Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Tokyo (numéro d’approbation PA17-63) et de l’Université d’Osaka (numéro d’approbation Biken-AP-H30-01) et réalisées conformément à leurs directives ainsi qu’aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org). 1. Ciblage de la construction vectorielle Amplifiez une cassette KI (CreERT ici, l’ADN modèle pour la PCR provient à l’origine d’une société commerciale de synthèse de gènes) et un fragment d’environ 1 ko de bras d’homologie 5′ ou 3′ par PCR. Pour le clonage de l’ADN (étape 1.3), ajoutez des séquences de chevauchement de 15 mères à l’extrémité 5′ de chaque amorce de PCR. Purifier les fragments d’ADN PCR par électrophorèse sur gel d’agarose, suivie de l’extraction du fragment d’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Linéariser le plasmide du squelette (p. ex. pUC19 ou pBS) à l’aide d’une ou de plusieurs enzymes de restriction appropriées qui digèrent de façon unique quelque part dans le site de clonage multiple pour le clonage. Ensuite, purifiez le plasmide digéré à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Cloner chaque fragment de PCR (p. ex., bras d’homologie 5′, bras d’homologie 3′) et séquence de KI simultanément dans le plasmide digéré à l’aide d’une trousse de clonage d’ADN conformément aux instructions du fabricant. Transformer les cellules compétentes à l’aide du plasmide construit (étape 1.3) en les chauffant à 42 °C pendant 1 min au bain-marie, puis les ensemencer sur une plaque LB contenant la concentration appropriée d’antibiotiques tels que l’ampicilline ou la kanamycine. Cultivez-les pendant la nuit pour des sélections de clones résistants. Prélever plusieurs colonies individuelles (quatre à huit) à l’aide d’embouts de pipette de 200 μL et transférer les embouts dans 3 mL de LB liquide contenant les antibiotiques appropriés (100 μg/mL d’ampicilline ou 20 μL/mL de kanamycine) et les cultiver pendant la nuit à 37 °C en agitant les gouttes de l’alcool. Purifier le plasmide le lendemain à l’aide d’une trousse de purification plasmidique commerciale de qualité sans endotoxines conformément aux instructions du fabricant. Confirmer la séquence clonée dans le plasmide par séquençage de Sanger. Ajuster la concentration plasmidique à 1 μg d’ADN/μL en utilisant de l’eau sans nucléase. Utilisez le plasmide comme vecteur de ciblage du gène. 2. Préparation du fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) en tant que cellules nourricières pour l’ESC Sacrifier des souris femelles ICR gravides âgées de 8 à 10 semaines (14,5 jours après le coït) par luxation cervicale. Essuyez bien l’abdomen en utilisant de l’éthanol à 70% (v / v) pour la stérilisation, coupez l’abdomen à l’aide de ciseaux orbitaux et de forceps, et récupérez l’utérus contenant le fœtus. Placer l’utérus dans une boîte de 100 mm contenant 10 mL de sérum bovin phosphaté (PBS) contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Retirer les placentas et les tissus extraembryonnaires des fœtus à l’aide de ciseaux orbitaires et de forceps. Hacher les fœtus à l’aide de ciseaux orbitaires et transférer la solution PBS contenant les cellules fœtales hachées dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 280 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant par aspiration. Ajouter 10 mL de solution trypsine-EDTA à 0,25 % (p/v), bien mélanger par pipetage, puis incuber pendant 10 min à 37 °C au bain-marie pour la digestion de la trypsine. Ajouter 20 mL de milieu MEF (DMEM contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) pour arrêter la réaction enzymatique, bien mélanger par inversion douce et centrifuger à 280 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par aspiration, ajouter 10 mL de milieu MEF et bien mélanger par pipetage. Ensemencer la suspension cellulaire dans plusieurs nouvelles boîtes de 100 mm (préparer le même nombre de plats que le nombre de fœtus avec 10 ml de milieu MEF pour une boîte de 100 mm). Changez le milieu 4 à 5 heures après l’ensemencement pour enlever les cellules non attachées et laissez le MEF attaché se développer. Passage des cellules lorsqu’elles atteignent ~80% de confluence en utilisant la trypsine. Placer les boîtes de culture contenant le MEF proliférant dans un milieu MEF, environ 12-15 jours après l’ensemencement, dans un dispositif d’irradiation par rayons X. Exposer le MEF avec une radiographie de 50 Gy (total) pour arrêter le cycle cellulaire conformément