מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

כל הניסויים בעכבר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טוקיו (מספר אישור PA17-63) ואוניברסיטת אוסקה (מספר אישור Biken-AP-H30-01) ובוצעו על פי ההנחיות שלהם, כמו גם הנחיות ARRIVE (https://arriveguidelines.org). 1. מיקוד בניית וקטורים הגבירו קלטת KI (CreERT כאן, דנ”א תבניתי עבור ה-PCR הוא במקור מחברת סינתזת גנים מסחרית) וקטע של כ-1 קילובייט של זרועות הומולוגיה בגודל 5 או 3 אינץ’ על ידי PCR. עבור שיבוט DNA (שלב 1.3), הוסף רצפי חפיפה של 15-mer בקצה 5′ של כל פריימר PCR. טהרו את מקטעי הדנ”א של ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז, ולאחר מכן הוציאו את מקטע הדנ”א באמצעות ערכת טיהור DNA. ליניאריזציה של פלסמיד עמוד השדרה (לדוגמה, pUC19 או pBS) באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים שמתעכלים באופן ייחודי איפשהו באתר המולטי-שיבוט לצורך שיבוט. לאחר מכן, טהרו את הפלסמיד המעוכל באמצעות ערכת טיהור DNA. שכפלו כל מקטע PCR (למשל, זרוע הומולוגיה 5′-, זרוע הומולוגיה 3′-) ורצף KI בו זמנית לתוך הפלסמיד המעוכל באמצעות ערכת שיבוט DNA בהתאם להוראות היצרן. הפוך את התאים המתאימים באמצעות הפלסמיד הבנוי (שלב 1.3) על ידי חימום ב 42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת באמבט מים, ולאחר מכן זרע אותם על צלחת LB המכילה את הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה כגון אמפיצילין או קנאמיצין. תרבות אותם בן לילה לבחירות שיבוט עמידות. לאסוף כמה (ארבע עד שמונה) מושבות בודדות באמצעות 200 μL פיפטה טיפים ולהעביר את הקצוות לתוך 3 מ”ל של LB נוזלי המכיל אנטיביוטיקה מתאימה (100 מיקרוגרם / מ”ל אמפיצילין או 20 μL / mL kanamycin) ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. טהרו את הפלסמיד למחרת באמצעות ערכת טיהור פלסמידים מסחרית ללא אנדוטוקסין בהתאם להוראות היצרן. אשר את הרצף המשובט בפלסמיד על ידי ריצוף סנגר. התאימו את ריכוז הפלסמיד ל-1 מיקרוגרם DNA/μL באמצעות מים נטולי נוקלאזה. השתמש בפלסמיד כווקטור מיקוד הגנים. 2. הכנת הפיברובלסט העוברי של העכבר (MEF) כתאי הזנה ל-ESC להקריב עכברות ICR הרות בנות 8-10 שבועות (14.5 ימים לאחר הלידה) על ידי נקע צוואר הרחם. נגבו היטב את הבטן על ידי שימוש באתנול 70% (v/v) לעיקור, חתכו את הבטן באמצעות מספריים ומלקחיים מסלוליים, ושחזרו את הרחם המכיל את העובר. הכניסו את הרחם לצלחת בקוטר 100 מ”מ המכילה 10 מ”ל של סרום בקר פוספט (PBS) המכיל 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ”ל סטרפטומיצין. הסר את השליה ואת הרקמות extraembryonic מן העוברים באמצעות מספריים מסלולית ומלקחיים. טחנו את העוברים באמצעות מספריים מסלוליים והעבירו את תמיסת ה- PBS המכילה את תאי העובר הטחונים לצינור חרוטי של 50 מ”ל. צנטריפוגה ב 280 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant על ידי שאיפה. מוסיפים 10 מ”ל של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% (w/v), מערבבים היטב על ידי פיפטציה, ואז דוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים לעיכול