كريسبر / كاس 9 بوساطة استهداف الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الجذعية الجنينية لتطوير نماذج الفئران التلاعب بالجينات
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية ، خاصة بالنسبة لضربات الحمض النووي الكبيرة (KI). تم ضبط هذا البروتوكول باستخدام تحرير جينوم CRISPR / Cas9 ، مما أدى إلى تحسين كفاءة KI بشكل كبير مقارنة بطريقة استهداف الحمض النووي الخطي التقليدية بوساطة إعادة التركيب المتماثل.
Abstract
أتاح نظام كريسبر / كاس 9 تطوير الفئران المعدلة وراثيا عن طريق التحرير المباشر للجينوم باستخدام الزيجوت المخصب. ومع ذلك ، على الرغم من أن الكفاءة في تطوير الفئران بالضربة القاضية الجينية عن طريق إحداث طفرة إندل صغيرة ستكون كافية بما فيه الكفاية ، فإن كفاءة تحرير جينوم الجنين لصنع ضربة قاضية كبيرة الحجم للحمض النووي (KI) لا تزال منخفضة. لذلك ، على عكس طريقة KI المباشرة في الأجنة ، لا يزال استهداف الجينات باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) متبوعا بحقن الأجنة لتطوير الفئران الوهمية يتمتع بالعديد من المزايا (على سبيل المثال ، استهداف الإنتاجية العالية في المختبر ، والتلاعب متعدد الأليل ، ويمكن إجراء معالجة الجينات Cre و flox في فترة قصيرة). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام السلالات ذات الأجنة التي يصعب التعامل معها في المختبر ، مثل BALB / c ، لاستهداف ESC. يصف هذا البروتوكول الطريقة المثلى ل KI كبير الحجم (عدة كيلوبايت) في ESCs من خلال تطبيق تحرير الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9 متبوعا بإنتاج الفئران الوهمية لتطوير نماذج فأر يتم التلاعب بها بالجينات.
Introduction
إن إنتاج الفئران المعدلة وراثيا وتحليل نمطها الظاهري يمكننا من فهم وظائف جينية محددة بالتفصيل ، في الجسم الحي. تم الكشف عن العديد من النتائج المهمة باستخدام نماذج حيوانية معدلة جينيا في مجال علوم الحياة. علاوة على ذلك ، منذ تقرير تقنية تحرير الجينوم باستخدام CRISPR / Cas91 ، انتشرت الأبحاث باستخدام الفئران المعدلة وراثيا بسرعة إلى العديد من المختبرات 2,3. حقق تحرير الجينوم لزيجوت الفئران بواسطة CRISPR / Cas9 كفاءة مقبولة لتطوير تعديل قصير للحمض النووي ، مثل خروج المغلوب الجيني الموجه نحو الطفرة 4 ، أو استبدال النوكليوتيداتالمفردة ، أو إدخال علامة الببتيد القصيرة باستخدام oligonucleotides مفردة الشريط (ssODNs) كمتبرعين غير مباشرين (KI)5. من ناحية أخرى ، يظل KI لشظايا الحمض النووي الكبيرة إلى زيجوت عن طريق تحرير الجينوم بكفاءة منخفضة مقارنة بتعديل الحمض النووي قصير الحجم 6,7. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب استخدام سلالات الفئران مثل BALB / c ، وهي سلالة مهمة لمجالات بحثية محددة مثل علم المناعة ، لتحرير الجينوم القائم على الزيجوت لأن أجنة ما قبل الزرع عرضة للتلاعب في المختبر.