aux instructions du fabricant. Trypsiniser le MEF irradié en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25% pour une boîte de 100 mm pendant 5 min à 37 °C, puis ajouter 4 mL de milieu MEF pour arrêter la digestion de la trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 50 mL. Laver le MEF avec un milieu MEF frais par centrifugation à 280 x g pendant 5 min à 4 °C, compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration au bleu de trypan et les congeler à 1,6 x 106 cellules/tube dans un milieu de congélation cellulaire. Conserver jusqu’à utilisation; Les cellules peuvent être stockées de manière stable dans de l’azote liquide pendant plusieurs années. 3. Préparation du mélange Cas9-RNP-ADN Dissoudre l’ARNtrac et l’ARNcr dans un tampon de dilution (chaque concentration d’ARN à 200 μM) par pipetage. Mélanger la solution d’ARNtrac, la solution de crisprRNA et le tampon de dilution (rapport volumique à 2:2:5) en tapotant doucement et en recuisant chaque ARN à l’aide d’un thermocycleur à 95 °C pendant 10 minutes, suivi de cycles de réduction progressive de 1 °C/min jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.REMARQUE: La séquence d’ARNg a été conçue à l’aide de CRISPOR, http://crispor.tefor.net. Incuber les ARN recuits, 10 μg/μL de nucléase Cas9 et le tampon d’électroporation mélangés dans un rapport volumique de 5:3:2 à 37 °C pendant 20 min pour former le complexe Cas9-RNP. Dans le travail de routine, mélanger et incuber 1,25 μL d’ARN recuit, 0,75 μL de nucléase Cas9 et 0,5 μL de tampon d’électroporation pour une édition du génome du locus. Mélanger les matériaux suivants dans un tube de 1,5 mL : 10 μL de tampon d’électroporation, 1 μL de complexe Cas9-RNP (étape 3.2) et 1 μL de vecteur de ciblage circulaire (1 μg/μL, étape 1.6). La quantité totale de mélange Cas9-RNP-ADN est de 12 μL. Gardez le mélange Cas9-RNP-ADN sur la glace jusqu’à l’électroporation.REMARQUE: Pour éviter le reclivage de l’ARNg après KI, concevez l’ARNg dans une position où la séquence de reconnaissance de l’ARNg est divisée par l’intégration du donneur de KI. Si l’ARNg ne peut pas être conçu dans un tel endroit, plusieurs mutations silencieuses nucléotidiques, par lesquelles la séquence d’acides aminés ne change pas, sont incluses dans le plasmide du donneur de KI. 4. Ciblage génique des CES Pour préparer les boîtes de culture cellulaire enrobées de gélatine, ajouter une solution de gélatine à 0,1 % (p/v) à 2 mL pour une boîte de 60 mm, 500 μL pour une assiette de 24 puits, 100 μL pour une assiette de 96 puits, et incuber pendant 2 h dans un incubateur humide. Retirer la solution de gélatine, laver deux fois avec la même quantité de PBS et conserver à température ambiante jusqu’à utilisation. Décongeler le MEF congelé inactivé mitotiquement (étape 2.2) à l’aide d’un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et placer le MEF sur une capsule de 60 mm recouverte de gélatine (un tube de MEF congelé contenant 1,6 x 106 cellules pour deux boîtes de 60 mm, étape 2.2) 1 jour avant l’ensemencement de l’ESC. Décongeler un tube de stockage d’ESC congelé (stocké à 2 x 10 5 ESC/tube; le comptage des cellules a été effectué à l’aide d’un compteur de cellules) à l’aide d’un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et placer 1 x 105 CES sur une capsule de 60 mm contenant du MEF pré-ensemencé (étape 4.1). Culture dans un milieu de culture ESC de 4 mL (ESCM, milieu modifié à base de DMEM avec 15 % (v/v) de sérum fœtal bovin, substrat de L-glutamine 2 mM, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol, facteur inhibiteur de la leucémie, et t2i (0,2 μM PD0325901 et 3 μM CHIR99021) qui maintient la pluripotence de l’ESC11) à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que l’ESC atteigne 50 % à 70 % de confluence.REMARQUE: Nous utilisons trois lignes différentes d’ESC: JM8. A3 de B6N, V6.5 de B6-129 F1, et BALB/c ESC développé en interne. Les mêmes protocoles KI dans ce manuscrit sont utilisés pour toutes les lignes ESC. Laver l’ESC de culture avec 4 mL de PBS, puis traiter avec 800 μL de solution trypsine-EDTA à 0,25% pendant 5 min à 37 °C pour la digestion. Ajouter 1 mL d’ESCM pour inactiver la trypsine et dissocier les CSE en cellules individuelles par pipetage. Centrifuger la solution contenant l’ESC pendant 5 min à 280 x g, jeter le surnageant, remettre en suspension les CSE dans 1 mL frais d’ESCM et compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration au bleu trypan. Transférer 1 x 10 5 ESC dans un nouveau tube de1,5 mL et les laver trois fois avec du PBS par centrifugation à 500 x g, 4 °C. Resuspendre la pastille d’ESC dans 12 μL de mélange Cas9-RNP-ADN (étape 3.3) et bien mélanger par pipetage doux pour éviter les bulles. Servir l’ESC remis en suspension pour l’électroporation. Le système d’électroporation utilise une seule impulsion à 1 400 V et 30 ms pour la transduction Cas9-RNP-ADN (Figure 1). Culture des CSE électroporées dans une boîte de 60 mm contenant 4 mL d’ESCM avec MEF mitotiquement inactivé (section 4.2). Changez le support tous les jours. Laver les CSE avec 4 mL de PBS 3 à 5 jours après l’électroporation, puis traiter avec 800 μL de trypsine-EDTA à 0,25% et cultiver à 37 °C pendant 5 min dans un incubateur humide pour la digestion. Ajouter 2 mL d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine et centrifuger le mélange cellulaire à 280 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension les CSE dans 1 mL d’ESCM frais et compter la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleu trypan. Passage des ESC à 1 x 103 ESC par boîte de 60 mm contenant la MEC et le MEF d’alimentation. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que la colonie reprenne.REMARQUE: La raison pour laquelle l’ESC est passé une fois avant le prélèvement est que l’édition du génome peut continuer à se produire après la division de l’ESC, de sorte que la première colonie n’est pas toujours le clone dans de nombreux cas. Par conséquent, le premier passage de l’ESC avant le ramassage de la colonie est une étape essentielle pour ramasser des clones uniques. 5. Génotypage par PCR des CES ciblés Aspirer l’ESCM de la boîte de culture ESC 5 à 7 jours après le premier passage (étape 4.9) et ajouter 4 mL de PBS. Prélever des colonies d’ESC simples contenant 5 μL de PBS à l’aide d’une pipette de 20 μL au stéréomicroscope (grossissement de 30x à 40x). Placer les colonies individuelles dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 puits contenant 15 μL de solution trypsine-EDTA à 0,25 %. Gardez la plaque de 96 puits sur la glace jusqu’à ce que 48 colonies individuelles soient ramassées. Incuber la plaque de 96 puits pendant 5 minutes dans un incubateur humide à 5 % de CO2 à 37 °C, puis ajouter 80 μL d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine et dissocier les colonies d’ESC en cellules individuelles par pipetage.REMARQUE: Étant donné que l’efficacité KI de cette méthode est généralement de 10% à 50%, nous prenons régulièrement 48 clones et effectuons d’abord le génotypage en utilisant 24 d’entre eux. Si plusieurs clones de KI ne peuvent pas être obtenus à ce stade, nous poursuivons le dépistage du KI en utilisant les 24 clones restants. Transférer 40 μL de suspension d’ESC (étape 5) dans une plaque de 96 puits sans gélatine contenant 50 μL d’ESCM par puits pour le génotypage par PCR. Transférer les 60 μL restants de suspension d’ESC dans un puits dans une plaque de 24 puits recouverte de gélatine, qui contient 500 μL d’ESCM et de MEF d’alimentation, pour obtenir le stock d’ESC congelé. Stocker des clones d’ESC individuels cultivés dans la plaque de 24 puits (étape 5.3) jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 60 % à 80 %. Récupérer des clones d’ESC individuels par trypsinisation comme mentionné ci-dessus, recueillir des cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger à 280 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu de congélation cellulaire et les congeler à l’aide d’un congélateur à -80 °C. Pour le génotypage par PCR, cultiver des clones d’ESC dans la plaque sans alimentation à 96 puits (étape 5.3) jusqu’à ce que l’ESC atteigne plus de 90 % de confluence. Retirer l’ESCM de chaque puits par aspiration et laver deux fois avec 100 μL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter 100 μL de tampon de lyse contenant la protéinase K, bien mélanger et transférer le lysat d’ESC dans un nouveau tube de 1,5 mL. Chauffer le lysat de l’ESC à 65 °C pendant au moins 1 h à l’aide d’une chambre thermique. Extraire et purifier l’ADN génomique à l’aide d’une méthode conventionnelle de purification de l’ADN phénol-chloroforme suivie d’une précipitation à l’éthanol. Dissoudre l’ADN précipité dans 20 μL d’eau exempte de DNase et déterminer la pureté et la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Effectuer une PCR génomique à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques au locus pour amplifier la région cible. Ensuite, vérifiez la séquence et choisissez les clones ESC avec les séquences KI souhaitées. 