CRISPR/Cas9-опосредованный высокоэффективный нацеливание генов в эмбриональных стволовых клетках для разработки моделей мышей, манипулируемых генами

Все эксперименты на мышах были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Токийского университета (номер одобрения PA17-63) и Университетом Осаки (номер одобрения Biken-AP-H30-01) и выполнены в соответствии с их руководящими принципами, а также руководящими принципами ARRIVE (https://arriveguidelines.org). 1. Векторное построение таргетинга Амплифицируйте кассету KI (CreERT здесь, шаблон ДНК для ПЦР первоначально от коммерческой компании по синтезу генов) и приблизительный фрагмент 1 кб 5′- или 3′-гомологических рукавов с помощью ПЦР. Для клонирования ДНК (этап 1.3) добавьте 15-мерные перекрывающиеся последовательности на 5′ конце каждого праймера ПЦР. Очищают фрагменты ДНК ПЦР электрофорезом агарозного геля с последующим извлечением фрагмента ДНК с помощью набора для очистки ДНК. Линеаризуйте основную плазмиду (например, pUC19 или pBS) с помощью соответствующего фермента (ферментов) рестрикции, который уникально переваривает где-то в мультиклонирующем участке для клонирования. Затем очистите переваренную плазмиду с помощью набора для очистки ДНК. Клонирование каждого фрагмента ПЦР (например, 5′-гомологического плеча, 3′-гомологического плеча) и последовательности KI одновременно в переваренную плазмиду с использованием набора для клонирования ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Трансформируйте компетентные клетки с помощью построенной плазмиды (стадия 1.3) путем нагревания при 42 °C в течение 1 мин на водяной бане, затем посейте их на пластине LB, содержащей соответствующую концентрацию антибиотиков, таких как ампициллин или канамицин. Культивируйте их в течение ночи для устойчивого отбора клонов. Возьмите несколько (от четырех до восьми) отдельных колоний с помощью кончиков пипетки 200 мкл и перенесите наконечники в 3 мл жидкого LB, содержащего соответствующие антибиотики (100 мкг / мл ампициллина или 20 мкл / мл канамицина) и культивируйте на ночь при 37 ° C с встряхиванием. Очистите плазмиду на следующий день, используя коммерческий набор для очистки плазмид без эндотоксинов в соответствии с инструкциями производителя. Подтвердите клонированную последовательность в плазмиде с помощью секвенирования Сэнгера. Отрегулируйте концентрацию плазмиды при 1 мкг ДНК/мкл с помощью воды, не содержащей нуклеазы. Используйте плазмиду в качестве вектора нацеливания на гены. 2. Подготовка эмбрионального фибробласта мыши (MEF) в качестве питающих клеток для ESC Жертвоприношение 8-10-недельной беременной самки мышей ICR (14,5 дней после родов) при вывихе шейки матки. Хорошо протрите живот, используя 70% (v/v) этанол для стерилизации, разрезайте живот с помощью орбитальных ножниц и щипцов и восстановите матку, содержащую плод. Поместите матку в 100-миллиметровую посуду, содержащую 10 мл фосфатной бычьей сыворотки (PBS), содержащей 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Удалить плаценту и внеэмбрионарные ткани из плода с помощью орбитальных ножниц и щипцов. Измельчите плоды с помощью орбитальных ножниц и перенесите раствор PBS, содержащий измельченные клетки плода, в коническую трубку объемом 50 мл. Центрифугу при 280 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант путем аспирации. Добавьте 10 мл 0,25% (мас./об.) раствора трипсина-ЭДТА, хорошо перемешайте путем пипетки, а затем инкубируйте в течение 10 мин при 37 °C на водяной бане для переваривания трипсина. Добавьте 20 мл среды MEF (DMEM, содержащей 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), чтобы остановить ферментативную реакцию, хорошо перемешайте путем мягкой инверсии и центрифугируйте при 280 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант путем аспирации, добавьте 10 мл среды MEF и хорошо перемешайте путем пипетки. Засейте клеточную суспензию в несколько новых блюд по 100 мм (приготовьте такое же количество блюд, как и количество плодов с 10 мл среды MEF для одного блюда 100 мм). Измените среду через 4-5 ч после посева, чтобы удалить неприкрепленные клетки и дать прикрепленному MEF расти. Прохождение клеток, когда они достигают ~80% слияния с использованием трипсина. Поместите культуральную посуду, содержащую размножающийся MEF, в среду