CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

すべてのマウス実験は、東京大学の施設内動物管理・利用委員会(承認番号PA17-63)および大阪大学(承認番号Biken-AP-H30-01)によって承認され、それらのガイドラインおよびARRIVEガイドライン(https://arriveguidelines.org)に従って実施されました。 1. ターゲティングベクター構築 KIカセット(ここではCreERT、PCR用のテンプレートDNAはもともと市販の遺伝子合成会社からのものです)と5’または3′-相同性アームの約1 kbフラグメントをPCRで増幅します。DNAクローニング(ステップ1.3)では、各PCRプライマーの5’末端に15量体のオーバーラップ配列を追加します。PCR用DNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、続いてDNA精製キットを用いてDNA断片を抽出した。 クローニングのためにマルチクローニングサイトのどこかで一意に消化する適切な制限酵素を使用して、バックボーンプラスミド(pUC19やpBSなど)を線形化します。次いで、DNA精製キットを用いて消化プラスミドを精製する。 各PCRフラグメント(例えば、5′-ホモロジーアーム、3′-ホモロジーアーム)およびKI配列を同時に、製造元の指示に従ってDNAクローニングキットを使用して消化されたプラスミドにクローニングします。 構築したプラスミドを使用してコンピテントセルを形質転換し(ステップ1.3)、水浴中で42°Cで1分間加熱し、アンピシリンやカナマイシンなどの抗生物質を適切な濃度で含むLBプレートに播種します。それらを一晩培養して、耐性クローンを選択します。 200 μLのピペットチップを使用して数個(4〜8個)の個々のコロニーをピックアップし、適切な抗生物質(100 μg/mLアンピシリンまたは20 μL/mLカナマイシン)を含む3 mLの液体LBにチップを移し、振とうしながら37°Cで一晩培養します。 翌日、エンドトキシンフリーグレードの市販プラスミド精製キットを使用して、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。プラスミド中のクローニング配列をサンガーシーケンシングにより確認する。ヌクレアーゼフリーの水を使用して、プラスミド濃度を1 μg DNA/μLに調整します。プラスミドを遺伝子ターゲティングベクターとして使用します。 2. ESCのフィーダー細胞としてのマウス胚性線維芽細胞(MEF)の作製 8〜10週齢の妊娠中のICR雌マウス(性交後14.5日)を頸部脱臼によって犠牲にする。滅菌に70%(v / v)エタノールを使用して腹部をよく拭き、眼窩ハサミと鉗子を使用して腹部を切断し、胎児を含む子宮を回復します。 子宮を、100 U / mLペニシリンと100 μg / mLストレプトマイシンを含む10 mLのリン酸ウシ血清(PBS)を含む100 mmディッシュに入れます。眼窩はさみと鉗子を使用して胎児から胎盤と胚外組織を取り除きます。眼窩ハサミを使用して胎児をミンチし、ミンチした胎児細胞を含むPBS溶液を50mLのコニカルチューブに移します。 280 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。10 mLの0.25%(w/v)トリプシン-EDTA溶液を加え、ピペッティングでよく混合した後、トリプシン消化用のウォーターバスを使用して37°Cで10分間インキュベートします。 20 mLのMEF培地(10%(v/v)ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むDMEM)を加えて酵素反応を停止し、穏やかな反転によってよく混合し、280 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引して廃棄し、MEF培地を10mL加え、ピペッティングでよく混合します。 細胞懸濁液をいくつかの新しい100 mmディッシュに播種します(100 mmディッシュ1枚に対して10 mLのMEF培地で胎児の数と同じ数のディッシュを準備します)。播種後4〜5時間で培地を交換して、付着していない細胞を取り除き、付着したMEFを成長させます。細胞が~80%のコンフルエントに達したら、トリプシンを使用して細胞を継代します。 増殖するMEFを含む培養皿をMEF培地に入れ、播種後約12〜15日目に、X線照射装置に入れる。MEFを50 Gy(合計)のX線で露光し、製造元の指示に従って細胞周期を停止させます。 照射したMEFを100 mmディッシュ1枚に2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えて37°Cで5分間トリプシン処理し、次に4 mLのMEF培地を加えてトリプシン消化を停止し、細胞懸濁液を新しい50 mLチューブに回収します。 MEFを新鮮なMEF培地で280 x g で4°Cで5分間遠心分離して洗浄し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを使用して細胞数をカウントし、細胞凍結培地中で1.6 x 106 細胞/チューブで凍結します。使用するまで保管してください。細胞は液体窒素中で数年間安定して保存することができます。 3. Cas9-RNP-DNA混合物の調製 tracrRNAおよびcrisprRNAをピペッティングにより希釈バッファー(各RNA濃度200 μM)に溶解します。tracrRNA溶液、crisprRNA溶液、および希釈バッファー(容量比2:2:5)を穏やかにタッピングして混合し、サーマルサイクラーを使用して95°Cで10分間アニールした後、温度が4°Cに達するまで1°C/分の降圧サイクルを行います。注:gRNA配列は、クリスポール http://crispor.tefor.net を使用して設計されました。 アニーリングしたRNA、10 μg/μLのCas9ヌクレアーゼ、およびエレクトロポレーションバッファーを容量比5:3:2で混合し、37°Cで20分間インキュベートし、Cas9-RNP複合体を形成します。ルーチンワークでは、1遺伝子座ゲノム編集のために、1.25 μLのアニーリングRNA、0.75 μLのCas9ヌクレアーゼ、および0.5 μLのエレクトロポレーションバッファーを混合してインキュベートします。 1.5 mLチューブで次の材料を混合します:10 μLのエレクトロポレーションバッファー、1 μLのCas9-RNP複合体(ステップ3.2)、および1 μLの円形ターゲティングベクター(1 μg/μL、ステップ1.6)。Cas9-RNP-DNA混合物の総量は12μLである。 Cas9-RNP-DNA混合物をエレクトロポレーションまで氷上に保管してください。注:KI後のgRNAの再切断を防ぐために、KIドナーの組み込みによってgRNA認識配列が分割される位置にgRNAを設計してください。そのような場所でgRNAを設計できない場合、アミノ酸配列が変化しないいくつかのヌクレオチドサイレント変異がKIドナーのプラスミドに含まれる。 4. ESCの遺伝子ターゲティング ゼラチンコーティングされた細胞培養ディッシュを調製するには、60 mmディッシュの場合は2 mL、24ウェルプレートの場合は500 μL、96ウェルプレートの場合は100 μLの0.1%(w/v)ゼラチン溶液を加え、湿度の高いインキュベーターで2時間インキュベートします。ゼラチン溶液を取り出し、同量のPBSで2回洗浄し、使用するまで室温で保存します。 37°Cの水浴を用いて有糸分裂的に不活化した凍結MEFストックを1分間解凍し(ステップ2.2)、ESC播種の1日前にゼラチンコーティングされた60 mmディッシュ(2つの60 mmディッシュに対して1.6 x 106 セルを含むMEFの1つの凍結ストックチューブ、ステップ2.2)にMEFを置きます。 凍結したESCストックチューブ(2 x 10 5 ESC /チューブで保存、セルカウントはセルカウンターを使用して実行)を37°Cの水浴で1分間解凍し、1 x 105 ESCを播種済みのMEFを含む60 mmディッシュに置きます(ステップ4.1)。 4 mL ESC培地(ESCM、15%(v/v)ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン基質、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、白血病抑制因子、およびESC11の多能性を維持するt2i(0.2 μM PD0325901および3 μM CHIR99021)を、ESCが50%から70%のコンフルエントに達するまで5%CO2 で37°Cで培養します。注:ESCの3つの異なる行を使用します:JM8。B6NからA3、B6-129 F1からV6.5、および自社開発のBALB/c ESCです。この原稿の同じKIプロトコルがすべてのESCラインに使用されています。 培養中のESCを4 mLのPBSで洗浄し、800 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液で37°Cで5分間処理して消化します。