CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Alle Mausversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Tokio (Zulassungsnummer PA17-63) und der Universität Osaka (Zulassungsnummer Biken-AP-H30-01) genehmigt und gemäß deren Richtlinien sowie den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) durchgeführt. 1. Targeting-Vektorkonstruktion Amplifizieren Sie eine KI-Kassette (CreERT hier, Template-DNA für die PCR stammt ursprünglich von einem kommerziellen Gensyntheseunternehmen) und ein ca. 1 kb großes Fragment von 5′- oder 3′-Homologiearmen mittels PCR. Für die DNA-Klonierung (Schritt 1.3) fügen Sie 15-mer-Überlappungssequenzen am 5′-Ende jedes PCR-Primers hinzu. Die PCR-DNA-Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, gefolgt von der Extraktion des DNA-Fragments mit einem DNA-Reinigungskit. Linearisieren Sie das Backbone-Plasmid (z. B. pUC19 oder pBS) mit einem geeigneten Restriktionsenzym, das irgendwo in der Multi-Klonierungsstelle für das Klonen eindeutig verdaut wird. Dann reinigen Sie das verdaute Plasmid mit einem DNA-Reinigungskit. Klonen Sie jedes PCR-Fragment (z. B. 5′-Homologiearm, 3′-Homologiearm) und KI-Sequenz gleichzeitig in das verdaute Plasmid mit einem DNA-Klonierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die kompetenten Zellen werden mit dem konstruierten Plasmid (Schritt 1.3) transformiert, indem sie 1 min lang in einem Wasserbad bei 42 °C erhitzt und dann auf einer LB-Platte mit der entsprechenden Konzentration an Antibiotika wie Ampicillin oder Kanamycin ausgesät werden. Kultivieren Sie sie über Nacht für resistente Klonelektionen. Nehmen Sie mehrere (vier bis acht) einzelne Kolonien mit 200 μL Pipettenspitzen auf und geben Sie die Spitzen in 3 ml flüssiges LB mit geeigneten Antibiotika (100 μg/ml Ampicillin oder 20 μL/ml Kanamycin) und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 °C unter Schütteln. Reinigen Sie das Plasmid am nächsten Tag mit einem endotoxinfreien kommerziellen Plasmidreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestätigen Sie die klonierte Sequenz im Plasmid durch Sanger-Sequenzierung. Stellen Sie die Plasmidkonzentration bei 1 μg DNA/μL mit nukleasefreiem Wasser ein. Verwenden Sie das Plasmid als Gen-Targeting-Vektor. 2. Vorbereitung des embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) als Feederzellen für ESC Opfern Sie 8-10 Wochen alte trächtige weibliche ICR-Mäuse (14,5 Tage nach dem Koitum) durch zervikale Dislokation. Wischen Sie den Bauch gut ab, indem Sie 70% (v / v) Ethanol für die Sterilisation verwenden, schneiden Sie den Bauch mit einer Orbitalschere und einer Pinzette ab und stellen Sie die fötushaltige Gebärmutter wieder her. Geben Sie die Gebärmutter in eine 100-mm-Schale, die 10 ml Phosphat-Rinderserum (PBS) enthält, das 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin enthält. Entfernen Sie die Plazenten und extraembryonalen Gewebe von den Föten mit einer Orbitalschere und einer Pinzette. Zerkleinern Sie die Föten mit einer Orbitalschere und übertragen Sie die PBS-Lösung, die die gehackten fötalen Zellen enthält, in ein 50 ml konisches Röhrchen. Bei 280 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen verwerfen. Fügen Sie 10 ml 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, mischen Sie gut durch Pipettieren und inkubieren Sie dann 10 min bei 37 °C mit einem Wasserbad für den Trypsinaufschluss. Fügen Sie 20 ml MEF-Medium hinzu (DMEM mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), um