MEF, примерно через 12-15 дней после посева, в рентгеновское облучающее устройство. Подвергайте MEF рентгеновскому излучению 50 Гр (всего), чтобы остановить клеточный цикл в соответствии с инструкцией производителя. Трипсинизируют облученный MEF, добавляя 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА на одну тарелку 100 мм в течение 5 мин при 37 °C, затем добавляют 4 мл среды MEF, чтобы остановить переваривание трипсина и собирают клеточную суспензию в новую трубку 50 мл. Промыть MEF свежей средой MEF центрифугированием при 280 х г в течение 5 мин при 4 °C, подсчитать количество клеток с помощью счетчика клеток с трипановым синим окрашиванием и заморозить их при 1,6 х 106 клеток/трубке в среде для замораживания клеток. Хранить до использования; клетки могут стабильно храниться в жидком азоте в течение нескольких лет. 3. Приготовление смеси Cas9-RNP-ДНК Растворяют тракрРНК и крисперРНК в буфере разбавления (каждая концентрация РНК при 200 мкМ) путем пипетирования. Смешайте раствор тракрРНК, раствор крисперРНК и буфер разбавления (объемное соотношение 2:2:5) путем мягкого постукивания и отжига каждой РНК с помощью термоциклера при 95 °C в течение 10 мин с последующим циклом 1 °C / мин до тех пор, пока температура не достигнет 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность гРНК была разработана с использованием CRISPOR, http://crispor.tefor.net. Инкубируют отожженные РНК, 10 мкг/мкл cas9 нуклеазы, и электропорационный буфер смешивают в объемном соотношении 5:3:2 при 37 °C в течение 20 мин с образованием комплекса Cas9-RNP. В рутинной работе смешивают и инкубируют 1,25 мкл отожженной РНК, 0,75 мкл нуклеазы Cas9 и 0,5 мкл электропорационного буфера для редактирования генома одного локуса. Смешайте следующие материалы в трубке объемом 1,5 мл: 10 мкл электропорационного буфера, 1 мкл комплекса Cas9-RNP (стадия 3,2) и 1 мкл кругового вектора нацеливания (1 мкг/мкл, этап 1,6). Общее количество смеси Cas9-RNP-ДНК составляет 12 мкл. Держите смесь Cas9-RNP-ДНК на льду до электропорации.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить повторное расщепление гРНК после KI, спроектируйте гРНК в положении, когда последовательность распознавания гРНК разделяется интеграцией донора KI. Если гРНК не может быть спроектирована в таком месте, в плазмиду донора KI включается несколько нуклеотидных бесшумных мутаций, при которых аминокислотная последовательность не изменяется. 4. Генная таргетация ЭСК Для приготовления блюд для культивирования клеток, покрытых желатиновым покрытием, добавляют 0,1% (мас./об.) раствор желатина в 2 мл для чашки 60 мм, 500 мкл для 24-луночной пластины, 100 мкл для 96-луночной пластины и инкубируют в течение 2 ч во влажном инкубаторе. Удалите желатиновый раствор, дважды промойте с тем же количеством PBS и храните при комнатной температуре до использования. Разморозьте митотически инактивированный замороженный запас MEF (стадия 2.2) с использованием водяной бани 37 °C в течение 1 мин и поместите MEF на блюдо с желатиновым покрытием 60 мм (одна замороженная бульонная трубка MEF, содержащая 1,6 x 106 ячеек для двух блюд по 60 мм, стадия 2.2) за 1 день до посева ESC. Разморозьте замороженную трубку ESC (хранится при 2 x 105 ESC/трубке; подсчет клеток проводили с помощью счетчика клеток) с использованием водяной бани 37 °C в течение 1 мин и поместите 1 x 105 ESC на 60-миллиметровую чашку, содержащую предварительно засеянный MEF (этап 4.1). Культивирование в 4 мл питательной среды ESC (ESCM, модифицированная среда на основе DMEM с 15% (v/v) фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутаминового субстрата, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, ингибирующего лейкемии фактора и t2i (0,2 мкМ PD0325901 и 3 мкМ CHIR99021), которая поддерживает плюрипотентность ESC11) при 37 °C с 5% CO2 до тех пор, пока ESC не достигнет 50-70% конфюлюзии.