik goed af met 70% (v / v) ethanol voor sterilisatie, knip de buik door met een orbitale schaar en tang en herstel de foetusbevattende baarmoeder. Plaats de baarmoeder in een schaal van 100 mm met 10 ml fosfaatrunderenserum (PBS) met 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine. Verwijder de placenta’s en extra-embryonale weefsels van de foetussen met behulp van een orbitale schaar en tang. Gehakt de foetussen met behulp van een orbitale schaar en breng de PBS-oplossing met de gehakte foetale cellen over naar een conische buis van 50 ml. Centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant door aspiratie weg. Voeg 10 ml trypsine-EDTA-oplossing van 0,25% (w/v) toe, meng goed door te pipetteren en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 37 °C met behulp van een waterbad voor trypsinevertering. Voeg 20 ml MEF-medium (DMEM met 10% (v/v) foetaal runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) toe om de enzymatische reactie te stoppen, meng goed door zachte inversie en centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door aspiratie, voeg 10 ml MEF-medium toe en meng goed door te pipetteren. Zaai de celsuspensie in verschillende nieuwe 100 mm-gerechten (bereid hetzelfde aantal gerechten als het aantal foetussen met 10 ml MEF-medium voor één schaal van 100 mm). Verander het medium 4 tot 5 uur na het zaaien om niet-vastgemaakte cellen te verwijderen en laat de bijgevoegde MEF groeien. Passeer de cellen wanneer ze ~ 80% samenvloeiing bereiken met behulp van trypsine. Plaats de kweekschalen met de woekerende MEF in MEF-medium, ongeveer 12-15 dagen na het zaaien, in een röntgenbestralingsapparaat. Stel de MEF bloot met een röntgenfoto van 50 Gy (totaal) om de celcyclus te stoppen volgens de instructies van de fabrikant. Trypsinize de bestraalde MEF door 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen voor één schotel van 100 mm gedurende 5 minuten bij 37 °C, voeg vervolgens 4 ml MEF-medium toe om de trypsinevertering te stoppen en verzamel de celsuspensie in een nieuwe buis van 50 ml. Was de MEF met een vers MEF-medium door centrifugeren bij 280 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, tel het aantal cellen met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring en vries ze in op 1,6 x 106 cellen/buis in een celbevriezingsmedium. Bewaren tot gebruik; cellen kunnen gedurende meerdere jaren stabiel worden opgeslagen in vloeibare stikstof. 3. Cas9-RNP-DNA mengselbereiding Los tracrRNA en crisprRNA op in verdunningsbuffer (elke RNA-concentratie bij 200 μM) door pipetteren. Meng de tracrRNA-oplossing, crisprRNA-oplossing en verdunningsbuffer (volumeverhouding bij 2:2:5) door elk RNA zachtjes te tikken en te gloeien met behulp van een thermische cycler bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 1 °C/min stepdown-cycli totdat de temperatuur 4 °C bereikt.OPMERKING: De gRNA-sequentie is ontworpen met CRISPOR, http://crispor.tefor.net. Incubeer de gegloeide RNA’s, 10 μg/μL Cas9-nuclease en de elektroporatiebuffer gemengd in een volumeverhouding van 5:3:2 bij 37 °C gedurende 20 minuten om het Cas9-RNP-complex te vormen. Meng en incubeer bij routinewerk 1,25 μL gegloeid RNA, 0,75 μL Cas9-nuclease en 0,5 μL van de elektroporatiebuffer voor één locusgenoombewerking. Meng de volgende materialen in een buis van 1,5 ml: 10 μL elektroporatiebuffer, 1 μL Cas9-RNP-complex (stap 3.2) en 1 μL cirkelvormige richtvector (1 μg/μL, stap 1.6). De totale hoeveelheid Cas9-RNP-DNA mengsel is 12 μL. Houd het Cas9-RNP-DNA mengsel op ijs tot elektroporatie.OPMERKING: Om te voorkomen dat het gRNA na KI opnieuw wordt gesplitst, ontwerpt u het gRNA op een positie waar de gRNA-herkenningssequentie wordt gesplitst door de integratie van de KI-donor. Als het gRNA niet op een dergelijke locatie kan worden ontworpen, worden verschillende nucleotide stille mutaties, waardoor de aminozuursequentie niet verandert, opgenomen in het plasmide van de KI-donor. 