die enzymatische Reaktion zu stoppen, mischen Sie gut durch sanfte Inversion und zentrifugieren Sie bei 280 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand durch Aspiration, fügen Sie 10 ml MEF-Medium hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren. Säen Sie die Zellsuspension in mehrere neue 100-mm-Schalen (bereiten Sie die gleiche Anzahl von Schalen wie die Anzahl der Föten mit 10 ml MEF-Medium für eine 100-mm-Schale vor). Ändern Sie das Medium 4 bis 5 Stunden nach der Aussaat, um nicht befestigte Zellen zu entfernen und das angehängte MEF wachsen zu lassen. Durchqueren Sie die Zellen, wenn sie ~ 80% Konfluenz mit Trypsin erreichen. Legen Sie die Kulturschalen mit dem proliferierenden MEF in MEF-Medium, etwa 12-15 Tage nach der Aussaat, in ein Röntgenbestrahlungsgerät. Belichten Sie das MEF mit einer 50 Gy Röntgenaufnahme (insgesamt), um den Zellzyklus gemäß den Anweisungen des Herstellers anzuhalten. Trypsinisieren Sie das bestrahlte MEF durch Zugabe von 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA für eine 100-mm-Schale für 5 min bei 37 °C, fügen Sie dann 4 ml MEF-Medium hinzu, um die Trypsinverdauung zu stoppen, und sammeln Sie die Zellsuspension in einem neuen 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie das MEF mit einem frischen MEF-Medium durch Zentrifugieren bei 280 x g für 5 min bei 4 °C, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung und frieren Sie sie bei 1,6 x 106 Zellen/Röhrchen in einem Zellgefriermedium ein. Bis zur Verwendung aufbewahren; Zellen können über mehrere Jahre stabil in flüssigem Stickstoff gelagert werden. 3. Cas9-RNP-DNA-Mischungspräparat tracrRNA und crisprRNA werden durch Pipettieren in Verdünnungspuffer (jede RNA-Konzentration bei 200 μM) gelöst. Mischen Sie die tracrRNA-Lösung, die crisprRNA-Lösung und den Verdünnungspuffer (Volumenverhältnis bei 2:2:5) durch vorsichtiges Klopfen und Glühen jeder RNA mit einem Thermocycler bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 1 °C/min Stepdown-Zyklen, bis die Temperatur 4 °C erreicht.HINWEIS: Die gRNA-Sequenz wurde mit CRISPOR, http://crispor.tefor.net. Die geglühten RNAs, die 10 μg/μL Cas9-Nuklease und der Elektroporationspuffer werden in einem Volumenverhältnis von 5:3:2 bei 37 °C für 20 min inkubiert, um den Cas9-RNP-Komplex zu bilden. In der Routinearbeit mischen und inkubieren Sie 1,25 μL geglühte RNA, 0,75 μL Cas9-Nuklease und 0,5 μL des Elektroporationspuffers für die Genombearbeitung eines Locus. Mischen Sie die folgenden Materialien in einem 1,5-ml-Röhrchen: 10 μL Elektroporationspuffer, 1 μL Cas9-RNP-Komplex (Schritt 3.2) und 1 μL kreisförmiger Zielvektor (1 μg/μL, Schritt 1.6). Die Gesamtmenge der Cas9-RNP-DNA-Mischung beträgt 12 μL. Bewahren Sie die Cas9-RNP-DNA-Mischung bis zur Elektroporation auf Eis auf.HINWEIS: Um eine erneute Spaltung der gRNA nach KI zu verhindern, entwerfen Sie die gRNA an einer Position, an der die gRNA-Erkennungssequenz durch die Integration des KI-Donors aufgeteilt wird. Wenn die gRNA an einem solchen Ort nicht entworfen werden kann, werden mehrere nukleotidstille Mutationen, durch die sich die Aminosäuresequenz nicht verändert, in das Plasmid des KI-Donors aufgenommen. 