Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università di Tokyo (numero di approvazione PA17-63) e dell’Università di Osaka (numero di approvazione Biken-AP-H30-01) ed eseguiti secondo le loro linee guida e le linee guida ARRIVE (https://arriveguidelines.org). 1. Targeting della costruzione vettoriale Amplificare una cassetta KI (CreERT qui, il DNA modello per la PCR è originario di una società commerciale di sintesi genica) e un frammento approssimativo di 1 kb di bracci di omologia 5′ o 3′ mediante PCR. Per il clonaggio del DNA (fase 1.3), aggiungere sequenze di sovrapposizione 15-mer all’estremità 5′ di ciascun primer PCR. Purificare i frammenti di DNA PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio, seguita dall’estrazione del frammento di DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA. Linearizzare il plasmide della spina dorsale (ad esempio, pUC19 o pBS) utilizzando un enzima di restrizione appropriato che digerisce in modo univoco da qualche parte nel sito multi-clonazione per la clonazione. Quindi, purificare il plasmide digerito utilizzando un kit di purificazione del DNA. Clonare ogni frammento di PCR (ad esempio, braccio di omologia 5′, braccio di omologia 3′) e sequenza KI simultaneamente nel plasmide digerito utilizzando un kit di clonazione del DNA secondo le istruzioni del produttore. Trasformare le cellule competenti utilizzando il plasmide costruito (fase 1.3) riscaldando a 42 °C per 1 minuto a bagnomaria, quindi seminarle su una piastra LB contenente la concentrazione appropriata di antibiotici come ampicillina o kanamicina. Coltivali durante la notte per selezioni clone resistenti. Prelevare diverse (da quattro a otto) singole colonie utilizzando punte per pipette da 200 μL e trasferire le punte in 3 ml di LB liquido contenente antibiotici appropriati (100 μg/mL di ampicillina o 20 μL/mL di kanamicina) e coltura per una notte a 37 °C agitando. Purificare il plasmide il giorno seguente utilizzando un kit di purificazione del plasmide commerciale privo di endotossine secondo le istruzioni del produttore. Confermare la sequenza clonata nel plasmide mediante sequenziamento Sanger. Regolare la concentrazione del plasmide a 1 μg di DNA/μL utilizzando acqua priva di nucleasi. Utilizzare il plasmide come vettore di targeting genico. 2. Preparazione del fibroblasto embrionale di topo (MEF) come cellule feeder per ESC Sacrificare topi femmina ICR incinta di 8-10 settimane (14,5 giorni dopo il coito) mediante lussazione cervicale. Pulire bene l’addome utilizzando etanolo al 70% (v / v) per la sterilizzazione, tagliare l’addome con forbici orbitali e pinze e recuperare l’utero contenente il feto. Introdurre l’utero in un piatto da 100 mm contenente 10 ml di siero bovino fosfato (PBS) contenente 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Rimuovere la placenta e i tessuti extraembrionali dai feti usando forbici orbitali e pinze. Tritare i feti usando le forbici orbitali e trasferire la soluzione PBS contenente le cellule fetali tritate in un tubo conico da 50 ml. Centrifugare a 280 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante mediante aspirazione. Aggiungere 10 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% (p/v), mescolare bene mediante pipettaggio e quindi incubare per 10 minuti a 37 °C a bagnomaria per la digestione della tripsina. Aggiungere 20 mL di terreno MEF (DMEM contenente il 10% (v/v) siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) per arrestare la reazione enzimatica, mescolare bene per inversione delicata e centrifugare a 280 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante mediante aspirazione, aggiungere 10 ml di terreno MEF e mescolare bene mediante pipettaggio. Seminare la sospensione cellulare in diversi nuovi piatti da 100 mm (preparare lo stesso numero di piatti del numero di feti con 10 ml di terreno MEF per un piatto da 100 mm). Cambiare il terreno da 4 a 5 ore dopo la semina per rimuovere le cellule non attaccate e lasciare crescere il MEF attaccato. Passare le cellule quando raggiungono ~ 80% di confluenza usando tripsina. Porre le piastre di coltura contenenti il MEF proliferante in mezzo MEF, circa 12-15 giorni dopo la semina, in un dispositivo irradiante a raggi X. Esporre il MEF con una radiografia da 50 Gy (totale) per arrestare il ciclo cellulare secondo le istruzioni del produttore. Tripsinizzare