טריפסין. הוסיפו 20 מ”ל של מדיום MEF (DMEM המכיל 10% (v/v) סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ”ל סטרפטומיצין) כדי לעצור את התגובה האנזימטית, ערבבו היטב על ידי היפוך עדין, וצנטריפוגה ב-280 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נאטנט על ידי שאיפה, הוסיפו 10 מ”ל של מדיום MEF, וערבבו היטב על ידי פיפטציה. זרעו את מתלה התאים בכמה מנות חדשות בקוטר 100 מ”מ (הכינו את אותו מספר מנות כמו מספר העוברים עם 10 מ”ל של מדיום MEF למנה אחת של 100 מ”מ). שנו את המדיום 4 עד 5 שעות לאחר הזריעה כדי להסיר תאים לא מחוברים ותנו ל-MEF המצורף לגדול. הזז את התאים כאשר הם מגיעים ~ 80% מפגש באמצעות טריפסין. מניחים את מנות התרבית המכילות את ה-MEF המתרבה במדיום MEF, כ-12-15 יום לאחר הזריעה, במכשיר המקרין קרני רנטגן. חשוף את ה- MEF עם צילום רנטגן של 50 Gy (סה”כ) כדי לעצור את מחזור התא בהתאם להוראת היצרן. נסה את ה- MEF המוקרן על ידי הוספת 2 מ”ל של 0.25% טריפסין-EDTA למנה אחת של 100 מ”מ למשך 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסף 4 מ”ל של מדיום MEF כדי לעצור את עיכול הטריפסין ולאסוף את תרחיף התאים בצינור חדש של 50 מ”ל. שטפו את ה-MEF במדיום MEF טרי על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 280 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ספרו את מספר התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן, והקפאו אותם בטמפרטורה של 1.6 x 106 תאים /צינור במדיום להקפאת תאים. יש לאחסן עד לשימוש; תאים יכולים להיות מאוחסנים ביציבות בחנקן נוזלי במשך מספר שנים. 3. הכנת תערובת Cas9-RNP-DNA ממיסים tracrRNA ו-crisprRNA במאגר דילול (כל ריכוז RNA ב-200 μM) על ידי פיפטציה. ערבבו את תמיסת tracrRNA, תמיסת crisprRNA וחיץ הדילול (יחס נפח של 2:2:5) על ידי הקשה עדינה ו-anneal כל RNA באמצעות מחזור תרמי ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן מחזורי הורדה של 1 °C/min עד שהטמפרטורה מגיעה ל-4 מעלות צלזיוס.הערה: רצף ה-gRNA תוכנן באמצעות CRISPOR, http://crispor.tefor.net. דגרו את ה-RNA החישול, 10 מיקרוגרם/μL Cas9 nuclease, ואת חיץ האלקטרופורציה מעורבב ביחס נפח של 5:3:2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי ליצור את קומפלקס Cas9-RNP. בעבודה שגרתית, ערבבו ודגרו 1.25 μL של RNA חישול, 0.75 μL של Nuclease Cas9, ו-0.5 μL של מאגר האלקטרופורציה עבור עריכת גנום לוקוס אחד. ערבבו את החומרים הבאים בצינור של 1.5 מ”ל: 10 μL של מאגר אלקטרופורציה, 1 μL של קומפלקס Cas9-RNP (שלב 3.2), ו-1 μL של וקטור מיקוד מעגלי (1 מיקרוגרם/μL, שלב 1.6). הכמות הכוללת של תערובת Cas9-RNP-DNA היא 12 μL. שמור את תערובת Cas9-RNP-DNA על הקרח עד לאלקטרופורציה.