4. Gen-Targeting von ES-Zellen Um die mit Gelatine überzogenen Zellkulturschalen vorzubereiten, fügen Sie 0,1% (w/v) Gelatinelösung bei 2 ml für eine 60-mm-Schale, 500 μL für eine 24-Well-Platte, 100 μL für eine 96-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie für 2 h in einem feuchten Inkubator. Entfernen Sie die Gelatinelösung, waschen Sie zweimal mit der gleichen Menge PBS und lagern Sie sie bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur. Mit einem 37 °C-Wasserbad 1 min mitotisch inaktivierte gefrorene MEF-Brühe (Schritt 2.2) auftauen und 1 Tag vor der ESC-Aussaat auf eine mit Gelatine beschichtete 60-mm-Schale legen (ein gefrorenes Brührohr MEF mit 1,6 x 106 Zellen für zwei 60-mm-Schalen, Schritt 2.2). Ein gefrorenes ESC-Vorratsröhrchen (gelagert bei 2 x 10 5 ESCs/Röhrchen; die Zellzählung wurde mit einem Zellzähler durchgeführt) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min auftauen und 1 x 105 ESCs auf eine 60 mm Schale mit vorgesätem MEF geben (Schritt 4.1). Kultur in 4 mL ESC-Kulturmedium (ESCM, DMEM-basiertes modifiziertes Medium mit 15% (v/v) fetalem Rinderserum, 2 mM L-Glutaminsubstrat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, Leukämie-Hemmfaktor und t2i (0,2 μM PD0325901 und 3 μM CHIR99021), das die Pluripotenz von ESC11) bei 37 °C mit 5%CO2 aufrechterhält, bis der ESC 50% bis 70% Konfluenz erreicht.HINWEIS: Wir verwenden drei verschiedene Linien von ESC: JM8. A3 aus B6N, V6.5 aus B6-129 F1 und Eigenentwicklung BALB/c ESC. Die gleichen KI-Protokolle in diesem Manuskript werden für alle ESC-Linien verwendet. Die Kultivierungs-ESC mit 4 ml PBS waschen und dann mit 800 μL 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung 5 min bei 37 °C zur Verdauung behandeln. Fügen Sie 1 ml ESCM hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und dissoziieren Sie die ES-Zellen durch Pipettieren in einzelne Zellen. Zentrifugieren Sie die ESC-haltige Lösung für 5 min bei 280 x g, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ES-Zellen in frischem 1 ml ESCM und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung. 1 x 10 5 ESCs in ein neues1,5 ml Röhrchen geben und dreimal mit PBS durch Zentrifugieren bei 500 x g, 4 °C waschen. Resuspendieren Sie das ESC-Pellet in 12 μL Cas9-RNP-DNA-Mischung (Schritt 3.3) und mischen Sie es gut durch vorsichtiges Pipettieren, um ein Sprudeln zu vermeiden. Dienen Sie dem resuspendierten ESC für die Elektroporation. Das Elektroporationssystem verwendet einen einzelnen Puls bei 1.400 V und 30 ms für die Cas9-RNP-DNA-Transduktion (Abbildung 1). Kultur der elektropolierten ESCs in einer 60-mm-Schale mit 4 ml ESCM mit mitotisch inaktiviertem MEF (Abschnitt 4.2). Wechseln Sie das Medium jeden Tag. Die ESCs 3 bis 5 Tage nach der Elektroporation mit 4 ml PBS waschen, dann mit 800 μL 0,25% Trypsin-EDTA behandeln und bei 37 °C für 5 min in einem feuchten Inkubator zur Verdauung kultivieren. Fügen Sie 2 ml ESCM hinzu, um den Trypsinverdau zu stoppen, und zentrifugieren Sie die Zellmischung bei 280 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die ES-Zellen in 1 ml frischem ESCM und zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung. Durchlassung der ESCs bei 1 x 103 ESCs pro 60 mm Schüssel mit ESCM und Feeder MEF. Wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Kolonie aufnimmt.HINWEIS: Der Grund, warum die ESC einmal vor der Aufnahme bestanden wird, war, dass die Genom-Editierung nach der ESC-Teilung weiterhin stattfinden kann, so dass die erste Kolonie in vielen Fällen nicht immer der Klon ist. Daher ist die erste Passage von ESC vor der Aufnahme der Kolonie ein wesentlicher Schritt, um einzelne Klone aufzunehmen. 