6. Préparation d’embryons au stade huit cellules et micro-injection de CSE Injecter 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) par voie intrapéritonéale aux femelles adultes ICR. Après 48 h, injecter 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) aux mêmes femelles, puis accoupler les femelles traitées aux hormones avec les mâles ICR. Vérifiez le bouchon copulatoire dans le vagin le lendemain (jour embryonnaire 0,5, ED0,5).NOTE: Pour évaluer le chimérisme par rapport de couleur de la robe, utiliser le blastocyste de la souche ICR comme receveur pour un ESC qui a un fond de couleur de robe noir ou agouti, ou le blastocyste de la souche C57BL/6 comme receveur pour un ESC qui a le fond albinos. Recueillir l’oviducte à ED1.5 et le placer dans des gouttes de milieu tamponné HEPES (FHM). Récupérer les embryons au stade bicellulaire ou à quatre cellules en rinçant l’oviducte avec FHM à l’aide d’une aiguille de rinçage insérée dans l’infundibulum. Lavez les embryons prélevés en les déplaçant dans plusieurs gouttes fraîches de MHF à l’aide d’une pipette buccale. Culture des embryons dans 50 μL de KSOM tombent sur une boîte de culture cellulaire de 35 mm recouverte d’huile minérale à 37 °C, incubateur à 5% de CO2 pendant 1 jour jusqu’à ce que le stade de huit cellules ou morula (ED2.5) soit atteint. Si les embryons ne sont pas utilisés le jour de prélèvement suivant, les congeler par vitrification selon le protocole CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) et les conserver dans de l’azote liquide jusqu’à utilisation. Préparer des pipettes en verre pour contenir les embryons (diamètre extérieur de 80 à 100 μm) et l’injection d’ESC (diamètre d’environ 13 μm) à l’aide d’un extracteur et d’une microforge. Intégrez une pipette de maintien contenant FHM dans un support capillaire relié à un micro-injecteur et installé sur le côté gauche du micromanipulateur. Connectez une pipette d’injection à un autre micro-injecteur et installez-la sur le côté droit. Aligner les deux pipettes droites dans le champ de vision du microscope. Distribuer 5 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP) à 12 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP) dans un milieu HFM et 5 μL de gouttes de FHM sur le même couvercle d’une capsule de 60 mm côte à côte et couvrir les gouttes d’huile minérale. Transférer les embryons dans la goutte de MHF de 5 μL et ajouter 1 à 5 μL de la suspension d’ESC à la goutte de MHF qui contient des embryons.NOTA: Laisser la suspension ESC et MEF pendant 30 minutes dans la ESM de 4 ml sur une capsule de culture de 60 mm avant la préparation de la goutte. Étant donné que les MEF adhèrent au fond plus rapidement que les ESC, cette incubation de 30 minutes permet la concentration de cellules ES non attachées dans le surnageant. Laver à l’intérieur de la pipette d’injection avec du PVP, puis passer à la goutte contenant les embryons et les ESC. Prenez trois doublets ECS individuels qui viennent de terminer leur division cellulaire (six cellules) dans la pipette d’injection. Tenir un embryon de stade de huit cellules ou de morula, qui a terminé le compactage, avec la pipette de maintien par aspiration. Faites un trou dans la zone pellucide avec une impulsion piézoélectrique (intensité: 3; vitesse: 3). Expulser l’ESC à six cellules à l’intérieur de la zone pellucide et retirer la pipette des embryons. Lavez doucement les embryons injectés par l’ESC avec plusieurs gouttes de KSOM à l’aide d’une pipette buccale et incubez-les dans une nouvelle goutte KSOM de 50 μL recouverte d’huile minérale à 37 °C, 5% de CO2 jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade de blastocyste. Transférer les 10 blastocystes injectés par l’ESC dans chaque corne utérine de souris femelles pseudo-gravides (2,5 jours après le coït, 20 blastocystes par tête). Après l’accouchement de la mère porteuse, sélectionnez au moins deux chimères mâles présentant le rapport chiméristique le plus élevé (70% ou plus, comme confirmé par la couleur du pelage), puis accouplez-les avec des femelles souches appropriées pour obtenir un KI hétérozygote F1. Élever des souris KI individuelles avec des partenaires appropriés pour obtenir des souris ayant un ou plusieurs génotypes ou antécédents génétiques souhaitables adaptés à la recherche.