4. Gentargeting van SER’s Om de met gelatine omhulde celcultuurschalen te bereiden, voegt u 0,1% (w / v) gelatine-oplossing toe op 2 ml voor een schaal van 60 mm, 500 μL voor een 24-well plaat, 100 μL voor een 96-well plaat en incubeer gedurende 2 uur in een vochtige incubator. Verwijder de gelatine-oplossing, was tweemaal met dezelfde hoeveelheid PBS en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik. Ontdooi mitotisch geïnactiveerde bevroren MEF-bouillon (stap 2.2) met behulp van een waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut en plaats de MEF op een met gelatine beklede schaal van 60 mm (één bevroren voorraadbuis MEF met 1,6 x 106 cellen voor twee gerechten van 60 mm, stap 2.2) 1 dag vóór het zaaien van ESC. Ontdooi een bevroren ESC-voorraadbuis (bewaard op 2 x 105 SER’s/buis; celtelling werd uitgevoerd met behulp van een celteller) met behulp van een waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut en plaats 1 x 105 SER’s op een schaal van 60 mm met voorgezaaide MEF (stap 4.1). Kweek in 4 ml ESC-kweekmedium (ESCM, gemodificeerd medium op basis van DMEM met 15% (v/v) foetaal runderserum, 2 mM L-glutaminesubstraat, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, leukemie remmende factor en t2i (0,2 μM PD0325901 en 3 μM CHIR99021) die de pluripotentie van ESC11 handhaaft bij 37 °C met 5% CO2 totdat de ESC 50% tot 70% samenvloeiing bereikt.OPMERKING: We gebruiken drie verschillende lijnen van ESC: JM8. A3 van B6N, V6.5 van B6-129 F1 en in eigen huis ontwikkelde BALB/c ESC. Dezelfde KI-protocollen in dit manuscript worden gebruikt voor alle ESC-regels. Was de kweek-ESC met 4 ml PBS en behandel vervolgens met 800 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 °C voor de spijsvertering. Voeg 1 ml ESCM toe om het trypsine te inactiveren en dissociëer de SER’s naar enkele cellen door te pipetteren. Centrifugeer de ESC-bevattende oplossing gedurende 5 minuten bij 280 x g, gooi het supernatant weg, resuspendeer SER’s in verse 1 ml ESCM en tel het aantal cellen met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring. Breng 1 x 105 SER’s over in een nieuwe buis van 1,5 ml en was ze drie keer met PBS door centrifugeren bij 500 x g, 4 °C. Resuspendeer de ESC-pellet in 12 μL Cas9-RNP-DNA-mengsel (stap 3.3) en meng goed door voorzichtig pipetteren om borrelen te voorkomen. Serveer de resuspended ESC voor elektroporatie. Het elektroporatiesysteem gebruikt een enkele puls bij 1.400 V en 30 ms voor Cas9-RNP-DNA-transductie (figuur 1). Kweek de geëlektropoeerde SER’s in een schaal van 60 mm met 4 ml ESCM met mitotisch geïnactiveerde MEF (punt 4.2). Verander het medium elke dag. Was de SER’s met 4 ml PBS 3 tot 5 dagen na de elektroporatie, behandel vervolgens met 800 μL van 0,25% trypsine-EDTA en kweek op 37 °C gedurende 5 minuten in een vochtige incubator voor de spijsvertering. Voeg 2 ml ESCM toe om de trypsinevergisting te stoppen en centrifugeer het celmengsel gedurende 5 minuten bij 280 x g . Gooi het supernatant weg, resuspenseer de SER’s in 1 ml verse ESCM en tel de celconcentratie met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring. Passeer de SER’s op 1 x 103 SER’s per schotel van 60 mm met ESCM en feeder MEF. Verander het medium elke dag totdat de kolonie opkrabbelt.OPMERKING: De reden waarom de ESC eenmaal wordt doorgegeven voordat het wordt opgehaald, was dat genoombewerking kan blijven plaatsvinden na ESC-deling, dus de eerste kolonie is in veel gevallen niet altijd de kloon. Daarom is de eerste passage van ESC voordat de kolonie wordt opgehaald een essentiële stap om enkele klonen op te halen. 