5. PCR-Genotypisierung von Ziel-ES-Zellen ESCM 5 bis 7 Tage nach der ersten Passage (Schritt 4.9) aus der ESC-Kulturschale absaugen und 4 ml PBS hinzufügen. Nehmen Sie einzelne ESC-Kolonien mit 5 μL PBS mit einer 20-μL-Pipette unter einem Stereomikroskop (30-fache bis 40-fache Vergrößerung) auf. Legen Sie die einzelnen Kolonien in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden, die 15 μL 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung enthält. Halten Sie die 96-Well-Platte auf Eis, bis 48 einzelne Kolonien aufgenommen wurden. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte für 5 min in einem 37 °C feuchten 5%CO2-Inkubator , fügen Sie dann 80 μL ESCM hinzu, um den Trypsinverdau zu stoppen und ESC-Kolonien durch Pipettieren in einzelne Zellen zu dissoziieren.HINWEIS: Da die KI-Effizienz dieser Methode normalerweise 10%-50% beträgt, nehmen wir routinemäßig 48 Klone auf und führen zunächst eine Genotypisierung mit 24 von ihnen durch. Wenn zu diesem Zeitpunkt nicht mehrere KI-Klone erhalten werden können, suchen wir mit den verbleibenden 24 Klonen weiter nach KI. 40 μL ESC-Suspension (Schritt 5) werden zur PCR-Genotypisierung in eine mit Gelatine beschichtete, dosiererfreie 96-Well-Platte mit 50 μL ESCM pro Vertiefung überführt. Die restlichen 60 μL ESC-Suspension werden in eine Vertiefung in einer mit Gelatine beschichteten 24-Well-Platte überführt, die 500 μL ESCM und MEF enthält, um den gefrorenen ESC-Bestand herzustellen. Lagern Sie einzelne ESC-Klone, die in der 24-Well-Platte kultiviert werden (Schritt 5.3), bis sie eine Konfluenz von 60% bis 80% erreichen. Gewinnen Sie einzelne ESC-Klone durch Trypsinisierung, wie oben erwähnt, sammeln Sie Zellen in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 280 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL Zellgefriermedium und frieren Sie sie mit einer -80 °C Tiefkühltruhe ein. Für die PCR-Genotypisierung werden Kultur-ESC-Klone in der 96-Well-Feeder-freien Platte (Schritt 5.3) durchgeführt, bis die ESC eine Konfluenz von mehr als 90% erreicht. Entfernen Sie ESCM aus jeder Vertiefung durch Absaugen und waschen Sie zweimal mit 100 μL PBS. Das PBS absaugen und 100 μL Lysepuffer hinzufügen, der Proteinase K enthält, gut mischen und das ESC-Lysat in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen. Das ESC-Lysat wird in einer Wärmekammer mindestens 1 h lang bei 65 °C erhitzt. Extrahieren und reinigen Sie die genomische DNA mit einer herkömmlichen Phenol-Chloroform-DNA-Reinigungsmethode, gefolgt von Ethanolfällung. Die gefällte DNA wird in 20 μL DNasefreiem Wasser gelöst und die Reinheit und Konzentration der DNA mit einem Spektralphotometer bestimmt. Führen Sie genomische PCR mit locusspezifischen Primer-Sets durch, um die Zielregion zu amplifizieren. Überprüfen Sie dann die Sequenz und wählen Sie die ESC-Klone mit den gewünschten KI-Sequenzen aus. 6. Vorbereitung eines Embryos im Achtzellstadium und Mikroinjektion von ES-Zellen Injizieren Sie 5 IE Serumgonadotropin (PMSG) intraperitoneal in erwachsene ICR-Weibchen. Nach 48 Stunden injizieren Sie 5 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) in dieselben Weibchen und paaren Sie dann die hormonbehandelten Weibchen mit den ICR-Männern. Überprüfen Sie den Kopulationspfropfen in der Vagina am nächsten Tag (embryonaler Tag 0,5, ED0,5).HINWEIS: Um Chimärismus nach Fellfarbverhältnissen zu bewerten, verwenden Sie Blastozyste aus dem ICR-Stamm als Empfänger für einen ESC mit schwarzem oder agouti-Fellfarbhintergrund