הערה: כדי למנוע ביקוע מחדש של ה-gRNA לאחר KI, תכנן את ה-gRNA במיקום שבו רצף זיהוי ה-gRNA מפוצל על-ידי שילוב של תורם ה-KI. אם לא ניתן לתכנן את ה-gRNA במיקום כזה, מספר מוטציות שקטות של נוקלאוטידים, שבאמצעותן רצף חומצות האמינו אינו משתנה, נכללות בפלסמיד של תורם ה-KI. 4. מיקוד גנים של תאי גזע עובריים כדי להכין את כלי תרבית התאים המצופים בג’לטין, הוסיפו תמיסת ג’לטין של 0.1% (w/v) ב-2 מ”ל לצלחת של 60 מ”מ, 500 מיקרו-ליטר לצלחת של 24 בארות, 100 מיקרו-ליטר לצלחת של 96 בארות, ודגרה של שעתיים באינקובטור לח. יש להסיר את תמיסת הג’לטין, לשטוף פעמיים באותה כמות של PBS ולאחסן בטמפרטורת החדר עד לשימוש. הפשירו מלאי MEF קפוא ללא פעילות מיטוטית (שלב 2.2) באמצעות אמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, והניחו את ה-MEF על צלחת מצופה ג’לטין בקוטר 60 מ”מ (שפופרת אחת קפואה של MEF המכילה 1.6 x 106 תאים עבור שתי מנות בקוטר 60 מ”מ, שלב 2.2) יום אחד לפני זריעת ESC. להפשיר צינור מלאי ESC קפוא (מאוחסן ב 2 x 10 5 ESC / צינור; ספירת תאים בוצעה באמצעות מונה תאים) באמצעות אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת, ולהניח 1 x 105 ESCs על צלחת 60 מ”מ המכילה MEF נזרע מראש (שלב 4.1). תרבית בתרבית ESC 4 מ”ל (ESCM, מדיום מותאם מבוסס DMEM עם סרום בקר עוברי 15% (v/v), 2 mM L-גלוטמין מצע, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ”ל סטרפטומיצין, 0.1 mM 2-מרקפטואתנול, גורם מעכב לוקמיה ו-t2i (0.2 μM PD0325901 ו-3 μM CHIR99021) השומר על פלוריפוטנטיות של ESC11) ב-37 °C עם 5% CO2 עד שה-ESC מגיע ל-50% עד 70% מפגש.הערה: אנו משתמשים בשלושה קווים שונים של ESC: JM8. A3 מ-B6N, V6.5 מ-B6-129 F1, ו-BALB/c ESC שפותחו בתוך החברה. אותם פרוטוקולי KI בכתב יד זה משמשים לכל קווי ESC. יש לשטוף את ה-ESC המתרבה עם 4 מ”ל של PBS, ולאחר מכן לטפל עם 800 μL של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. הוסף 1 מ”ל של ESCM כדי להשבית את הטריפסין ולנתק את תאי הגזע העובריים לתאים בודדים על ידי פיפטינג. צנטריפוגה של התמיסה המכילה ESC במשך 5 דקות ב 280 x גרם, להשליך את supernatant, להשעות ESCs ב 1 מ”ל טרי של ESCM, ולספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן. העבר 1 x 10 5 ESCs לצינור חדש1.5 מ”ל ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם, 4 °C. יש להשעות את גלולת ESC ב-12 μL של תערובת Cas9-RNP-DNA (שלב 3.3) ולערבב היטב על ידי פיפטה עדינה כדי למנוע מבעבעים. הגישו את ה-ESC המחודש לצורך אלקטרופורציה. מערכת האלקטרופורציה משתמשת בפעימה אחת ב-1,400 וולט וב-30 מילישניות עבור התמרת Cas9-RNP-DNA (איור 1). תרבית את תאי הגזע העובריים האלקטרופולטיביים בצלחת בקוטר 60 מ”מ המכילה 4 מ”ל של ESCM עם MEF מומת מיטוטית (סעיף 4.2). שנה את המדיום כל יום. לשטוף את תאי גזע עובריים עם 4 מ”ל של PBS 3 עד 5 ימים לאחר האלקטרופורציה, ולאחר מכן לטפל עם 800 μL של 0.25% טריפסין-EDTA ותרבית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות באינקובטור לח לעיכול. הוסף 2 מ”ל של ESCM כדי לעצור את עיכול הטריפסין וצנטריפוגה של תערובת התאים ב 280 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נטנט, החזירו את תאי הגזע העובריים ב-1 מ”ל של ESCM טרי, וספרו את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן. העבירו את תאי הגזע העובריים ב-1 x 103 תאי גזע עובריים לכל צלחת בקוטר 60 מ”מ המכילה ESCM ו-MEF מזין. החליפו את המדיום כל יום עד שהמושבה תתפוס.