5. PCR-genotypering van gerichte SER’s Aspirateer ESCM uit de ESC-kweekschaal 5 tot 7 dagen na de eerste passage (stap 4.9) en voeg 4 ml PBS toe. Pak enkele ESC-kolonies op met 5 μL PBS met behulp van een pipet van 20 μL onder een stereomicroscoop (30x tot 40x vergroting). Plaats de afzonderlijke kolonies in een putje van een ronde bodemplaat met 96 putten met 15 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Houd de 96-well plaat op ijs totdat 48 individuele kolonies zijn opgepikt. Incubeer de 96-well plaat gedurende 5 minuten in een 37 ° C vochtige 5% CO2-incubator , voeg vervolgens 80 μL ESCM toe om de trypsinevertering te stoppen en dissociëer ESC-kolonies in enkele cellen door te pipetteren.OPMERKING: Aangezien de KI-efficiëntie van deze methode meestal 10% -50% is, pakken we routinematig 48 klonen op en voeren we eerst genotypering uit met behulp van 24 van hen. Als er op dit moment niet meerdere KI-klonen kunnen worden verkregen, screenen we verder op KI met behulp van de resterende 24 klonen. Breng 40 μL ESC-suspensie (stap 5) over naar een gelatinegecoate feedervrije 96-wellsplaat met 50 μL ESCM per putje voor PCR-genotypering. Breng de resterende 60 μL ESC-suspensie over in een putje in een met gelatine beklede 24-wellsplaat, die 500 μL ESCM en feeder MEF bevat, om de bevroren ESC-bouillon te maken. Stock individuele ESC-klonen gekweekt in de 24-well plaat (stap 5.3) totdat ze 60% tot 80% samenvloeiing bereiken. Herstel individuele ESC-klonen door trypsinisatie zoals hierboven vermeld, verzamel cellen in een nieuwe buis van 1,5 ml en centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg, resuspenseer de cellen in 500 μL celbevriezingsmedium en vries ze in met een -80 °C diepvriezer. Voor PCR-genotypering kweekt ESC-klonen in de 96-well feedervrije plaat (stap 5.3) totdat de ESC meer dan 90% samenvloeiing bereikt. Verwijder ESCM uit elk putje door aspiratie en was tweemaal met 100 μL PBS. Adem de PBS aan en voeg 100 μL lysisbuffer met proteïnase K toe, meng goed en breng het ESC-lysaat over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Verwarm het ESC-lysaat op 65 °C gedurende ten minste 1 uur met behulp van een warmtekamer. Extraheer en zuiver het genomische DNA met behulp van een conventionele fenol-chloroform DNA-zuiveringsmethode gevolgd door ethanolprecipitatie. Los het neergeslagen DNA op in 20 μL DNase-vrij water en bepaal de zuiverheid en concentratie van DNA met behulp van een spectrofotometer. Voer genomische PCR uit met behulp van locusspecifieke primersets om het doelgebied te versterken. Controleer vervolgens de volgorde en kies de ESC-klonen met de gewenste KI-sequenties. 