il MEF irradiato aggiungendo 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% per un piatto da 100 mm per 5 minuti a 37 °C, quindi aggiungere 4 mL di terreno MEF per interrompere la digestione della tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in una nuova provetta da 50 ml. Lavare il MEF con un mezzo MEF fresco mediante centrifugazione a 280 x g per 5 minuti a 4 °C, contare il numero di cellule utilizzando un contatore di celle con colorazione blu tripano e congelarle a 1,6 x 106 celle/tubo in un mezzo di congelamento cellulare. Conservare fino all’uso; Le cellule possono essere immagazzinate stabilmente in azoto liquido per diversi anni. 3. Preparazione della miscela Cas9-RNP-DNA Sciogliere il tracrRNA e l’RNA crisprRNA nel tampone di diluizione (ogni concentrazione di RNA a 200 μM) mediante pipettaggio. Mescolare la soluzione di tracrRNA, la soluzione di crisprRNA e il tampone di diluizione (rapporto di volume a 2:2:5) picchiettando delicatamente e ricottura ogni RNA usando un termociclatore a 95 °C per 10 minuti seguito da cicli stepdown di 1 °C/min fino a quando la temperatura raggiunge i 4 °C.NOTA: La sequenza di gRNA è stata progettata utilizzando CRISPOR, http://crispor.tefor.net. Incubare gli RNA ricotti, la nucleasi Cas9 da 10 μg/μL e il tampone di elettroporazione miscelati in un rapporto di volume di 5:3:2 a 37 °C per 20 minuti per formare il complesso Cas9-RNP. Nel lavoro di routine, mescolare e incubare 1,25 μL di RNA ricotto, 0,75 μL di nucleasi Cas9 e 0,5 μL del tampone di elettroporazione per l’editing del genoma di un locus. Mescolare i seguenti materiali in una provetta da 1,5 ml: 10 μL di tampone per elettroporazione, 1 μL di complesso Cas9-RNP (fase 3.2) e 1 μL di vettore di targeting circolare (1 μg/μL, fase 1.6). La quantità totale di miscela Cas9-RNP-DNA è di 12 μL. Mantenere la miscela Cas9-RNP-DNA su ghiaccio fino all’elettroporazione.NOTA: Per prevenire la ri-scissione del gRNA dopo KI, progettare il gRNA in una posizione in cui la sequenza di riconoscimento del gRNA è divisa dall’integrazione del donatore KI. Se il gRNA non può essere progettato in tale posizione, diverse mutazioni nucleotidiche silenti, mediante le quali la sequenza amminoacidica non cambia, sono incluse nel plasmide del donatore KI. 4. Targeting genico delle ESC Per preparare le piastre di coltura cellulare rivestite di gelatina, aggiungere una soluzione di gelatina allo 0,1% (p/v) a 2 ml per un piatto da 60 mm, 500 μL per una piastra da 24 pozzetti, 100 μL per una piastra da 96 pozzetti e incubare per 2 ore in un incubatore umido. Rimuovere la soluzione di gelatina, lavare due volte con la stessa quantità di PBS e conservare a temperatura ambiente fino all’uso. Scongelare il materiale MEF congelato mitoticamente inattivato (fase 2.2) utilizzando un bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e posizionare il MEF su un piatto da 60 mm rivestito di gelatina (un tubo congelato di MEF contenente 1,6 x 106 celle per due piatti da 60 mm, fase 2.2) 1 giorno prima della semina ESC. Scongelare una provetta ESC congelata (conservata a 2 x 10 5 ESC/tubo; il conteggio delle cellule è stato effettuato utilizzando un contatore di celle) utilizzando un bagnomaria a 37 °C per 1 minuto e posizionare 1 x 105 ESC su un piatto da 60 mm contenente MEF preseminato (fase 4.1). Coltura in terreno di coltura ESC da 4 mL (ESCM, terreno modificato a base di DMEM con siero fetale bovino al 15% (v/v), substrato di L-glutammina 2 mM, penicillina 100 U/mL, streptomicina da 100 μg/ml, 0,1 mM di 2-mercaptoetanolo, fattore inibitorio della leucemia e t2i (0,2 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021) che mantiene la pluripotenza dell’ESC11) a 37 °C con CO2 al 5% fino a quando l’ESC raggiunge il 50-70% di confluenza.NOTA: Utilizziamo tre diverse linee di ESC: JM8. A3 da B6N, V6.5 da B6-129 F1 e BALB/c ESC sviluppato internamente. Gli stessi protocolli KI in questo manoscritto sono usati per tutte le linee ESC. Lavare l’ESC colturale con 4 ml di PBS, quindi trattare con 800 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% per 5 minuti a 37 °C per la digestione. Aggiungere 1 mL di ESCM per inattivare la tripsina e dissociare le ESC in singole cellule mediante pipettaggio. Centrifugare la soluzione contenente ESC per 5 minuti a 280 x g, eliminare il surnatante, risospendere le ESC in 1 mL