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем три различные линии ESC: JM8. A3 от B6N, V6.5 от B6-129 F1 и собственная разработка BALB/c ESC. Одни и те же протоколы KI в этой рукописи используются для всех линий ESC. Культивирующий ЭСК промыть 4 мл ПБС, затем обработать 800 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C для пищеварения. Добавьте 1 мл ESCM для инактивации трипсина и диссоциации ESC к одиночным ячейкам путем пипетирования. Центрифугируйте ESC-содержащий раствор в течение 5 мин при 280 х г, выбросьте супернатант, повторно суспендируйте ЭСК в свежем 1 мл ESCM и подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток с окрашиванием трипановым синим цветом. Переложите 1 x 105 ESC в новую трубку объемом 1,5 мл и промыть их три раза PBS центрифугированием при 500 x g, 4 °C. Повторно суспендировать гранулу ESC в 12 мкл смеси Cas9-RNP-ДНК (стадия 3.3) и хорошо перемешать путем мягкого пипетирования, чтобы избежать пузырьков. Подавайте повторно суспендированный ESC для электропорации. Электропорационная система использует один импульс при 1 400 В и 30 мс для трансдукции Cas9-RNP-ДНК (рисунок 1). Культивируйте электропорированные ЭСК в 60 мм чашке, содержащей 4 мл ESCM, с митотически инактивированным MEF (раздел 4.2). Меняйте среду каждый день. Промыть ЭСК 4 мл PBS через 3-5 дней после электропорации, затем обработать 800 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА и культивировать при 37 °C в течение 5 мин во влажном инкубаторе для пищеварения. Добавьте 2 мл ESCM, чтобы остановить переваривание трипсина, и центрифугируйте клеточную смесь при 280 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, повторно суспендируйте ЭСК в 1 мл свежего ESCM и подсчитайте концентрацию клеток с помощью счетчика клеток с окрашиванием в синий цвет трипана. Проходите ESC со скоростью 1 x 103 ESC на 60 мм тарелку, содержащую ESCM и питатель MEF. Меняйте среду каждый день, пока колония не поднимется.ПРИМЕЧАНИЕ: Причина, по которой ESC передается один раз перед подбором, заключается в том, что редактирование генома может продолжаться после деления ESC, поэтому первая колония не всегда является клоном во многих случаях. Таким образом, первое прохождение ESC перед сбором колонии является важным шагом для сбора одиночных клонов. 5. Генотипирование ПЦР целевых ЭСК Аспирировать ESCM из чашки для культивирования ESC через 5-7 дней после первого прохождения (этап 4.9) и добавить 4 мл PBS. Соберите одиночные колонии ESC с 5 мкл PBS с помощью пипетки 20 мкл под стереомикроскопом (увеличение от 30 до 40 раз). Поместите отдельные колонии в лунку круглодонной 96-луночной пластины, содержащей 15 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Держите плиту из 96 скважин на льду до тех пор, пока не будут собраны 48 отдельных колоний. Инкубируют 96-луночную пластину в течение 5 мин во влажном 5%CO2 инкубаторе с температурой 37 °C, затем добавляют 80 мкл ESCM, чтобы остановить переваривание трипсина и диссоциировать колонии ESC на отдельные клетки путем пипетирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эффективность КИ этого метода обычно составляет 10%-50%, мы обычно берем 48 клонов и сначала выполняем генотипирование, используя 24 из них. Если на данный момент не удается получить несколько клонов KI, мы дополнительно проверяем KI, используя оставшиеся 24 клона. Перенесите 40 мкл суспензии ЭКУ (стадия 5) на 96-луночную пластину без желатинового покрытия, содержащую 50 мкл ESCM на скважину для генотипирования ПЦР. Переложите оставшиеся 60 мкл суспензии ЭКУ в скважину в 24-луночной пластине с желатиновым покрытием, которая содержит 500 мкл ESCM и питателя MEF, чтобы получить замороженный запас ЭКУ. Запасайте отдельные клоны ЭКУ, культивируемые в 24-луночной пластине (этап 5.3), пока они не достигнут 60-80% сливаемости. Восстанавливайте отдельные клоны ESC путем трипсинизации, как упоминалось выше, собирайте клетки в новую трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 280 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, повторно суспендируйте клетки в 500 мкл среды замораживания клеток и заморозьте их с помощью морозильной камеры с температурой -80 °C. Для генотипирования ПЦР культивирование клонов ЭКУ в 96-луночной пластине без питателя (этап 5.3) до тех пор, пока ЭКУ не достигнет более 90% слива. Удалите ESCM из каждой лунки путем аспирации и дважды промыть 100 мкл PBS. Аспирировать PBS и добавить 100 мкл лизисного буфера, содержащего протеиназу K, хорошо перемешать и перенести лизат ESC в новую трубку объемом 1,5 мл. Нагревайте лизат ЭКУ при 65°С в течение не менее 1 ч с помощью тепловой камеры. Извлеките и очистите геномную ДНК с использованием обычного метода очистки ДНК фенол-хлороформ с последующим осаждением этанола. Растворите осажденную ДНК в 20 мкл воды, не содержащей ДНКазы, и определите чистоту и концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Выполняйте геномную ПЦР с использованием локус-специфических наборов праймеров для амплификации целевой области. Затем проверьте последовательность и выберите клоны ESC с желаемыми последовательностями KI. 6. Подготовка эмбриона восьмиклеточной стадии и микроинъекция ЭСК Ввести 5 МЕ беременной кобыльей сывороточного гонадотропина (ПМСГ) внутрибрюшинно взрослым женщинам МЦР. Через 48 ч вводят 5 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) тем же самкам, а затем спаривают женщин, получавших гормоны, с самцами МЦР. Проверьте копуляторную пробку во влагалище на следующий день (эмбриональный день 0,5, ЭД0,5).ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки химеризма по соотношениям цветов шерсти используйте бластоцисту из штамма ICR в качестве реципиента для ЭКУ, который имеет черный или агути цвет шерсти, или бластоцисту из штамма C57BL/6 в качестве реципиента для ЭКУ, которая имеет фон альбиноса. Соберите яйцевод при ED1,5 и поместите его в капли буферной среды HEPES (FHM). Восстановите двухклеточные или четырехклеточные эмбрионы стадии, промыв яйцевод FHM с помощью промывочной иглы, вставленной в инфундибулу. Вымойте собранные эмбрионы, переместив их в несколько свежих капель FHM с помощью пипетки для рта. Культивируйте эмбрионы в 50 мкл KSOM каплей на 35 мм чашку для культивирования клеток, покрытую минеральным маслом при 37 °C, 5% CO2 инкубатора в течение 1 дня до достижения стадии восьмиклеточной или морулы (ED2,5). Если эмбрионы не используются на следующий день сбора, заморозьте их путем витрификации в соответствии с протоколом CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) и храните их в жидком азоте до использования. Подготовьте стеклянные пипетки для удержания эмбрионов (наружный диаметр 80-100 мкм) и инъекции ESC (диаметр около 13 мкм) с помощью съемника и микроклепки. Интегрируйте удерживающую пипетку, содержащую FHM, в капиллярный держатель, подключенный к микроинжектору и установленный с левой стороны микроманипулятора. Подключите инъекционную пипетку к другому микроинжектору и установите ее с правой стороны. Выровняйте две пипетки прямо в поле зрения микроскопа. Дозировать 5 мкл капель 12% (мас./об.) поливинилпирролидона (PVP) в среде FHM и 5 мкл капель FHM на ту же крышку 60-миллиметровой посуды бок о бок и накрыть капли минеральным маслом. Перенесите эмбрионы в капле FHM 5 мкл и добавьте 1-5 мкл суспензии ESC к капле FHM, содержащей эмбрионы.ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте суспензию ESC и MEF в течение 30 мин в 4 мл ESM на 60-миллиметровой чашке для культивирования перед приготовлением капли. Поскольку MEF прилипают ко дну быстрее, чем ESC, эта 30-минутная инкубация позволяет концентрацию неприсоединенных ES-клеток в супернатанте. Промыть внутри инъекционную пипетку с ПВП, затем перейти к капле, содержащей эмбрионы и ЭСК. Возьмите три отдельных дублета ECS, которые только что закончили свое деление клеток (шесть клеток) в инъекционной пипетке. Удерживайте восьмиклеточный или эмбрион стадии морулы, который завершил уплотнение, держа пипеткой путем аспирации. Сделайте отверстие в пеллюцидной зоне пьезоэлектрическим импульсом (интенсивность: 3; скорость: 3). Вытолкните шестиклеточный ESC внутрь зоны пеллюцида и вытащите пипетку из эмбрионов. Промыть эмбрионы, введенные ESC, несколькими каплями KSOM осторожно с помощью пипетки для рта и инкубировать их в новой капле KSOM объемом 50 мкл, покрытой минеральным маслом при 37 °C, 5% CO2 , пока эмбрионы не разовьются до стадии бластоцисты. Переведите 10 введенных ESC бластоцист в каждый маточный рог псевдобеременных самок мышей (2,5 дня после полового созревания, 20 бластоцист на голову). После того, как суррогатная мать родила, выберите по крайней мере двух мужских химер с самым высоким коэффициентом химеризма (70% или выше, что подтверждается цветом шерсти), а затем спаривайте их с соответствующим штаммом самок для получения гетерозиготного КИ F1. Разводите отдельных мышей KI с соответствующими партнерами, чтобы получить мышей с желательным генотипом (генотипами) или генетическим фоном, подходящим для исследований.