1 mLのESCMを加えてトリプシンを不活性化し、ピペッティングによってESCを単一細胞に解離させます。 ESC含有溶液を280 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、新鮮な1 mLのESCMにESCを再懸濁し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを使用して細胞数をカウントします。1 x 10 5 ESCを新しい1.5 mLチューブに移し、500 x g、4°Cで遠心分離することによりPBSで3回洗浄します。 ESCペレットを12 μLのCas9-RNP-DNA混合物に再懸濁し(ステップ3.3)、泡立ちを避けるために穏やかなピペッティングでよく混合します。再懸濁したESCをエレクトロポレーション用に提供します。エレクトロポレーションシステムは、Cas9-RNP-DNA形質導入に1,400 Vおよび30 msの単一パルスを使用します(図1)。 有糸分裂的に不活性化されたMEFを含む4 mLのESCMを含む60 mmディッシュでエレクトロポレーションされたESCを培養します(セクション4.2)。培地は毎日交換してください。 エレクトロポレーションの3〜5日後にESCを4 mLのPBSで洗浄し、800 μLの0.25%トリプシン-EDTAで処理し、湿潤インキュベーターで37°Cで5分間培養して消化します。2 mLのESCMを加えてトリプシン消化を停止し、細胞混合物を280 x g で5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ESCを1 mLの新鮮なESCMに再懸濁し、トリパンブルー染色を施したセルカウンターを用いて細胞濃度をカウントします。ESCMとフィーダーMEFを含む60mmディッシュあたり1 x 103 ESCでESCを通過させます。コロニーが回復するまで毎日培地を交換してください。注:ESCがピックアップ前に一度通過する理由は、ESC分裂後もゲノム編集が起こり続ける可能性があるため、多くの場合、最初のコロニーが必ずしもクローンであるとは限らないためです。したがって、コロニーピックアップ前のESCの最初の通過は、単一クローンをピックアップするための必須ステップである。 5. 標的ESCのPCRジェノタイピング 最初の継代の5〜7日後にESC培養皿からESCMを吸引し(ステップ4.9)、4mLのPBSを添加する。実体顕微鏡下で20 μLのピペットを使用して、5 μLのPBSを含む単一のESCコロニーをピックアップします(30倍から40倍の倍率)。個々のコロニーを、15 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を含む丸底96ウェルプレートのウェルに入れます。 48個の個々のコロニーがピックアップされるまで、96ウェルプレートを氷上に置いておきます。96ウェルプレートを37°Cの湿度5%CO2 インキュベーターで5分間インキュベートした後、80 μLのESCMを加えてトリプシン消化を停止し、ピペッティングによってESCコロニーを単一細胞に解離させます。注:この方法のKI効率は通常10%〜50%であるため、私たちは日常的に48個のクローンをピックアップし、そのうち24個を使用して最初にジェノタイピングを実行します。この時点で複数のKIクローンを取得できない場合は、残りの24クローンを使用してKIをさらにスクリーニングします。 40 μLのESC懸濁液を、PCRジェノタイピングのためにウェルあたり50 μLのESCMを含むゼラチンコーティングされたフィーダーフリー96ウェルプレートに移します(ステップ5)。残りの60 μLのESC懸濁液を、500 μLのESCMとフィーダーMEFを含むゼラチンコーティングされた24ウェルプレートのウェルに移し、凍結ESCストックを作成します。 個々のESCクローンを24ウェルプレートで培養し(ステップ5.3)、60%〜80%のコンフルエントに達するまでストックします。上記のようにトリプシン処理によって個々のESCクローンを回収し、新しい1.5 mLチューブに細胞を回収し、280 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を500 μLの細胞凍結培地に再懸濁し、-80°Cのディープフリーザーを使用して凍結します。 PCRジェノタイピングの場合、ESCクローンを96ウェルフィーダーフリープレートで培養します(ステップ5.3)ESCが90%以上のコンフルエントに達するまで。