fresco di ESCM e contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule con colorazione blu tripano. Trasferire 1 x 10 5 ESC in una nuova provetta da1,5 mL e lavarle tre volte con PBS mediante centrifugazione a 500 x g, 4 °C. Risospendere il pellet ESC in 12 μL di miscela Cas9-RNP-DNA (fase 3.3) e mescolare bene mediante pipettaggio delicato per evitare il gorgogliamento. Servire l’ESC risospeso per l’elettroporazione. Il sistema di elettroporazione utilizza un singolo impulso a 1.400 V e 30 ms per la trasduzione Cas9-RNP-DNA (Figura 1). Coltura delle ESC elettroporate in un piatto da 60 mm contenente 4 ml di ESCM con MEF inattivato mitoticamente (paragrafo 4.2). Cambia il mezzo ogni giorno. Lavare le ESC con 4 mL di PBS da 3 a 5 giorni dopo l’elettroporazione, quindi trattare con 800 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% e coltivare a 37 °C per 5 minuti in un incubatore umido per la digestione. Aggiungere 2 ml di ESCM per interrompere la digestione della tripsina e centrifugare la miscela cellulare a 280 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, risospendere le ESC in 1 mL di ESCM fresco e contare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare con colorazione blu tripano. Far passare gli ESC a 1 x 103 ESC per piatto da 60 mm contenente ESCM e MEF alimentatore. Cambia il mezzo ogni giorno fino a quando la colonia non riprende.NOTA: Il motivo per cui l’ESC viene superato una volta prima del prelievo è che l’editing del genoma può continuare a verificarsi dopo la divisione ESC, quindi la prima colonia non è sempre il clone in molti casi. Pertanto, il primo passaggio dell’ESC prima del prelievo della colonia è un passo essenziale per raccogliere singoli cloni. 5. Genotipizzazione PCR di ESC mirate Aspirare ESCM dal piatto di coltura ESC da 5 a 7 giorni dopo il primo passaggio (fase 4.9) e aggiungere 4 ml di PBS. Prelevare singole colonie ESC con 5 μL di PBS utilizzando una pipetta da 20 μL sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento da 30x a 40x). Porre le singole colonie in un pozzetto di una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti contenente 15 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%. Tenere la piastra da 96 pozzetti sul ghiaccio fino a quando non vengono raccolte 48 singole colonie. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti in un incubatore umido al 5% di CO2 a 37 °C, quindi aggiungere 80 μL di ESCM per interrompere la digestione della tripsina e dissociare le colonie di ESC in singole cellule mediante pipettaggio.NOTA: Poiché l’efficienza KI di questo metodo è di solito del 10% -50%, raccogliamo regolarmente 48 cloni e prima eseguiamo la genotipizzazione utilizzandone 24. Se non è possibile ottenere più cloni KI a questo punto, esaminiamo ulteriormente KI utilizzando i restanti 24 cloni. Trasferire 40 μL di sospensione ESC (fase 5) in una piastra a 96 pozzetti priva di gelatina contenente 50 μL di ESCM per pozzetto per genotipizzazione PCR. Trasferire i restanti 60 μL di sospensione ESC in un pozzetto in una piastra da 24 pozzetti rivestita di gelatina, che contiene 500 μL di ESCM e MEF di alimentazione, per ottenere lo stock ESC congelato. Immagazzinare i singoli cloni ESC coltivati nella piastra a 24 pozzetti (fase 5.3) fino a raggiungere il 60-80% di confluenza. Recuperare singoli cloni ESC mediante tripsinizzazione come menzionato sopra, raccogliere le cellule in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 280 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in 500 μL di mezzo di congelamento cellulare e congelarle utilizzando un congelatore profondo a -80 °C. Per la genotipizzazione PCR, l’ESC in coltura clona nella piastra priva di alimentatore a 96 pozzetti (fase 5.3) fino a quando l’ESC raggiunge una confluenza superiore al 90%. Rimuovere l’ESCM da ciascun pozzetto mediante aspirazione e lavare due volte con 100 μL di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 100 μL di tampone di lisi contenente proteinasi K, mescolare bene e trasferire il lisato ESC in un nuovo tubo da 1,5 ml. Riscaldare il lisato ESC a 65 °C per almeno 1 ora utilizzando una camera termica. Estrarre e purificare il DNA genomico utilizzando un metodo convenzionale di purificazione del DNA fenolo-cloroformio seguito dalla precipitazione dell’etanolo. Sciogliere il DNA precipitato in 20 μL di acqua priva di DNasi e determinare la purezza e la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Eseguire la PCR genomica utilizzando set di primer specifici per il locus per amplificare la regione target. Quindi, controlla la sequenza e scegli i cloni ESC con le sequenze KI desiderate. 