הערה: הסיבה לכך שה-ESC מועבר פעם אחת לפני האיסוף הייתה שעריכה גנומית עשויה להמשיך להתרחש לאחר חלוקת ESC, כך שהמושבה הראשונה אינה תמיד השיבוט במקרים רבים. לכן, המעבר הראשון של ESC לפני איסוף המושבה הוא צעד חיוני לאיסוף שיבוטים בודדים. 5. גנוטיפ PCR של תאי גזע עובריים ממוקדים שאפו ESCM מצלחת תרבות ESC 5 עד 7 ימים לאחר המעבר הראשון (שלב 4.9) והוסיפו 4 מ”ל של PBS. אסוף מושבות ESC בודדות עם 5 μL של PBS באמצעות פיפטה של 20 μL תחת סטריאומיקרוסקופ (הגדלה של 30x עד 40x). מניחים את המושבות הבודדות בבאר של צלחת 96 באר בעלת תחתית עגולה המכילה 15 μL של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25%. החזיקו את צלחת 96 הבארות על הקרח עד ש-48 מושבות בודדות ייאספו. דגרו את צלחת 96 הבאר במשך 5 דקות בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 , ולאחר מכן הוסיפו 80 μL של ESCM כדי להפסיק את עיכול הטריפסין ולנתק מושבות ESC לתאים בודדים על ידי פיפטציה.הערה: מכיוון שיעילות ה- KI של שיטה זו היא בדרך כלל 10%-50%, אנו קולטים באופן שגרתי 48 שיבוטים ומבצעים לראשונה גנוטיפ באמצעות 24 מהם. אם לא ניתן להשיג שיבוטים מרובים של KI בשלב זה, אנו ממשיכים לסנן עבור KI באמצעות 24 השיבוטים הנותרים. העבר 40 μL של מתלה ESC (שלב 5) לצלחת הזנה ללא ציפוי ג’לטין 96 באר המכילה 50 μL של ESCM לכל באר עבור גנוטיפ PCR. העבירו את 60 המיקרוליטרים הנותרים של מתלי ESC לבאר בלוח 24 בארות מצופה ג’לטין, המכיל 500 מיקרון ליטר של ESCM ו-MEF מזין, כדי ליצור את מלאי ה-ESC הקפוא. שיבוטים בודדים של ESC שגודלו בתרבית בצלחת 24 הבארות (שלב 5.3) עד שיגיעו למפגש של 60% עד 80%. שחזר שיבוטים בודדים של ESC על ידי טריפסיניזציה כאמור לעיל, אסוף תאים בצינור חדש של 1.5 מ”ל, וצנטריפוגה בגודל 280 x g למשך 5 דקות. יש להשליך את הסופר-נטנט, לתלות מחדש את התאים ב-500 μL של מדיום הקפאת תאים, ולהקפיא אותם באמצעות מקפיא עמוק של -80 מעלות צלזיוס. עבור גנוטיפ PCR, תרבית ESC משתבטת בצלחת נטולת ההזנה 96 היטב (שלב 5.3) עד שה-ESC מגיע ליותר מ-90% מפגש. הסר ESCM מכל באר על ידי שאיפה ושטוף פעמיים עם 100 μL של PBS. שאפו את ה-PBS והוסיפו 100 מיקרון של חיץ ליזיס המכיל פרוטאינאז K, ערבבו היטב והעבירו את ה-ESC לליזאט לצינור חדש של 1.5 מ”ל. מחממים את ליזאט ESC ב-65°C למשך שעה אחת לפחות באמצעות תא חום. חלץ וטהר את הדנ”א הגנומי באמצעות שיטת טיהור DNA פנול-כלורופורם קונבנציונלית ואחריה משקעי אתנול. ממיסים את הדנ”א המואץ ב-20 מיקרון של מים נטולי DNase וקובעים את הטוהר והריכוז של הדנ”א באמצעות ספקטרופוטומטר. בצע PCR גנומי באמצעות ערכות פריימרים ספציפיות ללוקוס כדי להגביר את אזור היעד. לאחר מכן, בדוק את הרצף ובחר את שיבוטי ESC עם רצפי ה- KI הרצויים. 6. הכנת עובר בשלב שמונה תאים ומיקרו-הזרקה של תאי גזע עובריים להזריק 5 IU של גונדוטרופין בסוסה הרה (PMSG) באופן תוך-צפקי לנקבות ICR בוגרות. לאחר 48 שעות, הזריקו 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) לאותן נקבות, ואז הזדווגו עם הנקבות שטופלו בהורמונים עם זכרי ה- ICR. בדוק את תקע copulatory בנרתיק למחרת (יום עוברי 0.5, ED0.5).