6. Voorbereiding van embryo’s in acht cellen en micro-injectie van SER’s Injecteer 5 IE serumgonadotrofine (PMSG) intraperitoneaal in volwassen ICR-vrouwtjes. Injecteer na 48 uur 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) in dezelfde vrouwtjes en koppel vervolgens de met hormonen behandelde vrouwtjes met de ICR-mannetjes. Controleer de copulatorische plug in de vagina de volgende dag (embryonale dag 0,5, ED0,5).OPMERKING: Om chimerisme te evalueren op basis van vachtkleurverhoudingen, gebruikt u blastocyst van de ICR-stam als ontvanger voor een ESC met een zwarte of agouti-vachtkleurachtergrond, of blastocyst van de C57BL / 6-stam als ontvanger voor een ESC met de albino-achtergrond. Verzamel de eileider bij ED1,5 en plaats deze in HEPES gebufferde medium (FHM) druppels. Herstel de embryo’s van twee of vier cellen door de eileider met FHM te spoelen met behulp van een spoelnaald die in het infundibulum is ingebracht. Was de verzamelde embryo’s door ze met een mondpipet in verschillende verse FHM-druppels te verplaatsen. Kweek de embryo’s in 50 μL KSOM druppel op een 35 mm celkweekschaal bedekt met minerale olie bij 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 1 dag totdat het achtcellige of morulastadium (ED2,5) is bereikt. Als de embryo’s de volgende verzameldag niet worden gebruikt, vries ze dan in door vitrificatie volgens het CARD-protocol (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) en bewaar ze in vloeibare stikstof tot gebruik. Bereid glazen pipetten voor op het vasthouden van de embryo’s (80-100 μm buitendiameter) en ESC-injectie (ongeveer 13 μm diameter) met behulp van een trekker en microforge. Integreer een holdingpipet met FHM in een capillaire houder die is aangesloten op een micro-injector en aan de linkerkant van de micromanipulator is opgesteld. Sluit een injectiepipet aan op een andere microinjector en plaats deze aan de rechterkant. Lijn de twee pipetten recht uit in het gezichtsveld van de microscoop. Doseer 5 μL druppels van 12% (w/v) polyvinylpyrrolidon (PVP) in FHM medium en 5 μL druppels FHM op hetzelfde deksel van een 60 mm schaal naast elkaar en bedek de druppels met minerale olie. Breng embryo’s over in de FHM-druppel van 5 μL en voeg 1-5 μL van de ESC-suspensie toe aan de FHM-druppel die embryo’s bevat.OPMERKING: Laat de ESC- en MEF-suspensie 30 minuten in de 4 ml ESM op een kweekschaal van 60 mm staan voordat u de druppel bereidt. Omdat MEF’s sneller aan de bodem kleven dan SER’s, zorgt deze incubatie van 30 minuten voor de concentratie van niet-vastgemaakte ES-cellen in het supernatant. Was in de injectiepipet met PVP en ga vervolgens naar de druppel met de embryo’s en SER’s. Pak drie individuele ECS-doubletten op die net klaar zijn met hun celdeling (zes cellen) in de injectiepipet. Houd een embryo met acht cellen of morulastadium vast, dat de verdichting heeft voltooid, met de vasthoudende pipet door aspiratie. Maak een gat in de zona pellucida met een piëzo-elektrische puls (intensiteit: 3; snelheid: 3). Verwijder de zescellige ESC in de zona pellucida en trek de pipet uit de embryo’s. Was de ESC-geïnjecteerde embryo’s met verschillende KSOM-druppels voorzichtig met behulp van een mondpipet en incubeer ze in een nieuwe KSOM-druppel van 50 μL bedekt met minerale olie bij 37 °C, 5% CO2 totdat de embryo’s zich ontwikkelen tot het blastocyststadium. Breng de 10 ESC-geïnjecteerde blastocysten over in elke baarmoederhoorn van pseudopregnante vrouwelijke muizen (2,5 dagen postcoitum, 20 blastocysten per hoofd). Nadat de draagmoeder is bevallen, selecteert u ten minste twee mannelijke chimaera’s met de hoogste chimerismeratio (70% of hoger zoals bevestigd door de vachtkleur) en paart u ze vervolgens met geschikte stamvrouwtjes om F1 heterozygote KI te verkrijgen. Fok individuele KI-muizen met geschikte partners om muizen te verkrijgen met wenselijke genotype(n) of genetische achtergronden die geschikt zijn voor onderzoek.