oder Blastozyste aus dem C57BL / 6-Stamm als Empfänger für einen ESC mit Albino-Hintergrund. Sammeln Sie den Eileiter bei ED1,5 und legen Sie ihn in HEPES-Puffermedium (FHM) Tropfen. Gewinnen Sie die zweizelligen oder vierzelligen Embryonen zurück, indem Sie den Eileiter mit FHM spülen, indem Sie eine in das Infundibulum eingeführte Spülnadel verwenden. Waschen Sie die gesammelten Embryonen, indem Sie sie mit einer Mundpipette in mehrere frische FHM-Tropfen geben. Kultur Die Embryonen in 50 μL KSOM tropfen auf eine 35 mm Zellkulturschale, die mit Mineralöl bedeckt ist, bei 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 1 Tag, bis das Achtzell- oder Morulastadium (ED2,5 ) erreicht ist. Wenn die Embryonen am nächsten Entnahmetag nicht verwendet werden, frieren Sie sie durch Vitrifikation gemäß dem CARD-Protokoll (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff. Glaspipetten für die Aufnahme der Embryonen (80-100 μm Außendurchmesser) und ESC-Injektion (ca. 13 μm Durchmesser) mit einem Abzieher und einer Mikroschmiede vorbereiten. Integrieren Sie eine Haltepipette, die FHM enthält, in einen Kapillarhalter, der mit einem Mikroinjektor verbunden ist und auf der linken Seite des Mikromanipulators aufgestellt ist. Schließen Sie eine Injektionspipette an einen anderen Mikroinjektor an und stellen Sie sie auf der rechten Seite auf. Richten Sie die beiden Pipetten gerade im Feld der Mikroskopansicht aus. Geben Sie 5 μL Tropfen 12% (w/v) Polyvinylpyrrolidon (PVP) in FHM-Medium und 5 μL Tropfen FHM nebeneinander auf den gleichen Deckel einer 60 mm Schale und bedecken Sie die Tropfen mit Mineralöl. Transferembryonen im 5 μL FHM-Tropfen und Zugabe von 1-5 μL der ESC-Suspension zum FHM-Tropfen, der Embryonen enthält.HINWEIS: Lassen Sie die ESC- und MEF-Suspension vor der Tropfenvorbereitung für 30 min in der 4 ml ESM auf 60mm Kulturschale. Da MEFs schneller am Boden haften als ES-Zellen, ermöglicht diese 30-minütige Inkubation die Konzentration von nicht anhaftenden ES-Zellen im Überstand. In der Injektionspipette mit PVP waschen und dann zu dem Tropfen wechseln, der die Embryonen und ES-Zellen enthält. Nehmen Sie drei einzelne ECS-Dubletten auf, die gerade ihre Zellteilung (sechs Zellen) in der Injektionspipette beendet haben. Halten Sie einen Embryo im Achtzell- oder Morulastadium, der die Verdichtung abgeschlossen hat, mit der Haltepipette durch Aspiration. Machen Sie ein Loch in die Zona pellucida mit einem piezoelektrischen Impuls (Intensität: 3; Geschwindigkeit: 3). Vertreiben Sie die sechszellige ESC in der Zona pellucida und ziehen Sie die Pipette aus den Embryonen. Die ESC-injizierten Embryonen mit mehreren KSOM-Tropfen vorsichtig mit einer Mundpipette waschen und in einem neuen 50 μL KSOM-Tropfen mit Mineralöl bedeckt bei 37 °C, 5%CO2 inkubieren, bis sich die Embryonen zum Blastozystenstadium entwickeln. Übertragen Sie die 10 ESC-injizierten Blastozysten in jedes Uterushorn pseudoschwangerer weiblicher Mäuse (2,5 Tage nach dem Koitum, 20 Blastozysten pro Kopf). Nachdem die Leihmutter geboren hat, wählen Sie mindestens zwei männliche Chimären mit dem höchsten Chimärismusverhältnis (70% oder höher, wie durch die Fellfarbe bestätigt) und paaren Sie sie dann mit geeigneten Stammweibchen, um F1 heterozygote KI zu erhalten. Züchten Sie einzelne KI-Mäuse mit geeigneten Partnern, um Mäuse mit wünschenswerten Genotypen oder genetischen Hintergründen zu erhalten, die für die Forschung geeignet sind.