הערה: כדי להעריך כימריזם לפי יחסי צבע הציפוי, השתמש בבלסטוציסט מזן ICR כנמען עבור ESC בעל רקע בצבע ציפוי שחור או אגוטי, או בבלסטוציסט מזן C57BL/6 כמושתל עבור ESC בעל רקע לבקן. אסוף את האובידוקט ב-ED1.5 והנח אותו בטיפות בינוניות חצובות HEPES (FHM). לשחזר את העוברים שלב שני תאים או ארבעה תאים על ידי שטיפת oviduct עם FHM באמצעות מחט שטיפה מוכנס לתוך infundibulum. שטפו את העוברים שנאספו על ידי העברתם למספר טיפות FHM טריות באמצעות פיפטה לפה. תרבית העוברים ב 50 μL של KSOM טיפה על צלחת תרבית תאים 35 מ”מ מכוסה שמן מינרלי ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אינקובטור במשך יום אחד עד שלב שמונה תאים או morula (ED2.5) הוא הגיע. אם לא נעשה שימוש בעוברים ביום האיסוף הבא, הקפיאו אותם על ידי ויטריפיקציה בהתאם לפרוטוקול CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html), ואחסנו אותם בחנקן נוזלי עד לשימוש. הכינו פיפטות זכוכית להחזקת העוברים (קוטר חיצוני 80-100 מיקרומטר) והזרקת ESC (קוטר של כ-13 מיקרומטר) באמצעות משיכה ומיקרופורג’. שלב פיפטה החזקה המכילה FHM לתוך מחזיק נימי המחובר למיקרו-אינז’קטור והוצב בצד שמאל של המיקרומניפולטור. חבר פיפטה הזרקה למיקרו-אינז’קטור אחר והגדר אותו בצד ימין. יישרו את שני הפיפטות ישר בשדה הראייה של המיקרוסקופ. יש לטפטף 5 טיפות מיקרו-ליטר של 12% (w/v) פוליוויניל פירולידון (PVP) ב-FHM בינוני ו-5 טיפות של 5 מיקרו-ל’ של FHM על אותו מכסה של צלחת בקוטר 60 מ”מ זו לצד זו ולכסות את הטיפות בשמן מינרלי. החזירו עוברים בטיפה FHM של 5 μL והוסיפו 1-5 μL של מתלה ESC לטיפת FHM המכילה עוברים.הערה: השאירו את מתלי ה-ESC וה-MEF למשך 30 דקות ב-ESM של 4 מ”ל על צלחת תרבית בקוטר 60 מ”מ לפני הכנת הנפילה. מאחר ש-MEFs נדבקים לתחתית מהר יותר מתאי גזע עובריים, הדגירה בת 30 הדקות הזו מאפשרת ריכוז של תאי ES לא מחוברים בסופר-נטנט. שטפו בתוך פיפטה ההזרקה עם PVP, ואז עברו לטיפה המכילה את העוברים ואת תאי הגזע העובריים. הרם שלושה כפילי ECS בודדים שזה עתה סיימו את חלוקת התאים שלהם (שישה תאים) בפיפטת ההזרקה. להחזיק עובר שלב שמונה תאים או מורולה, אשר השלים דחיסה, עם פיפטה החזקה על ידי שאיפה. לעשות חור ב zona pellucida עם פולס פיאזואלקטרי (עוצמה: 3; מהירות: 3). לגרש את ESC שישה תאים בתוך zona pellucida ולמשוך את פיפטה מתוך העוברים. שטפו את העוברים המוזרקים על ידי ESC עם מספר טיפות KSOM בעדינות באמצעות פיפטה בפה ודגרו אותם בטיפת KSOM חדשה של 50 μL המכוסה בשמן מינרלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עד שהעוברים מתפתחים לשלב הבלסטוציסט. מעבירים את 10 הבלסטוציסטים המוזרקים על ידי ESC לכל קרן רחם של נקבות עכברים מדומות (2.5 ימים לאחר הלידה, 20 בלסטוציסטים לכל ראש). לאחר שהאם הפונדקאית ילדה, בחר לפחות שתי כימרות זכריות עם יחס הכימריזם הגבוה ביותר (70% ומעלה כפי שאושר על ידי צבע הפרווה), ולאחר מכן הזדווג אותן עם נקבות זן מתאימות כדי לקבל F1 heterozygous KI. לגדל עכברי KI בודדים עם שותפים מתאימים כדי להשיג עכברים עם גנוטיפ(ים) רצויים או רקע גנטי המתאים למחקר.