6. Preparazione dell’embrione allo stadio di otto cellule e microiniezione di ESC Iniettare 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) per via intraperitoneale in femmine adulte di ICR. Dopo 48 ore, iniettare 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) nelle stesse femmine, quindi accoppiare le femmine trattate con ormoni con i maschi ICR. Controllare il tappo copulatore nella vagina il giorno seguente (giorno embrionale 0,5, ED0,5).NOTA: Per valutare il chimerismo in base ai rapporti di colore del mantello, utilizzare la blastocisti del ceppo ICR come destinatario per un ESC che ha uno sfondo nero o agouti del colore del mantello, o la blastocisti del ceppo C57BL / 6 come destinatario per un ESC che ha lo sfondo albino. Raccogliere l’ovidotto a ED1.5 e posizionarlo in gocce di mezzo tamponato HEPES (FHM). Recuperare gli embrioni a due o quattro cellule lavando l’ovidotto con FHM usando un ago di lavaggio inserito nell’infundibulum. Lavare gli embrioni raccolti spostandoli in diverse gocce fresche di FHM usando una pipetta orale. Coltura gli embrioni in 50 μL di KSOM cadono su una capsula di coltura cellulare di 35 mm coperta con olio minerale a 37 °C, incubatore al 5% di CO2 per 1 giorno fino al raggiungimento dello stadio di otto cellule o morula (ED2.5). Se gli embrioni non vengono utilizzati il giorno successivo della raccolta, congelarli mediante vitrificazione secondo il protocollo CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) e conservarli in azoto liquido fino all’uso. Preparare pipette di vetro per contenere gli embrioni (diametro esterno 80-100 μm) e iniezione ESC (diametro circa 13 μm) utilizzando un estrattore e una microforgiatura. Integrare una pipetta di contenimento contenente FHM in un supporto capillare collegato a un microiniettore e posizionato sul lato sinistro del micromanipolatore. Collegare una pipetta di iniezione a un altro microiniettore e posizionarla sul lato destro. Allineare le due pipette dritte nel campo visivo del microscopio. Erogare 5 μL di gocce di polivinilpirrolidone (PVP) al 12% (p/v) in mezzo FHM e 5 μL di gocce di FHM sullo stesso coperchio di una capsula da 60 mm affiancate e coprire le gocce con olio minerale. Trasferire gli embrioni nella goccia di 5 μL di FHM e aggiungere 1-5 μL della sospensione ESC alla goccia di FHM che contiene embrioni.NOTA: Lasciare la sospensione ESC e MEF per 30 minuti nel piatto di coltura da 4 mL ESM su un piatto di coltura da 60 mm prima della preparazione della goccia. Poiché i MEF si attaccano al fondo più velocemente degli ESC, questa incubazione di 30 minuti consente la concentrazione di cellule ES non attaccate nel surnatante. Lavare all’interno della pipetta di iniezione con PVP, quindi passare alla goccia contenente gli embrioni e le ESC. Prelevare tre doppiette ECS individuali che hanno appena terminato la loro divisione cellulare (sei celle) nella pipetta di iniezione. Tenere un embrione a otto cellule o allo stadio di morula, che ha completato la compattazione, con la pipetta di mantenimento per aspirazione. Fare un buco nella zona pellucida con un impulso piezoelettrico (intensità: 3; velocità: 3). Espellere l’ESC a sei cellule all’interno della zona pellucida ed estrarre la pipetta dagli embrioni. Lavare delicatamente gli embrioni iniettati con ESC con diverse gocce di KSOM utilizzando una pipetta orale e incubarli in una nuova goccia di KSOM da 50 μL coperta di olio minerale a 37 °C, 5% di CO2 fino a quando gli embrioni non si sviluppano fino allo stadio di blastocisti. Trasferire le 10 blastocisti iniettate ESC in ciascun corno uterino di topi femmina pseudogravidi (2,5 giorni dopo il coito, 20 blastocisti per capo). Dopo che la madre surrogata ha partorito, selezionare almeno due chimere maschili con il più alto rapporto di chimerismo (70% o superiore come confermato dal colore del mantello), e quindi accoppiarli con femmine di ceppo appropriato per ottenere KI eterozigote F1. Allevare singoli topi KI con partner appropriati per ottenere topi con genotipi desiderabili o background genetici adatti alla ricerca.