吸引により各ウェルからESCMを除去し、100 μLのPBSで2回洗浄します。 PBSを吸引し、プロテイナーゼKを含む100 μLの溶解バッファーを加えてよく混合し、ESCライセートを新しい1.5 mLチューブに移します。加熱チャンバーを使用して、ESCライセートを65°Cで少なくとも1時間加熱します。従来のフェノール-クロロホルムDNA精製法を用いてゲノムDNAを抽出・精製した後、エタノール沈殿法で精製する。 沈殿したDNAを20 μLのDNaseフリー水に溶解し、分光光度計を使用してDNAの純度と濃度を測定します。遺伝子座特異的プライマーセットを使用してゲノムPCRを実行し、標的領域を増幅します。次に、シーケンスを確認し、目的のKIシーケンスを持つESCクローンを選択します。 6. 8細胞期胚の作製とESCのマイクロインジェクション 5IUの妊娠牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内に成人ICR女性に注射します。.48時間後、5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を同じ女性に注射し、ホルモン処理された女性をICRオスと交配させます。翌日(胚の日0.5、ED0.5)に膣内の交尾プラグを確認してください。注:コートの色の比率でキメラを評価するには、黒またはアグーチのコートの色の背景を持つESCのレシピエントとしてICR株の胚盤胞を使用するか、アルビノの背景を持つESCのレシピエントとしてC57BL / 6株の胚盤胞を使用します。 ED1.5で卵管を収集し、HEPES緩衝培地(FHM)ドロップに入れます。眼底に挿入されたフラッシング針を使用してFHMで卵管をフラッシュすることにより、2細胞または4細胞期の胚を回収します。 収集した胚をマウスピペットを使用していくつかの新鮮なFHMドロップに移して洗浄します。50 μLのKSOMドロップで、鉱物油で覆われた35 mm細胞培養皿上で、37°C、5%CO2 インキュベーターで、8細胞または桑実胚期(ED2.5)に達するまで1日間培養します。 次の採取日に胚を使用しない場合は、CARDプロトコル(http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html)に従ってガラス化保存し、使用するまで液体窒素で保存します。 プーラーとマイクロフォージを使用して、胚を保持するためのガラスピペット(外径80〜100 μm)とESC注射(直径約13 μm)を準備します。 FHMを含む保持ピペットをマイクロインジェクターに接続し、マイクロマニピュレーターの左側に設置するキャピラリーホルダーに統合します。インジェクションピペットを別のマイクロインジェクターに接続し、右側に設置します。2つのピペットを顕微鏡の視野にまっすぐ合わせます。 FHM培地中の12%(w / v)ポリビニルピロリドン(PVP)の5 μL滴とFHMの5 μL滴を60 mmディッシュの同じ蓋に並べて分注し、滴をミネラルオイルで覆います。5 μLのFHMドロップに胚を移し、胚を含むFHMドロップに1〜5 μLのESC懸濁液を加えます。注:ドロップを準備する前に、ESCおよびMEF懸濁液を60mmの培養皿上の4 mL ESMに30分間放置します。MEFはESCよりも早く底に付着するため、この30分間のインキュベーションにより、上清中の未付着ES細胞の濃度が可能になります。 インジェクションピペット内をPVPで洗浄し、胚とESCを含むドロップに移動します。 細胞分裂が終了したばかりの3つのECSダブレット(6つのセル)をインジェクションピペットでピックアップします。圧縮が完了した8細胞または桑実胚を吸引ピペットで保持します。圧電パルス(強度:3、速度:3)で透明帯に穴を開けます。 透明帯内の6細胞ESCを排出し、ピペットを胚から引き出します。 ESC注入した胚をマウスピペットを使用して数滴のKSOM滴で穏やかに洗浄し、胚が胚盤胞期に発達するまで、37°C、5%CO2 の鉱物油で覆われた新しい50μLのKSOMドロップでインキュベートします。 10個のESC注射された胚盤胞を偽妊娠雌マウスの各子宮角に移します(性交後2.5日、頭あたり20個の胚盤胞)。 代理母が出産した後、キメラ比が最も高い(毛色で確認される70%以上)オスのキメラを少なくとも2つ選択し、適切な系統のメスと交配してF1ヘテロ接合KIを得る。 個々のKIマウスを適切なパートナーと交配して、研究に適した望ましい遺伝子型または遺伝的背景を持つマウスを取得します。