هناك طريقة أخرى لتطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا وهي استخدام تقنية استهداف الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) متبوعة بحقن ESC في الجنين قبل الزرع لإنتاج الوهم8،9،10 ، والذي لا يزال يستخدم بشكل روتيني كطريقة تقليدية. على الرغم من أن معدل الاستحواذ للحصول على استنساخ KI-ESC الدقيق ليس مرتفعا جدا في طرق استهداف ESC التقليدية ، إلا أن استهداف ESC يوفر بعض المزايا مقارنة بتحرير جينوم الزيجوت ، خاصة بالنسبة ل DNA KI الطويل. على سبيل المثال ، كفاءة KI لشظايا الحمض النووي الطويلة (> عدة كيلوبايت) في جينوم الزيجوت أقل وضوحا 6,7 ، وهناك حاجة إلى العديد من الزيجوت لتطوير حتى سطر واحد من فأر KI ، وهو أمر غير مرغوب فيه في المنظور الحالي للتجارب على الحيوانات. على عكس تحرير جينوم الزيجوت ، فإن استهداف الحمض النووي الطويل ل ESCs متبوعا بإنتاج الوهم يحتاج إلى أجنة أقل بكثير من تحرير جينوم الزيجوت. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن أجنة ما قبل الزرع من BALB / c عرضة للتلاعب في المختبر ، يمكن الحفاظ على ESCs الخاصة بها والتعامل معها في المختبر 11 مثل ESCs الخلفية 129 أو F1 المختصة الأخرى ، وبالتالي ، تنطبق على إنتاج الوهم. ومع ذلك ، على الرغم من أن ناقل الاستهداف يحتوي على أذرع متماثلة 5 ‘و 3’ وأشرطة جينية مقاومة للأدوية للاختيار الإيجابي أو السلبي ، فإن كفاءة KI التقليدية ل ESCs غير كافية بشكل عام ، بسبب التردد العالي للتكامل الجينومي العشوائي 8,10 ، وبالتالي ، يلزم اتباع طريقة محسنة ذات كفاءة استهداف ESC دقيقة. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن طريقة ESC KI مضبوطة باستخدام تحرير الجينوم المستند إلى CRISPR / Cas9 لتحقيق كفاءة KI أعلى من طرق الاستهداف التقليدية11. تعتمد الطريقة التي نصفها هنا على هذا الإجراء الذي يمكن الحمض النووي الطويل (> عدة إلى 10 كيلو بايت) KI إلى ESCs بكفاءة مقبولة للأعمال الروتينية دون اختيار الدواء ؛ وبالتالي ، فإن إجراء بناء المتجه سيكون أسهل بكثير ويحتاج إلى فترة أقصر ، أو ستصبح فترة زراعة الخلايا أقصر بكثير.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام الاستهداف الجيني ل ESCs متبوعا بإنتاج الوهم تقليديا لتطوير الفئران التي يتم التلاعب بها بالجينات. ومع ذلك ، لا تزال كفاءة الضربة القاضية للجينات منخفضة على الرغم من أن ناقل الاستهداف يحتوي على أذرع تماثلية طويلة (> عدة كيلوبايت في المعتاد) مع أشرطة جينية إيجابية أو سلبية لاختيار الدواء. قدم بروتوكولنا طريقة ESC KI مضبوطة للحمض النووي الخارجي الطويل باستخدام بلازميد دائري بدون أي أشرطة اختيار الدواء كناقل استهداف مصحوب بتحرير الجينوم بوساطة Cas9-RNP بكفاءة مقبولة للأعمال الروتينية. وبالتالي ، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في تقليل مقدار الوقت المستغرق في إنتاج الفئران الخيمرية المعدلة وراثيا بشكل كبير مقارنة باستهداف ESC التقليدي.
في هذا البروتوكول ، استخدمنا CRISPR / Cas9-RNP للحث على فواصل مزدوجة الشريط خاصة بالموقع في الجينوم ، وتم استخدام بلازميد دائري كناقل استهداف بدلا من ناقل خطي. تستخدم البلازميدات الخطية تقليديا كناقل مستهدف للجين KI بسبب كفاءتها المتزايدة في التكامل الجيني8،9،10. ومع ذلك ، فإن العديد من عمليات التكامل الجينومي غير محددة على الرغم من أن المتجه يحتوي على أذرع متماثلة9. من ناحية أخرى ، نادرا ما تستخدم البلازميدات الدائرية كناقلات مستهدفة بسبب ميزتها التي يصعب دمجها في جينوم ESCs12 أو الخلايا الليفية13. وبالتالي ، سيكون من الممكن أن يؤدي تطبيق بلازميد دائري كمتجه استهداف مصحوب بتحرير الجينوم بوساطة كريسبر / كاس9 إلى تقليل التكامل العشوائي غير المحدد ولكنه يزيد من التكامل الخاص بالموقع في جينوم ESC. سيكون من الجدير بالذكر أن كفاءة الحث لكسر الشريط المزدوج بواسطة CRISPR / Cas9 مهمة جدا14 ، وبالتالي سيكون من الضروري استخدام gRNA الذي يؤدي إلى كسر حبلا مزدوج بكفاءة عالية. يجب النظر في إعادة تصميم gRNA عندما تكون كفاءة KI منخفضة للغاية. في الحالة الموضحة في الشكل 2 ، أظهرت 40.9٪ من استنساخ ESC نطاقا خاصا ب KI. في الواقع ، بصفتنا المختبر الأساسي للمعهد ، نقوم بشكل روتيني بإجراء استهداف الجينات باستخدام ESCs بالطريقة الموضحة هنا وحققنا كفاءات KI بنسبة 10٪ -50٪ لتسلسلات 1-2 كيلو بايت مثل Cre أو CreERT أو مراسلات الفلورسنت ، على الرغم من وجود بعض الاختلافات اعتمادا على موضع الجين. أطول تسلسل DNA لدينا بنجاح KI باستخدام هذه الطريقة هو حوالي 11.2 كيلو بايت في موضع Rosa26 ، وكانت الكفاءة 12.2٪ (خمس مستعمرات KI من أصل 41 مستعمرة تم تحليلها).
وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا البروتوكول يستخدم أجنة من ثماني خلايا أو مرحلة التوتية كمتلقين للحقن المجهري ESC ولكن ليس أجنة مرحلة الكيسة الأريمية. على الرغم من أننا لم نجري تجارب مقارنة في هذه الورقة ، فقد أظهرت العديد من التقارير أن حقن ESCs في أجنة من ثماني خلايا أو مرحلة التوتية يحسن بشكل كبير من كفاءة مساهمة ESC في النسل الخيمري مقارنة بحقن ESC في الكيسات الأريمية15،16،17،18 . في الواقع ، أدت حقن ESC لخطوط ESC المختلفة ، بما في ذلك C57BL / 6 و B6-129 F1 و BALB / c ، بشكل عام إلى تطور وهم بلون معطف عالي في بعض النسل ، وليس كله (انظر الشكل 4). الحد من هذه الطريقة هو أن ESCs التي يتم حقنها في الجنين قبل الزرع لا يمكن أن تسهم دائما في الخلايا الجرثومية في الوهم19,20. يعتمد انتقال الخط الجرثومي ل ESCs على جودة كل استنساخ ESC19. لذلك ، سيكون من المفيد تطوير خطوط استنساخ ESC متعددة كنسخة احتياطية لإنتاج الماوس الخيمري المستقر. في الختام ، تستخدم البروتوكولات المعروضة هنا ناقلات استهداف بسيطة تشمل فقط كل ذراع تماثل وجين مهم ل KI بدون أي كاسيت مقاوم للأدوية. لذلك ، سيكون بناء المتجه أسهل بكثير ، ويمكن تقصير فترة الاستزراع مقارنة بتقنية استهداف ESC التقليدية. وهذا من شأنه أن يساعد في إنتاج أنواع مختلفة من الفئران المعدلة وراثيا بسرعة وتسهيل للتحليل المستقبلي في علوم الحياة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ساكي نيشيوكا من جامعة أوساكا ، أبحاث وتطوير التكنولوجيا الحيوية (منظمة غير ربحية) ، وميو كيكوتشي وريكو ساكاموتو في معهد العلوم الطبية ، جامعة طوكيو ، على مساعدتهم الفنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من قبل: منح وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) / الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI إلى MI (JP19H05750 ، JP21H05033) ، و MO (20H03162) ؛ البحث الأساسي للعلوم والتكنولوجيا التطورية (CREST) ، منحة وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية (JST) إلى MI (JPMJCR21N1) ؛ معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية إلى MI (R01HD088412) ؛ مؤسسة بيل وميليندا غيتس إلى MI (منحة استكشافات التحديات الكبرى INV-001902) ؛ ومنحة لمشروع البحث المشترك لمعهد أبحاث الأمراض الميكروبية ، جامعة أوساكا إلى MI ، و MO.
Materials
| BALB/c ESC | – | – | ESC developed from BALB/c strain |
| Bambanker | Nippon Genetics | CS-02-001 | Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere |
| Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081059 | Section 3.2 and elsewhere. |
| CHIR99021 | FUJIFILM Wako | 038-23101 | Section 4.3 |
| CreERT gene fragment | GeneWiz | Section 1.1. | |
| CRISPR-Cas9 crisprRNA | IDT | crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere. | |
| CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072534 | tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere. |
| DMEM | Nacalai | 08458-45 | MEF medium. Section 2.3 and elsewhere |
| Duplex buffer | IDT | 1072534 | RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere. |
| FastGene Gel/PCR Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Section 1.1 and 1.2. |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutatime substrate |
| hCG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
| In-Fusion HD Cloning Kit | Clontech | 639648 | DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere |
| JM8.A3 ESC | EuMMCR | – | ESC developed from C57BL/6N strain |
| Knock-out DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium. |
| KSOM | Merck | MR-121-D | Section 6.3 and 6.9. |
| Leukemia inhibitory factor | FUJIFILM Wako | 125-05603 | Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol. |
| Neon Electroporation system | Thermo Fisher | MPK5000 | Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2. |
| NucleoSpin Plasmid Transfection-grade | Takara | U0490B | Section 1.6. |
| PD0325901 | FUJIFILM Wako | 162-25291 | Section 4.3 |
| PMSG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
| Tail lysis buffer | Nacalai | 06169-95 | Section 5.5. |
| Trypsin-EDTA | Nacalai | 32777-15 | Section 2.2 and elsewhere |
| V6.5 ESC | – | – | ESC developed from B6J-129 F1 strain |
| X-ray irradiation device | Hitachi | MBR-1618R-BE | Section 2.6. |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Oji, A., et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. Scientific Reports. 6, 31666 (2016).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).
- Johnson, R. S., et al. Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination. Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).
- Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells. Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).
- Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M., Hatada, I. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. Genome Editing in Animals – Methods and Protocols 2nd edition. , (2022).
- Yagi, M., et al. Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).
- Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322 (5903), 949-953 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Hu, M., et al. Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos. Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).
- Guo, J., et al. Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos. Stem Cells International. 2014, 409021 (2014).
- Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies. Nature Communications. 13 (1), 2351 (2022).
- Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats. Nature Communications. 12 (1), 1328 (2021).
- Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3. Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).
